Protocole pour l'isolement des hépatocytes humains primaires et correspondant Principales populations de cellules hépatiques non parenchymateuses

Résumé

Une technique permettant d’isoler des hépatocytes humains et des cellules hépatiques non parenchymateuses du même donneur est décrite. Les différents types de cellules hépatiques constituent la base des modèles hépatiques fonctionnels et de l’ingénierie tissulaire. Cette nouvelle méthode vise à isoler les cellules hépatiques avec un rendement et une viabilité élevés.

Résumé

A côté hépatocytes parenchymateux, le foie est constitué de cellules non parenchymateuses (NPC), à savoir les cellules de Kupffer (KC), le foie des cellules endothéliales (LEC) et des cellules étoilées hépatiques (HSC). Deux dimensions (2D) culture de primaire hépatocytes humains (PHH) est toujours considéré comme le «gold standard» pour les tests in vitro du métabolisme des médicaments et l' hépatotoxicité. Il est bien connu que la monoculture 2D de PHH souffre de dédifférenciation et la perte de fonction. Récemment, il a été montré que hépatique NPC jouent un rôle central dans le foie (patho) physiologie et le maintien des fonctions PHH. La recherche actuelle se concentre sur la reconstruction de l' architecture in vivo dans des tissus en 3D- et co-culture des modèles pour surmonter les limites des monocultures 2D. Auparavant , nous avons publié une méthode pour isoler les cellules du foie humain et étudié l'aptitude de ces cellules pour leur utilisation dans des cultures cellulaires en biologie expérimentale et de médecine ^1. Sur la base de l'intérêt général dans ce technique le but de cet article était de fournir un protocole plus détaillé pour le processus d'isolement des cellules du foie, y compris une vidéo, ce qui permettra une reproduction facile de cette technique.

des cellules hépatiques humaines ont été isolées à partir d'échantillons de tissu hépatique humain des interventions chirurgicales par une EGTA / P collagénase technique de perfusion en deux étapes. PHH ont été séparés de l'APN par une centrifugation initiale à 50 x g. Densité étapes de centrifugation à gradient ont été utilisés pour l'élimination des cellules mortes. populations de cellules hépatiques individuels ont été isolés à partir de la fraction enrichie NPC en utilisant les propriétés de cellules spécifiques et des procédures de tri des cellules. A côté de l'isolement PHH nous avons pu séparer KC, LEC et HSC pour plus de culture.

Pris ensemble, le protocole présenté permet l'isolement de PHH et NPC en haute qualité et la quantité d'échantillon de tissu d'un donneur. L'accès aux populations de cellules du foie purifiées pourrait permettre la création d'in vivo comme li humainemodèles de ver.

Introduction

un tissu de foie humain est très complexe et se compose de deux entités différentes de cellules, les cellules parenchymateuses et les cellules non parenchymateuses (CNP). les cellules hépatiques parenchymateuses comprennent hépatocytes et cholangiocytes. Hepatocytes représentent 60 à 70% des cellules hépatiques totales et représentent la majeure partie des fonctions métaboliques du foie, par exemple l' acide biliaire et de compléter la synthèse du facteur, la biotransformation et le métabolisme énergétique de ^2,3.

La fraction NPC inférieure constitue 30 à 40% des cellules hépatiques totales. NPC comprennent les pop....

Protocole

Remarque: Toutes les cellules ont été isolées à partir de tissu de foie réséqué non tumorales humaines, qui est restée après résection partielle du foie des tumeurs hépatiques primaires ou secondaires. Le consentement éclairé des patients a été obtenu selon les directives éthiques de la Charité - Universitätsmedizin Berlin.

1. Préparation des matériaux et solutions

1. Stériliser tous les instruments et les matériaux à l'avance pour éviter la contamination bactérienne au cours du processus d'isolement.
2. Préparer les solutions nécessaires pour la perfusion de l'échantillon de tissu hépatique, le processus d'....

Résultats

La séparation en une fraction du parenchyme et non parenchymateuse, en utilisant la centrifugation en gradient de densité comme une procédure de nettoyage combinée à l'utilisation des propriétés d'adhérence et MACS conduit à succès PHH et NPC isolement. PHH et NPC peuvent être isolés en haute qualité et la quantité. La figure 1 montre la configuration représentative de l'équipement pour la perfusion du foie et la digestion. 10% de FCS a été ajouté à la collag.......

Discussion

Le protocole publié décrit une technique pour isoler pur PHH et NPC, à savoir KC, HSC et LEC, simultanément en haute qualité et la pureté du même échantillon de tissu de foie humain. La majorité des publications traitant des isolements de cellules hépatiques ne couvrent que l' un de ces populations de cellules ^18-20 et les procédures d'isolement réalisées avec des tissus humains sont rares (examinés par Damm et al.) ^21. Adaptation des méthodes établies avec les tissus des animaux <.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Equipement général /strong>
PIPETBOY	Pipettes Eppendorf
	Microscope Eppendorf
	Carl Zeiss
Olympus
CO2-incubateur	Liant
Lamin Air	Heraeus
Centrifuge Varifuge 3.0R	Heraeus
Bécher à urine	Sarstedt	2041101
seringue à perfuseur 50 ml	B.Braun	12F0482022
Filtre à bouchon de bouteille	Nalgene	1058787
Falcon 50 ml Tube conique en polypropylène	BD Biosciences	352070
Falcon 15 ml Tube conique en polypropylène	BD Biosciences	352096
Plaque de culture tissulaire	BD Biosciences	533047	Pipettes
sérologiques	BD Biosciences	357525, 357551, 357543	25 ml, 10 ml, 5 ml
pointes de pipette	SARSTEDT	0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011	100 µ ; l, 200 et micro ; l, 1 000 et micro ; l
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
Isolation Equipment
water shower	Lauda
péristaltique	Carl Roth
thermostat	Lauda
pH-mètre	Schott
balances fines	Sartorius
stand
Bü ; Entonnoir en	Haldenwanger
Entonnoir
canules en
Couteau à plat
Scalpel
	Plume	12068760
	Optique Labor
cell lifter	Costar
Champ Chirurgical	Charité ; Universitä ; tsmedizin Berlin	A2013027
compresse	Fuhrmann	40013331
gants chirurgicaux stériles	Gammex PF	1203441104
Colle tissulaire	B. Braun	1050052
bouteille en verre	VWR
Collagenase P	Roche	13349524
Percoll Solution	de séparationBiochrom	L6145	Densité 1.124 g/ml
Hank' s BSS	PAA	H00911-3938
Dulbecco' s PBS	PAA	H15 - 002	sans Mg/Ca
Ampuwa	Plastipur  ;	13CKP151  ;
Albumine	Sigma-Aldrich	A7906
NaCl	Merck	1 064 041 000
KCl	Merck	49 361 000
Hepes Pufferan  ;	Roth	133196836
EDTA	Sigma	E-5134
Name	Company	Catalog Number	>Comments
Media Equipment  ;
DMEM	PAA	E15-005	Faible teneur en glucose (1 g/L) (sans L-glutamine)
HEPES Buffer Solution 1  ; M	GIBCO	1135546
L-Glutamine	GIBCO	25030-024	200 mM
MEM NEAA	GIBCO	11140-035
pénicilline/streptomycine	GIBCO	15140-122
RPMI 1640	PAA	E15 - 039	sans L-Glutamine
Sodium Pyruvate	GIBCO	1137663	100 mM
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154	0.4 %
William' s E  ;   ;	GIBCO	32551-020
avec GlutaMAX&trade ;
EGTA	Sigma-Aldrich	03780-50G
Fortecortin	Merck	49367	8 mg/2 ml
Human-Insulin	Lilly	HI0210	100 I.E./ml
N-Acétyl cystéine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Sérum de veau fœtal (FCS)	PAA	A15-101
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
Equipment for Immunostainings
CD 68	R& D Systems, USA		monoclonal
CK 19	Santa Cruz	D2309	polyclonal
CK18	Santa Cruz	K2105	monoclonal
Vimentin	Santa Cruz		monoclonal
GFAP	Sigma Aldrich		monoclonal
Triton X-100	Sigma Aldrich	23.472-9
Chèvre anti-souris IgG1-PE	Santa Cruz	C0712
Chèvre anti-lapin IgG-FITC	Santa Cruz	L0412
Méthanol	J.T.Baker	1104509006
Formaldéhyde 4 %	Herbeta Arzneimittel	200-001-8
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G

Microscope 24 puits pompe circulation plastique en silicone tube avec pointes d’oliveen verre Chambre de comptage Neubauer