Des études de développement du palais sont motivés par l'incidence de la fente palatine, un défaut de naissance qui impose un fardeau de santé énorme et peut laisser durablement défigurée. Nous démontrons ici d'une technique de culture étagères palatines qui peuvent être utilisés pour étudier différentes voies de signalisation impliquées dans le développement palatine et de la fusion.
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Article de méthode
Méthode d'étude Palatal Fusion utilisant statique Organ Culture
Dans cet article
Résumé
Résumé
Fente labiale et palatine sont parmi les plus communs de toutes les anomalies congénitales. Les formes de palais secondaire des tablettes mésenchymateuses couverts par un épithélium qui adhère à former la couture médiane épithéliale (MES). Les théories suggèrent que les cellules MES suivent une transition épithélio-mésenchymateuses (EMT), l'apoptose et la migration, faisant un palais fusionné 1. Désintégration complète du MES est la phase essentielle finale de palatine confluence avec entourant les cellules mésenchymateuses. Nous fournissons une méthode de culture d'organe de palais. Le point dans le protocole vitro permet l'étude des processus biologiques et moléculaires lors de la fusion. Les applications de cette technique sont nombreux, y compris les réponses à l'évaluation des agents chimiques exogènes, des effets des facteurs réglementaires et de croissance et des protéines spécifiques. Culture d'organe palatine a un certain nombre d'avantages, y compris la manipulation à différents stades de développement qui est pas possible en utilisant des études in vivo.
Introduction
Fentes faciales sont prédominants défauts de naissance les cranio-faciales. Aussi, en prenant en considération tous les défauts cranio-faciales possibles, ceux-ci sont la deuxième anomalie de naissance le plus commun chez les nouveaux nés 2. Fentes palatines se produisent à environ 1 pour 700 naissances aux États-Unis (US) chaque année, l'incidence de la fente palatine est égale à 475 enfants nés avec une fente palatine par mois ou 15 enfants atteints de fentes par jour 3. Environ 1% des enfants nés dans le monde chaque année présentent une certaine forme de dysmorphie cranio-faciale.
Fentes du palais et la lèvre ont besoin d'une procédure très coûteuse et complexe avec des implications pour la vie pour les patients qui ont cette anomalie. Le coût estimé pour chaque patient avec fente orale est d'environ 100 000 $ 4. Le traitement d'un patient avec fente labiale et palatine nécessite une équipe de médecins, y compris cranio-faciales chirurgiens, orl, des généticiens, des anesthésistes,-orthophonistes, des nutritionnistes, des orthodontistes, prothésistes, des psychologues, des neurochirurgiens, et les ophtalmologistes.
Dans palatogenesis, le palais secondaire se pose excroissances paires, qui se développent d'abord verticalement et subissent palatine plateau élévation au-dessus du dos de la langue. Après l'élévation, les étagères palatines appariés poussent vers la ligne médiane (à E14.5 -E15 chez la souris et chez l'homme la semaine 9). L'épithélium de bord médial (MEE) qui couvre la pointe du plateau adhère formant la couture médiane épithéliale.
Ceci est suivi par transition épithélio-mésenchymateuse et / ou de l'apoptose pour permettre mésenchymateuses confluence. Adhésion d'opposer MEE est un événement essentiel dont l'altération provoque une fente palatine. Cependant, peu d'études ont étudié l'adhérence initiale des lames palatines 5. Les formes palais dur par la différenciation des cellules mésenchymateuses en ostéoblastes de. Le développement anormal du palais peut produire cleft palais avec ou sans la participation de la lèvre.
Techniques de culture d'organes palais avaient été largement utilisés pour de nombreux laboratoires au cours des 30 dernières années 6,7.
Dans ce protocole, nous décrivons en détail une méthode de dissection palatine et de la culture d'organe statique. L'avantage d'une culture d'organe immobile est qu'il permet de fusionner étagères palatines. Cette technique a été utilisée avec succès dans notre laboratoire pour de nombreuses fusion et de signalisation expériences 8,9. Toutefois, le champ d'application de la technique est très grande et peut être utilisé chaque fois que système de culture d'organe statique est nécessaire, y compris l'évaluation des réponses à des agents chimiques exogènes, les effets de facteurs de croissance dans différentes voies de régulation et des protéines spécifiques.
Figure 1. Souris Palatogenesis. Les stades de développement de la bouche de souris. (BF) ele de numérisationmicrographies cTRON (SEM) du palais secondaire à des moments représentatifs de développement. Les flèches rouges montrent: la partie initiale de l'adhésion palatine et de la fusion. Les flèches jaunes: le point à l'espace entre les palais primaires et secondaires qui vont disparaître après la fusion (Repris de Kaufman 11 avec la permission de la revue PLoS ONE).
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Protocole
Toutes les procédures décrites doivent être effectuées en conformité avec les directives et règlements pour l'utilisation d'animaux vertébrés, y compris l'approbation préalable par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux locale.
1. Préparation des instruments de dissection et Culture Media
- Prélavage tous les instruments à utiliser dans la dissection avec 3% de peroxyde d'hydrogène, puis autoclave à 121 ° C pendant 20 min. Filtre BGJb support avec une solution antibiotique et antimycotique en utilisant un filtre de 0,22 um de taille de pore avec aspiration par le vide dans une hotte.
2. Préparation de l'équipement Culture
- Couper filtres à membrane de polycarbonate qui soutiendront les organes palatines en petits triangles, pulvériser avec 70% d'alcool et laissez-les sécher. Préparer Centre-Well Organ Culture Dish (60x15 mm) en plaçant une grille propre et stérilisée triangle équilatéral-forme de fil (20 mm) sur la plaque de culture de l'orgue. Ensuite, remplissez le puits avec 1 ml de BGJB milieux de culture des médias. NOTE: Les médias devraient être suffisantes pour atteindre le niveau de la grille sans submerger les palais. Placez les filtres à membrane, côté brillant vers le bas, sur le dessus de la grille (3-4 membranes par grille) .Depending sur l'expérience, de traitement (protéines, anticorps ou inhibiteurs) peuvent être ajoutés aux médias
3. Mouse Embryo prélèvement et la préparation de la Culture
- Pour obtenir des embryons de souris de type sauvage, l'utilisation chronométré 13,5 enceinte souris CD-1 souche de fond génétique. Nettoyer la zone de dissection avec 70% d'éthanol.
REMARQUE: Les autres souches de souris peuvent être utilisés. Nous préférons souris CD-1 en raison du nombre plus grand de la litière. - Euthanasier les souris enceintes à E13.5 DPC (jours après le coït) avec 5% d'isoflurane suivie par dislocation cervicale pour assurer la mort en utilisant des protocoles approuvés.
- Vaporiser éthanol à 70% sur la surface abdominale ventrale pour éviter d'avoir les cheveux abdominale bâton pour les instruments. Puis ouvrir la cavité abdominale ventraleutilisant un pointus-blunt ciseaux d'exploitation et de micro-pinces à disséquer pour localiser l'utérus. Utilisation de la pince, soulever l'ensemble de l'utérus et le séparer du corps de coupe au niveau du corps de l'utérus et à la pointe des cornes utérines avec une lumière ciseaux de fonctionnement.
- Placez l'utérus sur une serviette en papier propre sur de la glace (Selon le guide de protocole pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire). Couvrir l'utérus avec une autre serviette de papier propre pour éviter la contamination. Stériliser les instruments utilisant 70% d'éthanol pulvérisation avant l'utilisation ultérieure. L'utérus et les embryons peuvent être transportés au laboratoire sur de la glace.
- Dans une hotte à flux laminaire ouverte, assurez attentivement une petite ouverture dans le sac jaune avec des ciseaux d'exploitation nettes et les micro-blunt-pinces à disséquer. Faire l'ouverture plus large, puis poussez-le doucement d'extérioriser l'embryon de la vésicule ombilicale.
- Transférer les embryons immédiatement à une boîte de Pétri avec froid saline tamponnée au phosphate 1X (PBS) pH 7,4. Pour assurer le bon stade, exl'embryon amine sous un microscope à dissection pour le corps, la taille de la tête et du membre morphologie.
NOTE: Les embryons qui ne sont pas au bon stade de développement ne sont pas utilisés pour l'expérience.
Figure 2. Limb Bud Morphologie. L'avant et membres postérieurs sont vérifiés pour le degré de sangle indentation entre les chiffres. À E13.5, tous les condensations chiffres sont de premier plan, avec la sangle et indentations distales entre les chiffres apparaissant très distincte. Les chiffres de derrière sont derrière par une demi-journée 12 Rangée supérieure:. Membres antérieurs, rangée inférieure: membre postérieur.
4. Bouche Dissection
- Placer un embryon à la fois dans une boîte de Pétri avec du PBS sous le microscope à dissection. Utilisation de petits ciseaux de dissection et pincettes séparer la tête du corps de l'embryon.
- Tenant délicatement le crâne de la souris au-dessus du niveau des yeux avec une pince (en évitantle processus maxillaire) faire deux incisions sur les deux côtés de la ligne de la lèvre. Ensuite, retirer la mandibule et la langue. Isoler la région de processus maxillaire en faisant une coupure au niveau des yeux et retirer le cerveau, les yeux, la cloison nasale et des tissus attenants.
Figure tissus 3. Bouche recueillies auprès 13,5 embryons, lorsque les rayons du palais avaient élevées mais pas en contact. Les étagères palatines ont été mises en culture d'organes sur un filtre à l'interface des médias de l'air pendant 72 heures dans le modèle statique. (A) Niveau de dissection sur E13.5 embryons. (B) Blue Stars délimitent les zones à maintenir le tissu avec une pince lors de la dissection. (C) Vue de lames palatines disséqués placés sur une membrane filtrante de trapèze. (D) Vue de côté de la boîte de culture après le placement de la palais disséqués et plus de milieux de culture.
- Placez le côté orale palatine et retirer la cloison nasale et le tissu autour d'elle, en gardant le palais primaire fixé pour l'aider à orienter d'avant en arrière. Utilisez une spatule en cuillère et transférer très soigneusement les étagères palatines (côté nasal bas) pour les filtres préparés sur les grilles dans les boîtes de culture. REMARQUE: Régler le volume des médias pour permettre interface appropriée air-médias.
- Sous le microscope stéréo, disséquer le palais primaire et utiliser des pinces pour placer les étagères palatines près de l'autre. Les étagères palatines ne seront pas fusionner si elles ne sont pas mises en contact. Couper le filtre à membrane triangulaire où la partie antérieure du palais est situé. La forme trapézoïdale aidera à localiser la partie antérieure du palais.
- Culture les étagères palatines individuellement ou avec deux ou trois dans la même boîte de culture d'organes, selon BGJb milieux de culture.
5. La culture souris Tablettes palatines
- Incuber le tissues à 37 ° C dans un mélange de gaz humidifié (CO 2 et 95% d'air de 5%) pendant 72 heures, et de changer le milieu tous les 24 heures.
6. Traitement Palais pour l'analyse histologique
- Fixer les palais après 72 h en culture avec 4% de formaldéhyde / tampon phosphate salin O / N à 4 ° C. Puis, doucement avec une pipette de transfert laver le tissu dans la boîte de culture avec du PBS. Enveloppez les palais dans un morceau de lingettes de laboratoire et dans l'intégration des cassettes.
REMARQUE: Emballage dans les palais des lingettes de laboratoire à prévenir leur perte au cours du processus de déshydratation. - Déshydrater le tissu après 70%, 80% et jusqu'à 100% de lavages d'éthanol pendant 1 heure, suivi par la procédure régulière de paraffine d'intégration. Pour l'enrobage, placer la partie antérieure du palais face au plateau.
- Couper 6 um sections en série dans l'orientation coronale d'avant en arrière. Une section complète du palais donnera 350-450 sections. Colorer les sections avec hématoxyline et l'éosine (H & E). 10 Score chaque section 20 ème utilisant le décrit précédemment Score Fusion Mean (MFS) échelle (tableau 1). 8
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Résultats
La technique peut être appliquée à différents types de experiments.The étude suivante a été conçu pour tester l'effet tératogène de la nicotine in vitro sur palatine fusion. Deux souches de souris ont été utilisées pour cette expérience, CD1 et C57.Palatal tissu a été traitée avec 0,06 mM et 6 concentrations de nicotine hémisulfate. Il a été observé que les schémas de fusion palatines et le calendrier étaient différents dans les deux souches différentes. Chez la souris CD1, des étagères palatines du groupe ...
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Discussion
Le protocole à cet article fournit une méthode de disséquer étagères palatines à partir d'embryons au jour embryonnaire 13,5. Étagères palatines des embryons de souris ont été cultivées dans un milieu de culture exempt de sérum dans une atmosphère de 95% d'O 2 5% de CO2 à 37 ° C. Palatal dissection réussie dépend de manière critique de plusieurs facteurs, à chaque étape au cours de la procédure à partir du moment embryonnaire des souris euthanasiés à la fin de la culture. Un des facteurs les plus impo...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Les auteurs n’ont aucune reconnaissance.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| BGJb | Invitrogen | ||
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100X |
| Boîtes de Pétri | VWR | 25384-088 | 100 x15 mm |
| Boîte de culture d’organe à puits central | Falcon ; | #353037 | fer 60 x15 mm |
| Fabriquée sur mesure avec un treillis métallique en acier inoxydable pour bien s’adapter à la boîte de culture d’organes. ; | |||
| Filtre en polycarbonate | GE& Technologies de l’eau et des procédés | K04BP04700 | Noir 0,4 micron, 47 mm |
| Stéréomicroscope | ZEISS ; Stemi SR | ||
| Hotte de culture | NUAIRE Pince | ||
| Dumont Medical ; | #5 | ||
| Ciseaux de microdissection | Kent Scientific Corporation | INS14003-G | Ciseaux Vannas, droits, 8 cm de long, pointes de 0,1 mm, lames de 5 mm, de fabrication allemande |
| Ciseaux de microdissection | Kent Scientific Corporation | INS500086 | Ciseaux Vannas, droits, 8,5 cm de long, pointes de 0,025 mm x 0,015 mm, lames de 7 mm |
| Ciseaux de microdissection | Kent Scientific Corporation | INS14127-G | Ciseaux à ressort incurvés, incurvés, 10,5 cm de long, lames de 8 mm, fabrication allemande |
| Currete chirurgical (cuillère, spatule) | Hu-friedy | CM 2/4 | |
| Protector hotte de laboratoire | Labconco | ||
| Incubateur Thermo Scientific | Farma | ||
| Series11 water Jacket | |||
| CO2 incubateur | |||
| PBS ; | GIBCO | 10010-023 ; | 1 fois |
| Fibre optique Source lumineuse | Fiber-light ; Dolan-Jenner | PL-750 | |
| Cassette d’encastrement ; | Statlab | EC301 | |
| Kim Wipes | VWR | 470173-504 |
Références
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- Strong, E. B., Buckmiller, L. M. Management of the cleft palate. Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).
- Witt, P. D., Marsh, J. L. Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate. Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).
- 4miloro, principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).
- Mima, J. Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation. PloS one. 8, e61653(2013).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy. Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).
- Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos. The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).
- San Miguel, S. Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).
- Kang, P., Svoboda, K. K. PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).
- RD, L. Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , 3rd edn, McGraw Hill Book Co. New York. (1965).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Elsevier. (1992).
- Taher, L. Global gene expression analysis of murine limb development. PloS one. 6, e28358(2011).
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Réimpressions et autorisations
