Une méthode informatisée reproductible pour la quantification de la densité capillaire utilisant périunguéale capillaroscopie

Summary

La capillaroscopie est une méthodologie non invasive, efficace, relativement peu coûteuse et facile à apprendre pour visualiser directement les capillaires dans la microcirculation. Cependant, une seule publication à ce jour décrit la fiabilité d’un logiciel complexe disponible pour quantifier les données de capillaroscopie. Nous présentons ici un protocole simple et fiable pour quantifier les capillaires à l’aide d’un algorithme standardisé.

Abstract

Capillaroscopie est une méthode non-invasive, efficace, relativement peu coûteux et facile à apprendre pour visualiser directement la microcirculation. La technique de capillaroscopie peut donner un aperçu de microvasculaire la santé d'un patient, conduisant à une variété de dermatologique potentiellement précieux, ophtalmologique, les applications cliniques rhumatologiques et cardiovasculaires. En outre, la croissance tumorale peut être dépendante de l'angiogenèse, qui peut être quantifiée par la mesure de la densité des microvaisseaux dans la tumeur. Cependant, il est actuellement peu ou pas de standardisation des techniques, et une seule publication à ce jour signale la fiabilité d'un algorithmes actuellement disponibles, complexes basés ordinateur pour quantifier des données de capillaroscopie. ¹ Ce document décrit un nouveau, plus simple, fiable, capillaire standardisé comptage algorithme pour quantifier les données de capillaroscopie périunguéale. Un algorithme simple, reproductible informatisée capillaroscopie comme cela faciliterait plusutilisation généralisée de la technique entre les chercheurs et les cliniciens. De nombreux chercheurs analysent actuellement les images capillaroscopie à la main, la promotion de la fatigue de l'utilisateur et de la subjectivité des résultats. Ce document décrit un roman, facile à utiliser automatisé algorithme de traitement d'image en plus, un algorithme de comptage semi-automatisé reproductible. Cet algorithme permet l'analyse d'images en quelques minutes tout en réduisant la subjectivité; seulement une quantité minimale de temps de formation (dans notre expérience, moins de 1 h) est nécessaire pour apprendre la technique.

Introduction

Imagerie microvasculaire est un domaine en pleine expansion avec de nombreuses applications cliniques potentielles. ² Par exemple, les oncologues utilisent l'imagerie des microvaisseaux pour déterminer l'étendue de l'angiogenèse tumorale, ce qui donne de précieuses informations concernant l'état de la tumeur et la perspicacité dans les options de traitement possibles. ^{3 4} Cependant, périunguéale capillaroscopie est peut-être le coût forme la plus efficace et largement applicable de l'imagerie microvasculaire. Les chercheurs utilisent la vidéo périunguéale capillaroscopie pour étudier les débits sanguins et d'enquêter sur la morphologie capillaire. ^{5 6} fois la vidéo et les images fixes, capillaroscopie périunguéale sont adjoints aux soins pour le diagnostic et le traitement des maladies du tissu conjonctif phénomène et divers de Raynaud comme la sclérose systémique. ²

Capillaroscopie périunguéale a diverses applications cardiovasculaires potentiels ainsi. La recherche actuelle en utilisant périunguéale capillaroscopie suggèreque diabète sucré de type 1 et de type 2 patients présentent une prévalence élevée de la morphologie capillaire anormale, mais ont des densités capillaires inchangé par rapport aux personnes non-diabétiques. ^7-8 capillaroscopie a également été étudié expérimentalement dans l'hypertension. Structurelle raréfaction capillaire conduisant à une densité capillaire réduite a été démontrée chez les personnes hypertendues par rapport aux individus non-hypertendus. ^9-10 Contrairement à ces patients hypertendus âgés (âge moyen 40 ans et plus) qui présentent la raréfaction structurelle, des recherches plus récentes ont démontré que patients hypertendus plus jeunes (moyenne âge de moins de 40 ans) ont raréfaction fonctionnel sans raréfaction structurelle. ¹¹ Ceci suggère que la raréfaction fonctionnelle se produit avant et peut évoluer au fil du temps à la raréfaction structurelle.

Fait intéressant, les patients hypertendus traités avec des médicaments antihypertenseurs spécifiques tels que perindopril / indapamide affiché normedensité al capillaire et la fonction endothéliale après le traitement, tandis que ceux traités avec ACE (angiotensin l'enzyme de conversion) des inhibiteurs ou des diurétiques maintenu une densité capillaire faible malgré le contrôle de la pression artérielle comparable. ¹² Ceci suggère que certains médicaments anti-hypertenseurs peuvent normaliser la densité capillaire en inversant le tube capillaire raréfaction provoquée par l'hypertension. En outre, d'autres chercheurs ont montré que la réduction de la consommation de sel conduit à l'inversion de deux raréfaction capillaire fonctionnelle et structurale chez les personnes hypertendues ^13.

Malgré les diverses applications cliniques potentielles de cette technologie, il ya peu de standardisation de la technique pour quantifier images de densité capillaire. ² A ce jour, les chercheurs ont constaté que les résultats de la densité capillaire sont reproductibles à la fois intra-observateur et inter-observateur perspective que si l'exacte même zone est compté à chaque fois. ^{15 1,14} Fait à noter, les chercheurs précédents ont largement effectué chiffres capillaires manuellement en utilisant l'œil nu, ^{9 16 17 18} qui est un processus lent et subjective.

, Sur la base des algorithmes informatiques standardisés pour la quantification des images capillaires offrent théoriquement analyse de données plus efficace et reproductible avec moins de subjectivité, de faciliter les applications cliniques de capillaroscopie. Certains chercheurs ont en effet utilisé des programmes informatiques pour quantifier les données de périunguéale photos capillaroscopiques. ^{1,6 19 20} Toutefois, une seule publication à ce jour décrit la fiabilité d'un logiciel complexe disponibles pour quantifier les données de capillaroscopie, ^{1 et} ce programme est compliqué comme précédemment noté ci-dessus par l'obligation de compter le même champ visuel exacte. Ici, nous présentons, un protocole simple fiables pour quantifier capillaires en utilisant un algorithme standardisé qui permet del'utilisation de plusieurs champs visuels. L'utilisation de plusieurs champs visuels non seulement simplifie la procédure, mais permet également à l'évaluation de la variation biologique normale du nombre de capillaires.

Le but de cette étude est de décrire un algorithme basé sur ordinateur reproductible et efficace qui normalise le processus de quantification capillaire. Bien que ces méthodes ne sont pas entièrement automatisés, ils nécessitent très peu d'entrée de l'utilisateur, et fournissent une quantification fiable et rapide des photos.

Protocol

Remarque: Le processus d'acquisition pour obtenir des images capillaires a déjà été publié et est réalisée en utilisant un appareil photo numérique avec un programme informatique d'acquisition et d'analyse d'image correspondante ^{11 21} Ce laboratoire utilise des images fixes pour l'analyse, pas les vidéos, ce qui simplifie l'acquisition d'image pour l'analyse.. Ce qui suit décrit la nouvelle technique pour quantifier les capillaires à partir des images.

1. Amélioration de l'image processus

1. Obtenir des images numériques avec un appareil photo numérique monochrome. Calibrer les images à un objet de taille connue en prenant une photo d'un objet de longueur connue comme une règle avec l'appareil photo. Ce processus permet au programme d'ordinateur pour mesurer et compter capillaires précision après traitement. Idéalement pour la plus haute précision, un réticule (pièce scientifiquement fabriqué en verre avec une règle gravée en elle) devrait être utilisé. Mesurer le nombre de pixels dans un carré de 1 mmboîte à l'aide d'un programme informatique.
   Remarque: La clé de la reproductibilité et de la normalisation de ce protocole dépend largement de placement correct de la boîte de 1 mm ² qui est compté.
2. Utilisez des outils d'amélioration de contraste pour assombrir les capillaires et éclaircir le fond, ce qui permettra de maximiser la visualisation des capillaires. Différenciation initiale de capillaires de fond est important pour le bon recadrage de l'image dans les étapes ultérieures. Pour ce faire, réglage de l'image en utilisant un Pour ce faire, cliquez sur "meilleure histogramme ajustement.": La capture, de l'intensité, histogramme de l'image, meilleur ajustement.
3. Cadrer une région d'intérêt (ROI) pour capillaire comptage comme une nouvelle image (sélectionner, régions d'intérêt). Utilisez une boîte de 1 mm ^2, qui a été déterminé par l'étalonnage des images à 530 pixels équivalant à 1 mm. vérifier que l'image recadrée place au sommet des boucles capillaires tout en haut de l'image.
4. Aplatir l'image de sorte que tous les futurs ajustements d'image seront appliqués uniformémentl'image. Pour ce faire, cliquez sur: onglet processus, filtres 2D, aplatir, l'intensité de BG "brillant", la largeur de l'objet à "75," applique.
5. Augmenter le contraste de l'image afin capillaires sont visualisés au maximum. Pour ce faire, cliquez sur: ajuster onglet, affichage, augmenter le contraste à 75.
6. Dépoussiérer l'image pour lisser les bords des capillaires en cliquant sur l'onglet processus, filtres 2D, déparasitage, la taille du noyau 7 x 7, appliquer.
7. Finaliser le contraste de l'image afin capillaires sont le noir et le fond est blanc. Effectuez cette étape en ajustant l'histogramme pour le modèle "meilleur ajustement".
   Note: S'il vous plaît se référer à la figure 2 en résultats représentatifs pour un exemple de ce que l'image traitée devrait ressembler suivant ces étapes.

2. Exécution comtes capillaires / quantification capillaire Densité

1. Sur chaque image, sélectionner manuellement une partie d'un capillaire bien définie en utilisant la featur "objet cible"e d'être reconnu comme objets à compter par le programme. Ensuite, sélectionnez une petite partie du fond, en utilisant la fonction «de fond», comme une référence à des zones qui doivent être ignorés par l'algorithme de comptage.
   Remarque: La combinaison de ces faits saillants provoque tous les capillaires à être mis en évidence en faisant abstraction du bruit de fond. La quantification (comptage) protocole utilise les fonctions informatiques de différencier parties de l'image basée sur la couleur et la morphologie.
2. Utilisez la fonction de comptage pour compter instantanément tous les capillaires dans l'image avec l'équipement d'imagerie. Réglez le diamètre minimum d'objets comptés à 5 pixels afin d'éviter de compter le bruit de fond que les capillaires.
3. Pour chaque individu, compter le moyenne de 3 - 4 images afin d'obtenir une évaluation plus fiable.
   Note: S'il vous plaît se référer à la figure 3 dans Les résultats représentatifs pour un exemple de ce que l'image devrait ressembler au cours de la procédure de comptage.

3. Création et utilisation de macros pour automatiser le traitement de l'image

Remarque: Pour gagner du temps, les macros peuvent être créées afin d'effectuer automatiquement une séquence spécifique des processus sur une ou plusieurs images. Ces séquences peuvent être personnalisés afin de rendre les modifications de l'image rapide. En substance, ces macros se rappeler comment les images sont traitées, et d'effectuer toutes les étapes rapidement et sans intervention de l'utilisateur. Performing compte sur 12 images capillaires prend ce laboratoire entre 20 à 30 min avec les macros (2 à 3 min par image), par opposition à environ 8 min par image sans les macros. Par conséquent en utilisant les macros est de 3 à 5 fois plus efficace que le traitement manuellement chaque image individuelle.

1. Afin de créer une macro, sélectionnez "Enregistrer une macro" et sur une image effectuent les étapes et les processus désirés, comme décrit dans les étapes 1 et 2 ci-dessus. Nom de la macro sur la base duquel le traitement d'image étapes ont été réalisées pour référence future. Lorsque using la macro sur les images futures, cliquez simplement sur "macro run" et le programme va appliquer automatiquement les améliorations enregistrées à l'image (s) souhaitée.
   Note: Ce laboratoire utilise une macro pour effectuer tous, mais l'une des étapes de la Section 1 des méthodes en quelques secondes. La seule étape qui nécessite une entrée de l'utilisateur est de choisir où pour recadrer l'image, l'étape 1.2.

Results

L'objectif de cette procédure de traitement d'image est de différencier les capillaires de l'image d'arrière-plan de sorte qu'ils peuvent être quantifiés avec précision. Tant de traitement d'image incomplète et traitement d'image excessive nuisent à la capacité du programme à quantifier les capillaires. Comme on le voit sur ​​la figure 3, le traitement d'image effectue les capillaires incomplet difficile à distinguer de l'arrière-plan. Il est essentiel que l'utilisateur soit capable de ...

Discussion

Capillaroscopie périunguéale montre promesse comme un outil clinique utile à l'avenir pour diverses oncologie, cardiovasculaire, et les applications de maladies rhumatologiques. Le processus d'acquisition d'image est assez uniforme entre les chercheurs, mais il ya actuellement plusieurs méthodes pour le traitement et l'analyse d'images. Méthodes comprennent actuellement comptages manuels et informatisés capillaires. Des comptages manuels sont problématiques car ils prennent du temps, et sous réserve ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Image-Pro Premier	Media Cybernetics, Inc	9.1	Logiciel de traitement d’image