Les biocapteurs enzymatiques à microélectrodes permettent de mesurer en temps réel la signalisation cellulaire extracellulaire à des concentrations biologiquement pertinentes. Les protocoles suivants étendent les applications des biocapteurs à la détection ex vivo et in vivo de l’ATP et du H2O2 dans le rein.
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Article de méthode
Utilisation des Biocapteurs pour quantifier enzymatique endogène ATP ou H
Dans cet article
Résumé
Résumé
Biocapteurs de microélectrodes enzymatiques ont été largement utilisés pour mesurer la signalisation extracellulaire en temps réel. La plupart de leur utilisation a été limitée à des tranches de cerveau et cultures de cellules neuronales. Récemment, cette technologie a été appliquée à l'ensemble des organes. Les progrès dans la conception de capteurs ont rendu possible la mesure de la signalisation cellulaire dans le sang perfusé dans les reins vivo. Les présents protocoles énumèrent les étapes nécessaires pour mesurer l'ATP et H 2 O 2 signalisation dans le tissu interstitiel du rein de rat. Deux conceptions de capteurs séparés sont utilisés pour l'ex vivo et in vivo dans des protocoles de. Les deux types de capteurs sont revêtus d'une couche biologique enzymatique mince sur le dessus d'une couche de permsélectivité pour donner réponse rapide, les biocapteurs sensibles et sélectives. La couche de perméabilité sélective protégeant le signal des substances interférentes dans le tissu biologique, et la couche enzymatique utilise la réaction catalytique séquentiel de la glycérol kinase et glycérol-3-phosphate-oxydase en présence d'ATP pour produire H 2 O 2. L'ensemble de capteurs utilisés pour les études ex vivo en outre analyte détecté par oxydation de l'H 2 O 2 sur une platine / iridium (Pt-Ir) fil-électrode. Les capteurs pour les études in vivo sont plutôt basée sur la réduction de H 2 O 2 sur une électrode d'or revêtu de médiateur conçu pour tissu perfusé de sang. Les changements de concentration finale est détecté par ampérométrie en temps réel suivie d'étalonnage de concentrations connues d'analyte. En outre, la spécificité du signal ampérométrique peut être confirmée par l'addition d'enzymes telles que la catalase et apyrase qui décomposent H 2 O 2 et de l'ATP de façon correspondante. Ces capteurs comptent aussi beaucoup sur les étalonnages précis avant et après chaque expérience. Les deux protocoles suivants établissent l'étude de la détection en temps réel de l'ATP et H 2O 2 dans des tissus de rein, et peut être en outre modifié de manière à étendre la méthode décrite pour une utilisation dans d'autres préparations biologiques ou d'organes entiers.
Introduction
Biocapteurs de microélectrodes enzymatique (également mentionnés comme des capteurs dans le présent manuscrit) ont été un outil précieux pour l'étude des processus de signalisation dynamiques dans les cellules et les tissus vivants. Les capteurs permettent d'augmenter la résolution temporelle et spatiale des molécules de signalisation cellulaire dans des concentrations biologiquement pertinentes. Au lieu de l'échantillonnage et l'analyse de fluides extracellulaires prélevés à des intervalles de plus longues périodes de temps, ces capteurs réagissent aussi vite que leurs enzymes réagissent à l'analyte, produisant ainsi des mesures en temps réel
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Protocole
Les procédures sur les animaux suivants ont adhéré à la NIH Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. L'approbation préalable a été obtenue à partir du Comité des soins et de l'utilisation des animaux institutionnel (IACUC).
REMARQUE: Examen des instructions du fabricant du capteur doit être fait lors de la conception de l'expérience et avant leur utilisation. Suite à ces instructions produire des résultats optimaux lorsque vous utilisez les capteurs.
1. Calibrage du capteur
- Préparer des solutions de base fraîches avant le début de l'expérience.
- Insérer le tampon A cont....
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Résultats
La conception de la microélectrode biocapteur enzymatique permet la détection en temps réel des analytes dans les reins entiers. La conception de l'expérience générale pour les ex vivo ou in vivo est illustrée à la figure 1 capteurs .Les utilisés et les procédures chirurgicales diffèrent selon que l'étude est ex vivo ou in vivo.
Pour obtenir des résultats reproductibles, précise pré et post étalonnages sont essentielles. <.......
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Discussion
Les présents protocoles ont été développés pour fournir une meilleure résolution temporelle et spatiale de l'ATP et de H 2 O 2 pour la signalisation des reins perfusés par le sang isolés ex vivo, et in vivo perfusé. Les différences entre les protocoles et les capteurs utilisés ici fournissent acquisition de données optimale pour soit des agents pharmacologiques ou des études physiologiques. Les protocoles sont constitués d'une) capteur étalonnage, 2) intervention chirurgicale, 3) l'instal.......
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Déclarations de divulgation
Capteurs pour l'enregistrement vidéo de ce manuscrit ont été fournis par Sarissa Biomedical Limited (Coventry, Royaume-Uni).
Remerciements
Nous apprécions Sarissa biomédicale pour leur travail dans le développement des capteurs utilisés dans le présent manuscrit. Cette recherche a été financée par le National Heart, Lung, and Blood Institute accorde HL108880 (A. Staruschenko), HL 116264 (A. Cowley) et HL 122662 (A. Staruschenko et A. Cowley), un projet financé par le Medical College of Comité des affaires recherche Wisconsin # 9306830 (O. Palygin) et de faire progresser un programme de recherche et d'enseignement sain Wisconsin # 9520217, et le Young Investigator Grant de la National Kidney Foundation (O. Palygin).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Kit de capteurs | Sarissa Biomedical | SBK-ATP-05-125 | Le kit comprend une bouteille de stockage, une chambre de réhydratation, des fils d’électrodes et des électrodes de référence. Le kit comprend également le choix des capteurs par l’utilisateur. |
| Sarissaprobe Biocapteur ATP 125 &mu ; m | Sarissa Biomedical | SBS-ATP-05-125 | stocker à 2-8 oC avant utilisation |
| Sarissagold ATP Biosensor 50 &mu ; m | Sarissa Biomedical | SGS-ATP-10-50 | stocker à 2-8 oC avant utilisation |
| Sarissaprobe capteur de nullité 125 &mu ; m | Sarissa Biomedical | SBS-NUL-20-125 | stocker à 2-8 oC avant utilisation |
| Sarissagold capteur de nullité 50 &mu ; m | Sarissa Biomedical | SGS-NUL-10-50 | stocker à 2-8 oC avant utilisation |
| Sarissaprobe ATP Manual | Sarissa Biomedical | http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf | |
| cage de Faraday ; | TMC | ||
| Potentiostat double canal | Digi-Ivy | DY2021 | Type II Cage de Faraday |
| Programme d’acquisition de données | Digi-Ivy | DY2000 | |
| Pompe à perfusion | Razel Scientific Instruments | Modèle R99E | |
| Illuminateur à fibre optique | Schott | ACE 1 | |
| micromanipulateur | Narishige | MM-3 | |
| micromanipulateur support magnétique | Narishige | GJ-8 | |
| table à air | TMC | 63-500 | |
| isoflurane | ventilateur LEI Medical | M2000 | |
| 3 ml boîte de Pétri | Fisher Scientific | S3358OA | |
| aiguille | Santa Cruz | 26-30 G | |
| broches | Broches de dissection standard | ||
| cathéter | Tube en polyéthylène (PE50) | ||
| colle tissulaire du cathéter | Vetbond | 1469SB | |
| suture | Look | SP117 | |
| élastiques | n’importe quel élastique de 2 à 4 mm de large | ||
| silicone | Momentive | RTV-615 Clear 1# | |
| clamp | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| de dissection standard | Le kit doit inclure un scalpel et des seaux de dissection. | ||
| Coupe | De conception propre | ||
| produits chimiques standard | Sigma-Aldrich | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | 100 mM ATP solution |
| peroxyde d’hydrogène | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| glycérol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A7646 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| isoflurane | Clipper | 10250 | |
| inactine | Sigma-Aldrich | T133 | |
| kétamine | Clipper | 2010012 | |
| Hanks Balanced Salt Solution ; | Gibco | 14025092 |
Références
- Palygin, O., Staruschenko, A. Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).
- Clark, L. C., Lyons, C. Electrode systems for con....
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Réimpressions et autorisations
