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Article de méthode

Utilisation de cellules Caco-2 à étudier Lipid Transport par l'intestin

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DOI :

10.3791/53086

⸱

20 août 2015

 , 
1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, California Northstate University, 2Department of Biomedical Sciences, James H. Quillen College of Medicine, East Tennessee State University

Dans cet article

Résumé

< classe p = 'jove_content'> cellules Caco-2 peuvent servir de modèle in vitro pour étudier le transport des lipides par les entérocytes et les médicaments/vitamines liposolubles. Le système membranaire perméable sépare le compartiment apical du compartiment basolatéral, tandis que le système d’expression du lentivirus offre une méthode efficace de surexpression génique. L’isolement des lipoprotéines est confirmé par TEM.

Résumé

Les études sur l’absorption des graisses alimentaires sont généralement réalisées à l’aide d’un modèle animal équipé d’une canule lymphatique. Bien que ce modèle animal soit largement accepté comme le modèle in vivo de l’absorption des graisses alimentaires, les techniques chirurgicales impliquées sont difficiles et coûteuses. La manipulation génétique du modèle animal est également coûteuse et prend du temps. Le modèle alternatif in vitro est sans doute plus abordable, permet de gagner du temps et est moins difficile. Il est important de noter que le modèle in vitro permet aux chercheurs d’examiner les entérocytes en tant que système isolé, réduisant ainsi la complexité inhérente au modèle de l’organisme entier. Cet article décrit comment les cellules de carcinome du côlon humain (Caco-2) peuvent servir de modèle in vitro pour étudier le transport des entérocytes des lipides, des médicaments liposolubles et des vitamines. Il explique le bon entretien des cellules Caco-2 et la préparation de leur mélange lipidique ; Et il aborde en outre l’option précieuse d’utiliser le système de membrane perméable. Étant donné que les cellules Caco-2 différenciées sont polarisées, le principal avantage de l’utilisation du système de membrane perméable est qu’il sépare le compartiment apical du compartiment basolatéral. Par conséquent, le mélange lipidique peut être ajouté dans le compartiment apical tandis que les lipoprotéines peuvent être collectées dans le compartiment basolatéral. De plus, l’efficacité du système d’expression du lentivirus dans la régulation positive de l’expression génique dans les cellules Caco-2 est discutée. Enfin, cet article décrit comment confirmer l’isolement réussi des lipoprotéines intestinales par microscopie électronique à transmission (MET).

Introduction

Des études sur l'absorption intestinale des graisses alimentaires, les médicaments et les vitamines et solubles dans les lipides peuvent être conduites in vivo en utilisant un modèle de la fistule lymphatique 1-4. Cependant, les techniques chirurgicales sont impliqués non seulement difficile, mais aussi coûteux. Bien que in vivo approches basées sur l'analyse des fèces peuvent être utilisés, ils sont principalement utilisés pour déterminer l'absorption pour cent par le tractus gastro-intestinal 2,5. Le modèle in vitro décrit dans le présent document est plus rentable, et les techniques impliquées sont sans doute moins difficile. Des études de modification génétique sont également plus économique et moins de temps lorsqu'ils sont effectuées en utilisant ce modèle in vitro.

Depuis matières solubles dans les lipides qui sont prises par les entérocytes sont emballés dans les lipoprotéines 6,7, l'efficacité de ce modèle in vitro pour produire des lipoprotéines est crucial. Les deux intestina principalel lipoprotéines sont chylomicrons et les lipoprotéines de très faible densité (VLDL). Les chylomicrons, lipoprotéines définies comme ayant 80 nm ou plus de diamètre, sont fabriqués strictement par l'intestin grêle quand lipides sont présents en abondance dans la lumière gastro-intestinale. Comme ils sont les plus grands lipoprotéines, chylomicrons sont vraisemblablement les transporteurs de lipides les plus efficaces. Ce modèle in vitro, qui est capable de produire des chylomicrons 8, peut être utilisé pour étudier l'absorption de graisse alimentaire, la vitamine liposoluble absorption par l'intestin, et la biodisponibilité orale du médicament lipophile. La présence de molécules solubles dans les lipides, des vitamines, des médicaments ou dans la fraction de lipoprotéine est un indicateur de leur absorption par l'intestin grêle. Comme indiqué précédemment, ce modèle peut être utilisé pour améliorer la biodisponibilité des médicaments par voie orale lipophile 6.

Ce document décrit comment cellules Caco-2 devraient être maintenus dans la membrane perméable ou plats réguliers de culture de tissus, la façon dont les mi lipidiquesxture pour stimuler la production de lipoprotéines doit être préparé, la façon dont le système d'expression de lentivirus peut être utilisé pour réaliser une surexpression efficace, et la façon dont les lipoprotéines isolées doit être analysé.

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Protocole

1. Maintien des cellules Caco-2

  1. Utilisation plats réguliers de culture tissulaire
    1. Décongeler les cellules Caco-2 à partir d'un flacon congelé en plaçant le flacon dans un bain d'eau à 37 °, et tout de suite les ajouter à une boîte de culture tissulaire de 10 cm contenant 10 ml de milieu de croissance (sérum bovin fœtal préchauffé à 15% (FBS ) dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)).
      1. Lorsque les cellules Caco-2 ont atteint 50-70% de confluence, les diviser 1: 6 par incubation des cellules avec 3 ml de 0,05% de trypsine / 0,53 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 37 ° C jusqu'à ce qu'ils soient détachés (15 min) . Pour éviter l'agglutination des cellules, mélanger les cellules à plusieurs reprises par pipetage doux. Ajouter 0,5 ml des cellules trypsinisées à une boîte de culture tissulaire de 10 cm contenant 10 ml de milieu de culture préchauffé.
    2. Secouer doucement les plats à plusieurs reprises dans une direction vers l'avant et vers l'arrière suivie d'une direction vers la gauche et vers la droite. Évitez les plats tourbillonnantcar il peut conduire à une dispersion de cellules inégales.
    3. Placez les plats sur une surface plane dans un incubateur à 37 ° de fourni avec 5% de CO 2. Des surfaces inclinées peuvent également résulter en une dispersion de cellules inégales.
    4. Modifiez les milieux de croissance d'une journée après le début de l'incubation.
    5. Surveiller les cellules et enregistrer le jour où ils atteignent la confluence. Il faudra environ 1 semaine pour que les cellules atteignent la confluence de la journée, ils sont divisés.
    6. Changer le milieu de croissance deux fois par semaine avant que les cellules atteignent la confluence. Une fois que les cellules ont atteint la confluence, modifier les milieux de croissance tous les autres jours. Après que les cellules sont 7-jours post-confluentes, changer le milieu de croissance quotidienne.
      Remarque: Les cellules sont prêtes pour les expériences quand ils sont 13 jours post-confluentes (figure 1). Puisque les cellules finiront par devenir moins efficace dans la production de lipoprotéines, utiliser des cellules qui sont entre 13 à 17 jours post-confluentes 8. Passez à l'étape 3 sur la façon de mener l'expérience.
  2. Utilisation du système de membrane perméable
    1. Ensemencer les cellules Caco-2 dans l'insert de membrane perméable tel que décrit à l'étape 1.1.1.1. ci-dessus. Évitez d'utiliser des cellules à partir d'un flacon congelé parce que leur croissance cellulaire est normalement plus lent (période de récupération). En bref, ajouter 0,5 ml des cellules trypsinisées à la chambre apicale (compartiment supérieur) contenant 10 ml de milieu de culture préchauffé. En outre, ajouter 10 ml de milieu de croissance préchauffé à la chambre basolatérale (compartiment inférieur).
      Remarque: Pour la meilleure pratique, ajouter les milieux de croissance à la chambre apicale d'abord, puis à la chambre basolatérale. Lorsque vous retirez les anciens médias, retirez le support basolatérale devant les médias apical. Évitez piquer la membrane de polycarbonate comme il peut rompre la membrane.
    2. En raison de la visibilité de la cellule pauvres à travers la membrane de polycarbonate, ensemencer les cellules Caco-2 dans un plat régulière de culture de tissu avec une densité similaire, et utiliser ce plat de juger de la confluence des cellules.
    3. Suivez steps 1.1.2-1.1.6 ci-dessus.

2. La surexpression Gene

  1. En utilisant l'approche régulière de transfection
    1. Ensemencer les cellules Caco-2 sur une boîte de culture de tissu comme décrit dans 1.1.1.1.-1.1.4 ci-dessus.
      Remarque: Lorsque les cellules sont environ 40-50% de confluence, ils sont prêts à être transfectées.
    2. Ajouter 67 ul du réactif de transfection de 472 ul du milieu de sérum réduit dans un tube de microcentrifugation. Eviter le contact du réactif de transfection non-dilué avec la paroi du tube.
    3. Ajouter 23 pg de pLL3.7 protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) 9 dans le réactif de transfection / réduit mélange des médias de sérum.
    4. Incuber le mélange pendant 20 min à température ambiante.
    5. Remplacer le milieu de croissance des cellules Caco-2 avec 8 ml de 10% de FBS dans du DMEM.
    6. Ajouter le mélange / réactif de transfection d'ADN médias / réduite de sérum goutte à goutte à l'antenne.
    7. Secouer doucement les plats à plusieurs reprises dans un avant et backward direction suivie par une direction vers la gauche et vers la droite.
    8. Placer le plat dans le 37 ° C incubateur.
    9. Remplacez le support dans le plat avec 10 ml de milieu de croissance par jour après le début de l'incubation.
    10. Surveiller l'expression des gènes.
      1. Surveiller l'expression des gènes sans 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). En utilisant un microscope à fluorescence, déterminer le pour cent de cellules qui sont en vert. Le pourcentage représente l'efficacité de transfection.
      2. Surveiller l'expression génique avec DAPI.
        1. Laver les cellules avec une solution saline tamponnée phosphate (PBS) à trois reprises.
        2. Fixer les cellules par addition de 10 ml de formaldehyde à 4% dans du PBS (10 minutes d'incubation à la température ambiante).
        3. Laver les cellules avec du PBS à trois reprises.
        4. Incuber les cellules dans l'obscurité pendant 15 min à température ambiante avec 8 ml de PBS contenant 1 500: 1, DAPI% de BSA, 0,01% de digitonine.
        5. Laver les cellules avec du PBS à trois reprises.
        6. Uchanter un microscope à fluorescence, déterminer le nombre de cellules qui sont vert / bleu par rapport à ceux qui sont bleu (panneau supérieur Figure 2). Le pourcentage calculé représente l'efficacité de transfection.
  2. Utilisation du système de surexpression 10 lentivirus
    1. Seed humaines embryonnaires de rein (HEK), les cellules 293T dans une boîte de culture tissulaire de 15 cm (10% de FBS dans du DMEM que leur milieu de croissance).
      Remarque: Lorsque les cellules sont environ 60-70% de confluence, ils sont prêts à être transfectées.
    2. Ajouter 162 ul de réactif de transfection à 1133 ul de médias de sérum réduit dans un tube de microcentrifugeuse 11. Eviter le contact du réactif de transfection non-dilué avec la paroi du tube.
    3. Ajouter 24 pg de pLL3.7 eGFP (ou un autre produit d'assemblage), 15,6 ug de l'élément de réponse Rev (RRE), 6,0 ug de REV, et 8,4 pg du vésiculeuse glycoprotéine du virus de la stomatite (VSVG) dans le réactif de transfection / réduqué mélange des médias de sérum.
    4. Incuber le mélange pendant 20 min à température ambiante.
    5. Remplacez le support de croissance avec 16 ml de 10% de FBS dans du DMEM.
    6. Ajouter le mélange / réactif de transfection d'ADN médias / réduite de sérum goutte à goutte à l'antenne.
    7. Secouer doucement les plats à plusieurs reprises dans une direction vers l'avant et vers l'arrière suivie d'une direction vers la gauche et vers la droite. Il est normal de voir quelques-unes des cellules HEK293T détachés à ce point.
    8. Placer le plat dans l'incubateur.
    9. Après 24 heures d'incubation, remplacez les médias dans le plat avec 25 ml de milieu de croissance.
    10. Le lendemain, recueillir le milieu de croissance contenant le lentivirus (première collecte).
    11. Répétez l'étape 2.2.10 de recueillir plus de lentivirus (la deuxième collecte).
    12. Mutualiser la première et la deuxième collection, et enlever les débris cellulaires par centrifugation (2500 g pendant 5 min).
    13. Filtrer la collection avec un filtre sur flacon jetable (0,45 um pores), etconcentrer le virus par centrifugation la collection à 31 400 g pendant 2 heures à température ambiante (JA-20 rotor). Marquer le fond du tube de centrifugation où la pastille se trouve. Décanter le surnageant, et de laisser le tube inversé à température ambiante pendant environ 15 min.
    14. Remettre en suspension le culot contenant le virus avec 100 ul de PBS 1X. Éviter les bulles.
    15. Stocker le virus concentrée à -80 ° C. Éviter les cycles de gel-dégel.
    16. Déterminer la quantité optimale de virus nécessaire pour transduire les cellules Caco-2 par titrage. Pour réduire les coûts, utiliser une plaque de 24 puits (0,3 ml de milieu de croissance / puits) à la place d'une boîte de 10 cm de culture de tissus pour le titrage.
      1. Ajouter des quantités croissantes du virus concentré (0, 1, 2, 5, 10, 25, et 50 ul / puits) additionné de polybrène (concentration finale = 5 pg / ml) à 40-70% de la confluence des cellules Caco-2. Agiter la plaque de 24 puits doucement comme décrit dans 1.1.2.
      2. Surveiller l'expression de gène (étape 2.1.10.) (Figure 2 bas4 panneaux).
    17. Étant donné que l'expression de transgène est généralement soutenue, maintenir les cellules transduites pour des expériences futures et surveiller en permanence leur expression des gènes (étape 1.2.10.).

3. Stimuler la sécrétion des lipoprotéines

  1. Utilisation de la boîte de culture de tissu régulière
    1. Préparer un mélange lipidique par mélange 100X 50 mg d'acide oléique, 40 mg de lécithine et 48 mg de taurocholate de sodium. Porter le volume à 900 pl avec du PBS (suffisant pour 8 plats). Vortexer le mélange lipidique vigoureusement.
    2. Ajouter 900 ul du mélange lipidique 100X dans 89,1 ml de milieu de croissance. Mélanger et filtrer les médias contenant des lipides. Les concentrations finales (1 x) d'acide oléique, la lécithine, et le taurocholate de sodium sont de 2,0 mM, 1,36 mM et 1,0 mM, respectivement.
    3. Ajouter 10 ml d'un milieu contenant le lipide aux cellules.
    4. Incuber les cellules avec le support contenant des lipides pendant 4 heures dans un 37° C incubateur.
    5. Laver les cellules avec du PBS à trois reprises.
    6. Ajouter 10 ml de milieu de croissance pour les cellules afin de recueillir la sécrétion des lipoprotéines.
    7. Incuber pendant 2 heures dans un incubateur à 37 ° C.
    8. Recueillir les médias contenant des lipoprotéines.
  2. Utilisation du système de membrane perméable
    1. Suivre les étapes 3.1.1-3.1.2 pour préparer le mélange de lipides.
    2. Ajouter 10 ml d'un milieu contenant le lipide à la chambre apicale et 10 ml du milieu de culture à la chambre basolatérale.
    3. Incuber pendant 4 heures dans un incubateur à 37 ° C. Recueillir les médias contenant des lipoprotéines dans la chambre basolatérale.

4. Isolement des lipoprotéines (Figure 3)

  1. Retirer les débris cellulaires à partir du support contenant des lipoprotéines par centrifugation (2000 xg pendant 5 min).
  2. Décanter les médias dans un tube de 50 ml.
  3. Ajouter 5,95 g de chlorure de sodium pour les médias.
  4. Si le SAmple sera analysée par le TEM, ajouter une protéase tablette de cocktail inhibiteur de maintenir l'intégrité des lipoprotéines.
  5. Porter le volume à 23 ml avec de l'eau (1,2 g / ml de solution de NaCl densité).
  6. Dissoudre les solutés complètement.
  7. Décanter la totalité de la solution dans un tube d'ultracentrifugation polycarbonate.
  8. Superposer délicatement la solution de densité de 1,2 g / ml avec 0,5 ml d'eau (1,0 g / ml densité).
  9. Équilibrer le tube en poids et pas en volume.
  10. Charger doucement les tubes dans le rotor de T865.
  11. Faites tourner les échantillons dans l'ultracentrifugation à 429 460 g pendant 24 heures à 4 ° C.
  12. Immédiatement isoler le top 0,5 ml de solution par pipetage doux. Garder le tube aussi immobile que possible.

5. Analyse TEM

  1. Préparer 5 ml d'acide phosphotungstique 2% (p / v) et ajuster le pH à 6,0.
  2. Filtrer l'acide phosphotungstique à 2% d'un filtre à seringue (taille des pores: 0,2 um).
  3. Déposer 20 ul de l'échantillon de lipoprotéine sur un plat stérile.
  4. Déposer 20 ul de l'acide phosphotungstique à 2% filtrée à côté de l'échantillon sur le même plat.
  5. Laissez tomber doucement une grille d'EM avec le côté mat reposant sur l'échantillon.
  6. Incuber à température ambiante pendant 1 min.
  7. Tapoter doucement le côté de la grille EM sur un papier filtre pour retirer l'échantillon de la grille.
  8. Laissez tomber doucement la grille de EM avec le côté mat reposant sur l'acide phosphotungstique à 2%.
  9. Incuber à température ambiante pendant 1 min.
  10. Tapoter doucement le côté de la grille EM sur un papier filtre pour éliminer l'acide phosphotungstique de la grille.
  11. Utilisation d'un TEM, capturer les images des lipoprotéines (figure 4).

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Résultats

Figure 1 affiche post-confluentes cellules Caco-2 normales de 13 jours. L'apparition de structures en forme de dôme et des gouttelettes lipidiques intracellulaires sont caractéristiques de Caco-2 différenciées des cellules. Lorsque les cellules Caco-2 ne sont pas dispersés aussi pendant les semis, ils vont agglutiner et proliférer dans certaines zones du plat; et il y aura quelques zones dans le plat sans cellules. Tourbillonnement et en plaçant le plat sur une surface inclinée doit être évitée. Il ...

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Discussion

Dans ce document, les deux systèmes qui peuvent être utilisés pour maintenir les cellules Caco-2 sont décrits, à savoir, la boîte de culture de tissu normal et la membrane perméable. Les avantages de l'utilisation du système de membrane perméable comprend la séparation de la apical et basolatéral des compartiments, et la capacité à incuber le mélange de lipides et de recueillir la sécrétion des lipoprotéines en même temps. Cependant, les inserts de membrane perméable sont chers, et leur membrane en polycarbonate ne ...

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Déclarations de divulgation

L’auteur n’a rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Seed Grant Award du California Northstate University College of Pharmacy (à AMN). Les auteurs tiennent à remercier le California Northstate University College of Pharmacy d’avoir couvert les frais de publication de cet article, et George Talbott pour son aide dans la révision de ce manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEMVWR16750-112Préchauffez le milieu de croissance dans une boîte de culture tissulaire individuelle avant d’ajouter
des cellules FBSFisher3600511Nous n’inactivons pas à la chaleur notre sérum
TrypsineVWR45000-660Les cellules peuvent être lavées avec du PBS avant le traitement à la trypsine.
Système de membrane perméableFisher7200173Boîte de 10 cm, taille des pores de 3 mm, membrane en polycarbonate
Boîte de 10 cmFisher08-772-EBoîte de culture tissulaire
15 cmFisher08-772-24Boîte de culture tissulaire Plaque de culture tissulaire
24 puitsFisher12565163Plaque de culture tissulaire
Réactif de transfection à base de lipidesFisherPRE2691Peut être remplacé par un autre réactif de transfection
Milieu sérique réduitInvitrogen11058021Pour la transfection
pLL3.7 eGFPAddgene11795https://www.addgene.org/11795/
Filtre pour bouteilleFisher9761120pores de 0,45 mm
PolybreneFisherNC984045410 mg/ml
d’acide oléiqueSigma01383-5GPrévenir le cycle de gel-dégel
LécithineFisherIC10214625Lécithine d’œuf  ;
Taurocholate de sodiumFisherNC9620276Produit abandonné ; numéro de catalogue alternatif : 50-121-7956
Comprimé cocktail inhibiteur de protéase (sans EDTA)Fisher5892791001Utilisé principalement pour les échantillons nécessitant une analyse TEM
Tube ultracentrifuge en polycarbonateFisherNC9696153Le réutiliser plusieurs fois fera s’effondrer le tube
Couvercle pour tube ultracentrifugeFisherNC9796914Un outil est nécessaire pour retirer le tube/couvercle du rotor
SeringueFisher50-949-261Filtre à
seringueFisher09-719CTaille des pores = 0,2 mm ; nylon
Acide phosphotungstiqueFisherAC208310250Pour préparer de l’acide phosphotungstique à 2 %, pH 6,0
Pince à épilerFisher50-238-62Extra fine et pointes fortes
Formvar/grille carboneFisher50-260-34Formvar/grille carrée en film carbone 400 Cuivre
de jetable

Références

  1. Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).
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