Spécialement conçu à base de laser appareils de chauffage à libération déclenchée de cisplatine de thermosensible liposomes avec guidage par l'image par résonance magnétique

Résumé

Un appareil de chauffage à base de laser compatible avec l'IRM conçu sur mesure a été conçu pour fournir un chauffage local de tumeurs sous-cutanées afin d'activer la libération d'agents de liposomes thermosensibles spécifiquement à la région de la tumeur.

Résumé

Les liposomes ont été utilisés comme systèmes de délivrance de médicament à cibler les tumeurs solides à travers l'exploitation de la perméabilité accrue et la rétention (EPR) en produisant une réduction significative de la toxicité systémique. Néanmoins, la libération insuffisante de médicament encapsulé des liposomes a limité leur efficacité clinique. Liposomes sensibles à la température ont été conçus pour fournir une libération spécifique au site de médicament afin de surmonter le problème de la tumeur limitée biodisponibilité du médicament. Notre laboratoire a conçu et développé une formulation de liposome thermosensible activé par la chaleur du cisplatine (CDDP), connu sous le nom HTLC, pour fournir une libération déclenchée de CDDP à tumeurs solides. Livraison activé par la chaleur a été réalisée in vivo dans des modèles murins en utilisant un appareil de chauffage au laser sur mesure qui fournit un motif de chauffage conforme au site de la tumeur comme confirmé par M. thermométrie (MRT). Dispositif de surveillance de température à fibre optique a été utilisé pour mesurer la température en temps réelau cours de la période de chauffage en ligne avec réglage de la fourniture de chaleur par une alternance de la puissance du laser. La livraison du médicament a été optimisée en cas de résonance magnétique (MR) d'image orientation par co-encapsulation d'un agent de contraste pour MR (c.-à-gadotéridol) avec CDDP dans les liposomes thermosensibles comme un moyen pour valider le protocole de chauffage et d'évaluer l'accumulation de tumeur. Le protocole de chauffage est composée d'une période de préchauffage de 5 minutes avant l'administration de HTLC et 20 min de chauffage de post-injection. Ce protocole de chauffage conduit à la libération efficace des agents encapsulés avec le plus grand changement de signal de résonance MR observée dans la tumeur chauffée par rapport à la tumeur non chauffé et le muscle. Cette étude a démontré l'application réussie de l'appareil de chauffage à base de laser pour le développement de liposomes thermosensibles préclinique et l'importance de validation guidée par RM du protocole de chauffage pour l'optimisation de délivrance de médicament.

Introduction

La physiopathologie de tumeurs solides résultats de la perméabilité et de rétention amélioré (EPR) des systèmes à l'échelle nanométrique. Cela a conduit au développement de nombreux systèmes de délivrance de médicaments qui tirent parti de cet effet de cibler le tissu tumoral tout en minimisant les effets secondaires systémiques ^1. Technologies de livraison de liposomale ont été largement étudiés pour la drogue ou d'imagerie des sondes ^2. Bien que les liposomes ont considérablement réduit la toxicité systémique par rapport à la chimiothérapie conventionnelle, il ya eu quelques améliorations dans l'efficacité clinique ^3,4. Des études ont montré que l'efficacité est limitée en raison d'un manque de libération du médicament à partir du support ^4,5. En conséquence, le développement de liposomes qui sont activés pour libérer le médicament encapsulé en réponse à des stimuli externes a attiré une attention considérable. L'hyperthermie a été utilisé pendant des décennies comme une modalité de traitement relativement sûr pour les patients atteints de cancer ^6. Par conséquent, le développementment de liposomes thermosensibles avec la chaleur comme un déclencheur externe a été une combinaison logique avec un potentiel important pour la traduction clinique. En effet, la formulation thermosensible de liposomes contenant de lysolipide-de doxorubicine, connu sous le nom LTSL-DOX, a maintenant atteint évaluation clinique ^7.

Des données cliniques récentes avec LTSL-DOX a montré que le protocole pour la distribution de chaleur est un facteur critique qui peut fortement influencer les résultats des patients ^8. Chez les humains, radiofréquences, micro-ondes, laser et ultrasons transducteurs sont utilisés pour appliquer hyperthermie localement à des sites tumoraux ^9. Dans les études précliniques nécessitant le chauffage de tumeurs sous-cutanées, les cathéters de chauffage ^10,11 et ^12,13 bains d'eau sont le plus souvent utilisés. Dans ce manuscrit, nous introduisons une nouvelle méthode pour le chauffage de tumeurs sous-cutanées en utilisant une installation de chauffage conçu sur mesure à base de laser, ce qui permet un chauffage plus conforme de volume de la tumeur. Utiliser ma compatibles M.maté-, la configuration est assez petit pour tenir dans le trou d'un petit animal M. imageur, permettant suivi en temps réel de l'évolution de la température des tissus pendant le chauffage laser.

L'agent MR de contraste, gadotéridol (Gd-HP-DO3A), a été co-encapsulé avec CDDP dans une formulation de liposome thermosensible du CDDP (HTLC), connu sous le nom Gd-HTLC, en temps réel MR suivi et l'évaluation de la chaleur guidée par l'image libération du médicament et activé par validation du protocole de chauffage. Nos résultats démontrent que l'appareil de chauffage à base de laser activé efficacement la libération d'agents encapsulés de la formulation Gd-HTLC tout en étant suivis par IRM.

Protocole

1. Préparation de liposomes

1. Dissoudre les lipides de 1,2-sn-glycéro-Dipalmitoyl- 3-phosphocholine (DPPC), 1-stéaroyl-2-hydroxy-sn-glycéro-3-phosphatidylcholine (MSPC ou S-lyso-PC) et de N - (carbonyl- méthoxypolyéthylèneglycol 2000) -1,2-distéaroyl sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (mPEG ₂₀₀₀ -DSPE) dans du chloroforme. Par exemple, pour la préparation de 10 ml de HTLC, pesez 314,4 mg de DPPC, 39,4 mg MSPC, et 83,9 mg de mPEG ₂₀₀₀ -DSPE dans un flacon en verre ambré. Ensuite, on dissout les lipides dans les 2 ml de chloroforme et chauffer le flacon pendant 30 secondes dans un bain d'eau à 60 °.
2. Retirer le chloroforme en utilisant un évaporateur rotatif. Placez le film lipidique obtenu sous vide à haute pression O / N.
3. Pour 10 ml de HTLC, hydrater le film lipidique avec 5 ml du tampon Tris 0,1 N (pH 7,4) pendant 1 heure. Dans le même temps, pesez 162,4 mg de 1,2-dipalmitoyl- sn-glycéro-3-phosphoglycérol (DPPG) lipide et 100 mg de poudre CDDP et hydrate with 5 ml de tampon Tris 0,1 N contenant 30% d'éthanol (pH 7,4) pendant 1 heure.
4. Pour la formulation Gd-HTLC, pesez la même quantité de lipides DPPG et 10 mg CDDP poudre, puis hydrater avec 2,5 ml de solution Gd-HP-DO3A (279,3 mg / ml) et 2,5 ml 0,1 N tampon Tris contenant 30% d'éthanol ( pH 7,4) pendant 1 heure. Au cours de l'hydratation, les mélanges doivent être conservés dans des flacons de couleur ambre et placés sur une plaque chauffante à 70 ° C avec une agitation constante et en vortexant toutes les 10 min.
5. Mélanger le mélange de lipides et le mélange du médicament dans les lipides, et de nouveau hydrater pendant 1 heure. Vortex toutes les 15-20 minutes.
6. Assemblez le 10-ml extrudeuse avec deux piles de 200 nm filtres en polycarbonate. Connecter le thermobarrel de l'extrudeuse dans un bain d'eau circulant à 70 ° C, et connecter l'extrudeuse à un réservoir d'azote comprimé.
7. Immédiatement après l'hydratation, transférer le mélange dans la chambre de l'extrudeuse. Ouvrir le courant d'azote (fixé à la pression 200 psi) à extruder les liposomes à travers des membranes. Recueillir le liposomees dans un tube de 50 ml. Garder le tube dans un bain d'eau chaude (70 ° C) à tout moment pendant le processus d'extrusion. Répétez ce processus 5 fois.
8. Démonter l'extrudeuse et changer pour deux piles de 100 nm filtres en polycarbonate. Remonter l'extrudeuse et régler la pression à 400 psi. Répétez l'étape 5, sauf extruder les liposomes 10 fois. Prélever l'échantillon à partir de l'extrusion finale dans un tube de 15 ml.
9. Refroidir les liposomes à température ambiante, centrifuger à 1000 et x g pendant 3 min pour précipiter insoluble CDDP.
10. Dialyser les liposomes O / N contre une solution saline à 0,9% dans un tube de dialyse avec une coupure de masse moléculaire 15 000 (MWCO) dans des conditions stériles.
11. Diluer 10 pi de liposomes dans 990 pi d'eau distillée. Utilisez diffusion dynamique de lumière pour mesurer la distribution de la taille des HTLC et Gd-HTLC. Effectuez 3 mesures avec 10 points chacun.
12. Diluer 40 pi de liposomes à 3,960 pi d'eau distillée. Faire 5-6 solutions standard de platine et le gadoliniumdans la plage de concentration de 0,1 à 20 pg / ml. Mesurer les concentrations de platine et de gadolinium en utilisant couplage inductif spectromètre d'émission atomique à plasma (ICP-AES) à 3 longueurs d'onde différentes. Effectuez 3 mesures à chaque longueur d'onde pour résultat moyen.
13. Déterminer le gel liquide à la température de transition de phase cristalline (T _m) de la formulation de liposomes HTLC aide d'un calorimètre à balayage différentiel (DSC). Charge 5-10 mg de HTLC dans une casserole de DSC et d'utiliser une casserole vide comme une référence. Utilisez une vitesse de balayage de 5 ° C / min à la rampe jusqu'à la température de 0 ° C à 60 ° C.
14. Envelopper les liposomes dans du papier d'aluminium pour éviter exposition à la lumière et conserver à 4 ° C.

2. la libération in vitro à partir de liposomes

1. Préparer colonnes de spin.
   1. Incuber 50 g de perles de gel de filtration dans 400 ml d'une solution saline à 0,9% à température ambiante pendant 3-4 heures. Enrouler un morceau de laine de verre, humide avec une solution saline à 0,9% et le placer dans la pointe d'une seringue de 1 ml. Appuyez sur la laine de verre pour remplir environ 0,05-0,1 ml de la seringue. Utiliser une pipette en verre pour ajouter graduellement à environ 1 ml de milieu de filtration sur gel dans la seringue.
   2. Placer la seringue dans un tube de 15 ml et centrifuger à 1000 g pendant 3 min. Retirer la colonne de spin et le placer dans un tube de 15 ml.
2. Exemple de 400 pi de HTLC ou Gd-HTLC dans 8 flacons de verre de 1 dram et incuber dans un bain d'eau à température contrôlée soit à 37 ° C ou 42 ° C. Sortez un flacon à chaque point de temps (c., 5, 15, 30 et 60 min) et placer immédiatement sur ​​la glace.
3. Ajouter 100 pi de solution saline 0,9% dans la colonne de spin préparé, puis ajouter 100 pi de HTLC ou Gd-HTLC avant incubation (contrôle) ou après incubation dans le bain de l'eau dans la colonne de spin. Centrifuger à 1000 g pendant 3 min. Retirez la seringue du tube et diluer la solution dans le tube pour l'analyse ICP-AES.

3. Implantation de sous-cutanée de xénogreffe du cancer du colTumeur

1. Toutes les études sur les animaux ont été menées selon des protocoles d'utilisation des animaux approuvées par le Comité de protection des animaux de l'University Health Network (UHN).
2. Effectuer toutes les études sur les animaux dans une enceinte de sécurité biologique (BSC). Autoclave tous les outils chirurgicaux avant toute intervention chirurgicale. Après chaque opération, essuyer les outils chirurgicaux avec 70% d'éthanol et stériliser à nouveau l'aide d'un stérilisateur à billes chaud.
3. Pour l'euthanasie, placer l'animal dans une chambre isolée _CO 2, puis effectuer dislocation cervicale.
4. Pour l'anesthésie générale en utilisant 100% d'oxygène, utiliser 5% isofluorane pour l'induction et 2% pour la maintenance. Pour assurer la profondeur de l'anesthésie, appliquer une pression avec une pince à surface palmaire de la patte d'observer la réponse de l'animal. Appliquer un lubrifiant oculaire pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie.
5. Pour un animal qui a subi une intervention chirurgicale, placer l'animal dans une cage propre, sans la compagnie d'autres animaux. Moniteur jusqu'à la conscience suffisante est retrouvé.
6. Cultureles cellules ME-180 dans du milieu essentiel minimal alpha-(α-MEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et des antibiotiques.
7. Récolter les cellules et maintenir les cellules dans un milieu complet avant l'inoculation. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
8. Inoculer chaque souris des donateurs à supporter une voie intramusculaire (im) ME-180 (cellules de cancer du col humaines) tumeur.
   Note: La croissance sur le site im a été sélectionné en vue d'assurer le développement de tumeurs bien vascularisé. Achat souris SCID femelles (âgés de 6-8 semaines, environ 20 g) à partir d'un établissement d'élevage en interne.
   1. Anesthésier une souris SCID femelles et injecter 1 x 10 ⁶ ME-180 cellules dans le muscle jumeau de la patte postérieure en utilisant une aiguille 27 G.
   2. Mesurer la taille de la tumeur en utilisant un étrier jusqu'à ce que les tumeurs ont atteint 9-12 mm dans leur plus grande dimension. Terminer l'étude si la tumeur a dépassé 12 mm, ou si la masse tumorale compromet apport comportement, la marche, la nourriture et l'eau normale.
9. Morceaux de tumeur implant de souris donneuses dans les souris receveuses.
   1. Anesthésier une souris donneuse en utilisant 5% isofluorane. Euthanasier la souris par dislocation cervicale sous anesthésie. Enlever la tumeur des bailleurs de fonds de la souris donneuse. Couper la tumeur en fragments cubes de 2-3 mm ^3.
   2. Anesthésier une souris receveuse en utilisant 5% isofluorane. Injecter 100 ul de 0,5 mg / ml de méloxicam par voie sous-cutanée avant l'intervention chirurgicale. Appliquer la solution d'iode chirurgicale de brossage, puis 70% d'éthanol, et la solution d'iode enfin sur la peau rasée. Rasez la patte arrière gauche de la souris receveuse. Faire une incision au niveau de la peau. Insérez un donneur morceau de la tumeur sous-cutanée à travers l'incision. Fermer l'incision en utilisant 1-2 pince (s) de la plaie.
   3. Retirez les clips 3-5 jours après l'implantation. Tumeur sous-cutanée est nécessaire pour utiliser la configuration de chauffage à base de laser.
   4. Autoriser les tumeurs de croître pendant 2-3 semaines avant le traitement de chauffage.

4. Conception, AssemCalibration Bly et d'une livraison conforme illuminateur laser pour In Vivo chauffage

1. Obtenir un chauffage du tissu à l'aide d'un laser à diode 763 nm couplée à un éclairage conforme à l'aide d'une fibre optique.
   1. Dispositif d'éclairage uniforme fournit un éclairage laser superficielle de la tumeur de xénogreffe. Il est composé d'un bloc de 30 x 20 x 17 mm de matériau hautement réfléchissant contenant trois lumière Adjoined intégrer les sphères de la chambre avec une chambre dans le milieu (16 mm de diamètre) et 2 petites chambres de chaque côté (16 mm de longueur et 5 mm de diamètre) (Figure 1).
   2. Pour que la lumière de passer d'une chambre à l'autre, deux petits trous 5 mm de diamètre ont été découpés entre les petites chambres extérieures et la chambre médiane plus large. La lumière est délivré à partir du laser dans les chambres extérieures au moyen d'un coupe-fibre 400 um extrémité connectée au laser qui est transmise dans la chambre à travers un trou d'un diamètre de 600 um.
   3. En raison de la nature de la lumière interaction avec les parois de la chambre, la lumière délivrée dans une des petites chambres est spatialement homogénéisé puis passe par les ports intérieurs dans la plus grande chambre où il est en outre spatialement homogénéisé. Lumière sort alors de l'orifice de 10 mm de diamètre sur la chambre médiane.
2. Calibrer la prestation de la lumière de l'illuminateur par rapport au réglage de la puissance laser en utilisant un étalonné NIST 50 mm sphère d'intégration pour mesurer la puissance délivrée.
   1. Calculer la distribution de la lumière dans la tumeur en utilisant des simulations Monte Carlo en fonction d'une géométrie simplifiée de la tumeur. Générer le code Monte Carlo dans un algorithme personnalisé écrit avec un logiciel de calcul commerciale et de la base sur le code standard de Monte Carlo modélisation du transport de la lumière dans les tissus multicouches de Jacques et al. ^14.
   2. Modéliser la tumeur comme un hémisphère couché sur une ligne de la peau plat avec un diamètre correspondant à la dimension de la tumeur moyenne de 7 mm à la surface de la peau et un ilroite de 5 mm. Éclairage homogène Modèle de la surface en lançant au hasard photons dans tout l'hémisphère exposée et direct au centre de la sphère.
   3. Utiliser les propriétés optiques, y compris l'absorption, u _{une dispersion} = 0,025 mm ^-1, μ _{s =} 10 mm ^-1, le facteur d'anisotropie, g = 0,9 et l'indice de réfraction, n = 1,4. Utilisez un million de photons dans le calcul.
   4. Effectuez ces mesures avant tout des expériences in vivo de chauffage avec aucune autre modification après l'étalonnage initial.

5. conforme de chauffage de la tumeur à l'aide personnalisée conçue Setup Chambre Laser

1. Raccorder une extrémité d'une fibre de laser de l'appareil laser et l'autre extrémité de l'illuminateur.
2. Anesthésier l'animal en utilisant 5% isofluorane. G Insérer un cathéter d'injection 27 dans la veine caudale latérale de la souris. Insérer un cathéter 22 G au centre de la tumeur. Placer une température pr de la fibre optiqueOBE dans le cathéter creux pour surveiller les changements de température.
3. Couvrir la totalité de la tumeur avec l'illuminateur (Figure 2). Réglez d'abord le pouvoir de 0,8-1 W. Allumez le laser et attendre que la température à la hausse. Maintenir la température de la tumeur à 42 ° C en ajustant manuellement la puissance du laser entre 0,1 à 0,8 W.

6. Distribution de la température évaluée par le biais thermométrie par résonance magnétique (MRT)

1. Mesurer la distribution de la température de la tumeur chauffée à l'aide de l'installation de chauffage à base de laser grâce à protons décalage de fréquence de résonance (PRF-shift) MRT sur un 7 Tesla M. préclinique système d'imagerie ¹⁵ en conjonction avec les fibres optiques mesures à la sonde de température.
2. Acquérir les images de thermométrie à intervalles de 10 secondes en utilisant une séquence d'impulsions 2D-FLASH (temps d'écho 4,5 ms, le temps de répétition 156,25 ms) avec 312 x 312 um dans le plan de résolution et de 2 mm d'épaisseur de tranche dans une seule tranche au niveau de la fibre optique Pro de la températureêtre.

7. M. surveillance de l'agent de presse

1. Effectuer T ₁ imagerie weighted avant et 20 minutes après l'administration de Gd-HTLC.
2. Implant deux tumeurs, une sur chacune des pattes postérieures, d'une souris SCID femelles en utilisant le procédé décrit ci-dessus dans la section 3 pour l'implantation. Préchauffer la tumeur sur la patte arrière gauche pendant 5 min à 42 ° C avant l'injection de Gd-HTLC à une dose de 66,3 mg / kg Gd-HP-DO3A et 1,4 mg / kg CDDP, puis chauffer la tumeur pour un supplément de 20 post-injection min. Effectuez l'injection pendant le traitement de chauffage. Utilisez la tumeur sur le membre postérieur droit comme un contrôle non chauffé.
3. Acquérir des images dynamiques MR (36 x 20 mm champ de vue, 200 x 200 um dans le plan de résolution, l'épaisseur des tranches de 2 mm; protocole de séquence MR) pour surveiller Gd-HP-DO3A de presse à 12 seconde d'intervalles pour l'ensemble 20 min après l'administration de Gd-HTLC, commençant 30 secondes avant l'injection.
4. Contourner la tumeur (chauffés et non chauffés) et des volumes musculaires.Calculer le signal moyenne MR de tous les voxels sein de chaque volume profilée.

Résultats

Les liposomes sont fabriqués en utilisant HTLC méthodes courantes, y compris la formation du film lipidique, l'hydratation, l'extrusion et la dialyse. Au cours des étapes impliquant CDDP, la prudence devrait être prise de ne pas exposer CDDP à tout matériau d'aluminium, comme CDDP sera désactivé par la formation d'un dépôt noir. Une illustration de HTLC est montré dans la figure 3. Les propriétés physico-chimiques de HTLC ont été résumées dans un manuscrit publié récemment dans le J...

Discussion

Les liposomes ont été développés dans les années 1960 en tant que véhicules d'administration de médicaments qui transportent des médicaments hydrophiles dans leur volume interne et aqueuse médicaments hydrophobes dans leur bicouche lipidique ^2. En plus de l'utilisation dans des applications thérapeutiques, les liposomes ont été explorées pour des applications de diagnostic lorsqu'ils sont marqués avec des radionucléides ou chargés avec des agents de contraste d'imagerie ^17. Au cours...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Évaporateur rotatif	Heidolph Instruments GmbH & Co.KG	Laborota 4000
Extrudeuse haute pression	Northern Lipids Inc.	T.001	10 ml thermo-cylindre
Circulateur de chauffage	VWR International LLC.	11305	Connecté à l’extrudeuse
Filtre à membrane en polycarbonate	Whatman	110605 ;
Calorimètre différentiel à balayage (DSC)	TA Instruments	Q100
Spectromètre d’émission atomique à plasma à couplage inductif (ICP-AES)	PerkinElmer	Optima 7300DV
Zetasizer	Malvern Instruments Ltd.	Incubateur de cellules Nano-ZS
	NuAire Inc.	NU-5800
Applicateur de clip de blessure Autoclip	Becton Dickinson	427630
Extracteur de clip de blessure Autoclip	Becton Dickinson	427637
Clips de blessure	Becton Dickinson	427631	9 mm
763 nm Dispositif laser	Biolitec	Ceralas CD 403
laser Sonde laser	Thorlabs Inc.	FT400EMT	Avec connecteurs SMA et clivage plat
Spectralon (illuminateur)	Labsphere Inc.	FAST-SL-5CMX5CM
		CSTM-SL-5CMX5CM
Système d’imagerie par résonance magnétique (MR) prélinéaire 7 Tesla	Bruker Corporation	Biospec 70/30
Capteur de température à fibre optique	LumaSense Technologies Inc.	Luxtron FOT Lab Kit
Sphère d’intégration	Newport Corporation	819C
Wattmètre optique	Newport Corporation	1830-R