La microrhéologie de suivi des particules étudie la viscoélasticité des matériaux. Ici, la technique est utilisée pour déterminer la viscoélasticité, la conformité au fluage et les rôles de réticulation efficaces de différents composants matriciels d’un biofilm bactérien. La matrice est constituée de substances polymères sécrétées par les bactéries et ses composants déterminent la structure du biofilm et les propriétés mécaniques.
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Article de méthode
En cartographie in situ des propriétés mécaniques des biofilms par Microrhéologie de particules de suivi
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules bactériennes sont capables de former des communautés de biofilms attachées à la surface, appelées biofilms, en s’enfermant dans des substances polymères extracellulaires (EPS). L’EPS sert d’échafaudage physique et protecteur qui abrite les cellules bactériennes et se compose d’une variété de matériaux, notamment des protéines, des exopolysaccharides et de l’ADN. La composition de l’EPS peut changer, ce qui remodèle les propriétés mécaniques du biofilm pour développer ou soutenir d’autres structures de biofilm, telles que des serpentins, en réponse à des signaux environnementaux. Malgré cela, il existe peu de descriptions quantitatives sur la façon dont les composants EPS contribuent aux propriétés mécaniques et à la fonction des biofilms. La rhéologie, c’est-à-dire l’étude de l’écoulement de la matière, revêt une importance particulière pour les biofilms, car de nombreux biofilms se développent dans des conditions d’écoulement et sont constamment exposés à des contraintes de cisaillement. Il fournit également des mesures et des informations sur l’étalement du biofilm sur une surface. Ici, la microrhéologie de suivi des particules est utilisée pour examiner la viscoélasticité et les rôles de réticulation efficaces de différents composants de la matrice dans diverses parties du biofilm au cours du développement. Cette approche permet aux chercheurs de mesurer les propriétés mécaniques des biofilms à l’échelle microscopique, ce qui pourrait fournir des informations utiles pour le contrôle et l’ingénierie des biofilms.
Introduction
La plupart des cellules bactériennes sont en mesure d'employer planctoniques (sans vie) et (sessiles) modes de croissance de 1 attaché de surface. Dans le mode de croissance fixé en surface, les cellules bactériennes sécrètent et se envelopper dans de grandes quantités de substances polymériques extracellulaires (EPS) à former des biofilms. Les EPS se compose principalement de protéines, de l'ADN, exopolysaccharide extracellulaire et est essentielle à la formation de biofilm 2. Il sert d'échafaudage physique par lequel les bactéries peuvent utiliser pour différencier spatialement et protège les bactéries de conditions environnementales nuisibles et les réponses de l'hôte. Différents composants de l'EPS ont des rôles distincts dans la formation de biofilm 3 et les changements dans l'expression des composants EPS peut considérablement remodeler les structures de biofilm 4. Composants EPS peuvent également fonctionner comme des molécules de signalisation 5, et des études récentes ont montré certains composants EPS qui interagissent avec des cellules microbiennes pour guider leurs diff de migration et de biofilmérentiation 6-8.
La recherche sur l'EPS a considérablement avancé, basé sur les analyses morphologiques des biofilms produites par mutants défectueux dans un composant spécifique des EPS 9,10. En outre, l'EPS est généralement caractérisée à la macro-échelle (caractérisation vrac) 11. Morphologique analyse ne peut cependant manquer de précision quantitative et la caractérisation vrac, qui retourne des valeurs moyennes, perd le détail qui existe au sein de l'hétérogénéité du biofilm. Il ya maintenant une tendance croissante à progresser à la caractérisation en temps réel des propriétés mécaniques des EPS à la micro-échelle. Ce protocole montre comment particule de suivi microrhéologie est capable de déterminer les effets spatio-temporelle des composants de la matrice et des exopolysaccharides Pel Psl sur la viscoélasticité et la réticulation efficace de biofilms de Pseudomonas aeruginosa 4.
Microrhéologie passive est une rh simple et peu coûteuxméthode de eology qui fournit le plus haut débit de l'échantillonnage microrhéologiques spatiale d'un matériau à ce jour 12,13. Dans microrhéologie passif, des sphères de sondes sont placés dans l'échantillon et leur mouvement brownien, grâce à des énergies thermiques (k B T) est suivie par microscopie vidéo. Plusieurs particules peuvent être suivis en même temps, et les coordonnées dépendantes du temps des particules suivent une marche aléatoire classique. Par conséquent, en moyenne, les particules restent à la même position. Cependant, l'écart-type des déplacements ou le déplacement quadratique moyenne (MSD) des particules, est non nulle. Depuis fluides visqueux coulent, la particule MSD dans un fluide visqueux croît linéairement avec le temps. Par contre, la réticulation polymérique viscoélastique trouve dans ou substances élastiques aider à résister à l'écoulement, et les particules deviennent limitées dans leur déplacement, ce qui conduit à des plateaux de la courbe MSD (figure 1A). Cette observation suit la relation MSDαt α, où α est l'exposant de diffusion qui est le rapport des contributions élastiques et visqueuses de la substance liée. Pour les particules se déplaçant dans des fluides visqueux a = 1, en des substances viscoélastiques 0 <α <1, et dans des matières élastiques α = 0. Le TMS peut également être utilisée pour calculer la compliance de fluage, qui est la tendance du matériau à se déformer de manière permanente sur Estimation du temps et avec quelle facilité les écarts matériels.
La chimie taille, la densité et la surface de la particule sont essentiels à l'application correcte de l'expérience microrhéologiques et sont choisis par rapport au système étudié (dans ce cas, les polymères de la matrice du biofilm, voir figure 1B). Tout d'abord, la mesure de la rhéologie des particules de la substance avec des structures qui sont beaucoup plus petites que la particule elle-même. Si les structures de la substance sont d'ampleur similaire à la particule, le mouvement de la nominaleticle est perturbé par la forme et l'orientation des structures individuelles. Toutefois, si les structures environnantes de la particule sont beaucoup plus petits, cet effet est faible et moyenne, à présenter un environnement homogène à la particule (figure 1B). D'autre part, la densité de la particule doit être similaire à la moyenne (1,05 g ml -1 pour les médiums à base d'eau) de manière que la sédimentation est évitée et les forces d'inertie sont négligeables. La plupart des particules avec treillis polystyrène répondent aux critères ci-dessus. Idéalement, la particule ne pas interagir avec les polymères de la matrice du biofilm que l'interprétation rhéologique de MSD de particules est valable uniquement si le mouvement est aléatoire, entraînée par l'énergie thermique et de collision avec les structures de la substance. Ceci peut être observé en vérifiant si la particule sonde tend à lier ou rebondir sur la surface d'un biofilm pré-adulte. Toutefois, malgré le manque d'attirance pour le biofilm, les particules doivent pouvoir être incorporés dans la matrice.De plus, l'hétérogénéité physico-chimique du biofilm peut se traduire par des particules différentes étant mieux adaptée en tant que sondes dans les différentes régions du biofilm. Ainsi, des particules de différentes tailles et la chimie de surface devraient être appliqués au biofilm.
En tant que tel, le MSD particule est en mesure de fournir des informations utiles sur la façon dont différents composants contribuent à la rhéologie et la propagation du biofilm. En outre, l'utilisation de différentes sondes permet d'obtenir des informations sur l'hétérogénéité spatiale physico-chimique du biofilm. Ce procédé peut être utilisé pour tester l'effet d'un traitement antimicrobien sur les propriétés mécaniques du biofilm, ou appliqué sur les biofilms d'espèces mélangées pour étudier la façon dont les propriétés mécaniques du film biologique sont modifiés à partir de l'introduction d'une autre espèce. Particules TMS peut aussi être utile pour la caractérisation de la dispersion du biofilm. Ces études seraient utiles dans notre compréhension des biofilms, potentiellement améliorer les traitements des biofilms une génie des biofilms pour des activités utiles.
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Protocole
1. biofilm Culture
- Préparation de Souches bactériennes
- 1 jour avant la culture du biofilm, préparer des cultures bactériennes planctoniques par inoculation de 2 ml de milieu de croissance approprié de culture bactérienne congelé. Utilisez milieu Luria-Broth (10 g L -1 NaCl, 10 g d'extrait de levure L -1, et 10 g L -1 tryptone) pour mucoïde P. aeruginosa et ses Δ pel et Δ PSL mutants défectueux. Incuber une nuit à 37 ° C et 200 rpm conditions secouant. Diluer cultures d'une nuit à une DO 600 de 0,40 à l'aide d'un spectrophotomètre.
- Assembler configuration de cellule d'écoulement, ce qui a été décrit précédemment 14, de préférence sur une station ou un chariot mobile qui peut être amené dans la chambre de microscope pour l'imagerie de la cellule d'écoulement sans démontage.
- Préparer un milieu de croissance stérile dans L 2 ou L 5 bouteilles pour chaque cellule d'écoulement. Utilisez milieu minimal M9 (48 mM Na 2 HPO 4, 22 mMKH 2 PO 4, 19 mM de NH 4 Cl, NaCl 9 mM, 2 mM de MgSO 4, et 0,1 mM de CaCl2) supplémenté avec 0,04% de glucose (poids / volume) et 0,2% (poids / volume) casaminoacides) pour P. aeruginosa biofilms flux de cellules.
- Microsphères fluorescentes aliquote dans des microtubes et filent dans H 2 O stérile pendant 5 min dans la centrifugeuse à 9,391.2 g. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 1 ml de milieu de croissance pour supprimer l'azide de sodium (désinfectant) avant d'ajouter à un milieu de croissance dans 2 L ou L 5 bouteilles de taille.
NOTE: Différentes tailles de microsphères viennent dans différentes concentrations et doivent être dilués en conséquence les instructions. Par exemple, disperser 120 ul de 1,0 um microsphères de diamètre, 15 ul de 0,5 um microsphères de diamètre et 0,96 pi de 0,2 um microsphères de diamètre dans 2 L de milieu de croissance pour donner 2,18 × 10 6 microsphères ml -1 pour chaque taille de particule. - Fixer la bouteille moyenne à UPSTrame de cellule d'écoulement et permettre milieu de croissance de circuler à travers toute l'installation. Arrêter l'écoulement et injecter cultures de la nuit dilué dans des chambres de la cellule d'écoulement. Permettre aux bactéries de se fixer au substrat de lamelle couvre-objet pendant 1 heure avant de continuer l'écoulement de milieu de croissance à un taux d'environ 5,5 x 10 -3 m s -1, ou 8 tours par minute avec une pompe péristaltique écoulement.
NOTE: Les biofilms sont généralement cultivées à la température ambiante (25 ° C) pendant 3-7 jours. - En variante, pour la configuration de culture statique, diluer 100 fois cultures d'une nuit dans des tubes de microcentrifugation en ajoutant 10 ul d'une culture d'une nuit de milieu de croissance ml de particules. Augmenter la concentration des particules dans le milieu de croissance de culture statique d'environ 500 fois par rapport à celle utilisée pour les films biologiques d'écoulement (par exemple, laver et remettre en suspension 600 ul de 1,0 um sphères d'un diamètre dans 10 ml de milieu de croissance) comme biofilms de cellules d'écoulement sont constamment réapprovisionné avec particules, mais les cultures ne sont pas statiques.
- Ajouter 2001; l de culture de nuit diluée avec des particules dans les chambres de 8 diapositives ainsi. Incuber à 37 ° C dans des conditions statiques. Les biofilms sont généralement cultivées pendant 1 nuit. Remplacer milieu de croissance journalier passé avec le milieu de croissance frais avec des particules si biofilm est cultivée pour plus de 1 jour.
2. Microscopie
- Le jour 3 et 5, éteignez débit de la pompe péristaltique et mettre la configuration de la cellule d'écoulement dans la salle de microscopie. Tube de serrage près de l'entrée et la sortie des chambres de cellules de flux pour éviter la dérive (une cause d'erreur systématique par des changements dans l'environnement) de flux. Placer la cellule d'écoulement sur la platine du microscope de un microscope droit.
REMARQUE: Utilisez un microscope inversé pour l'imagerie de micropuits. - Utilisez la microscopie à fluorescence avec 40X objectif d'huile de prendre des vidéos du mouvement de microsphères embarqués dans le biofilm à divers endroits (microcolonies et couches indifférenciées plat) et à des jours différents (jour 3 et 5) pourenquêtes temporelles et spatiales. Prenez des vidéos courtes avec un taux de trame plus élevée pour enquêter sur les événements qui se produisent au sein de courtes échelles de temps (par exemple 1,5-3 min vidéos à taux de 25-50 images par seconde pour la dynamique rapide de trame), et des vidéos plus longues avec un taux de cadre inférieur pour enquêter sur les événements de plus de plus de temps échelles (par exemple des vidéos de 15-30 min à taux de 2,5-5 images / sec pour une dynamique plus lente cadre).
NOTE: Une vidéo contient généralement 5-10 particules, et est typiquement de 1,0-2,5 Go en taille de fichier. Grandes microcolonies peuvent détenir plus de particules. Prenez 5-10 vidéos pour chaque catégorie (par exemple 5-10 vidéos de différents microcolonies et de différents endroits dans les couches plates indifférenciées). Le biofilm a une architecture hétérogène qui peut consister en microcolonies, des canaux, des vides et des couches plates indifférenciées. - Enregistrer des vidéos en format approprié qui peut être lu par les Fidji / ImageJ (par exemple CZI, TIF).
- Vérifiez vidéos pour la dérive en faisant défiler vid finieo et en observant que les particules ne se déplacent pas dans le même sens en même temps. La dérive peut être provoquée par le mouvement z-étape, les courants dans la cellule d'écoulement, le déséquilibre de table anti-vibration, pression d'air ou des variations de température. Corriger mineure à la dérive en utilisant des techniques de post-traitement généralement fournis avec le logiciel de microscope. Jeter toutes les vidéos dans lequel la dérive ne peut pas être corrigée. Enregistrer les paramètres suivants, qui sont nécessaires lors de repérage et d'analyse de particules: Résolution (px / um), Number of Frames, Durée.
- Retirez la cellule de flux de platine du microscope et de redémarrer la pompe péristaltique continuer à cultiver le biofilm.
3. particules repérage et d'analyse
- Obtenir les trajectoires des particules en utilisant le plug-in TrackMate dans les logiciels open source (ImageJ). Télécharger Fidji au http://fiji.sc/Fiji. Ouvrez la vidéo avec les Fidji et sous le menu Plugins, sélectionnez Suivi et TrackMate.
- Vérifiez et ajustez les paramètres dans THfenêtre e suggérant réglages initiaux d'étalonnage pour correspondre aux paramètres vidéo comme enregistré dans l'étape 2.4.
- Détecter des particules dans TrackMate utilisant ImageJ.
- Sélectionnez 'détecteur Log', le diamètre des particules d'entrée et la valeur de seuil (par exemple 1000). Faites défiler la vidéo tout en cliquant sur le bouton Aperçu pour vérifier que les cercles pourpres suivent les particules tout au long de la vidéo. Ajustez les valeurs de diamètre et de seuil que nécessaire: augmenter la valeur de seuil si cercles pourpres apparaissent dans l'espace vide. Réduire la valeur de seuil si pas assez de particules sont détectées. Cliquez sur le bouton Suivant pour terminer la détection des particules.
- Cliquez sur le bouton à côté lorsqu'ils sont présentés avec la possibilité d'ajouter ou de retirer les particules détectées dans «seuil initial», «Choisissez une vue 'et' sélectionner un filtre« fenêtres de continuer sans ajustement si la détection de particule initiale était satisfaisante.
- Sélectionnez 'LAP Tracker Simple' dans le optisur la barre de «Sélectionnez une méthode de suivi" fenêtre particules se déplacent rarement de mise au point dans le biofilm et sont facilement suivis. Utilisez les valeurs de distance max suggéré ou faible liaison et de l'écart à la clôture, et cliquez sur suivant.
- Vérifiez que le suivi de particules est satisfaisante en faisant défiler la vidéo pour voir ce que les particules suivent les pistes tracées par TrackMate, et qu'il n'y a pas de pistes non désirées ou manquants. Passer les différentes étapes de filtrage. Aller à la dernière fenêtre «Sélectionner une action». Sélectionnez 'pistes Exporter vers un fichier xml' du menu déroulant et cliquez sur «Exécuter». Choisissez un dossier pour enregistrer les pistes.
NOTE: Il existe divers programmes disponibles dans le domaine public pour l'analyse des trajectoires des particules et de l'utilisation des microrhéologie. msdanalyzer et TrackArt sont des exemples de suivi des particules programmes d'analyse qui fonctionnent dans l'environnement Matlab.
- Préparer Matlab pour importer les trajectoires des particules dans les fichiers xml en sélectionnant dans le menu deMatlab Fichier> Définir le chemin ... et ajoutez les scripts dossier disponible avec le paquet Fidji.
- Pour analyser les trajectoires des particules avec msdanalyzer, le lien pour télécharger le fichier zip ou le fichier tar.gz at http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories .
- Extraire le dossiermsdanalyzer 15 et déposez-le dans un dossier qui appartient à la trajectoire Matlab (par exemple C: Documents and Settings Mes Documents Matlab). Commencez Matlab et de lancer l'analyseur en tapant:
MA = msdanalyzer (2, «euh», «sec»)
où um et sec sont les unités de temps et d'espace physique dans la vidéo.- Importez les trajectoires des particules en tapant:
[pistes, MD] = importTrackMateTracks ('filename.xml', 'CLIPZ';, 'Scalet')
MA = ma.addAll (pistes);
où «CLIPZ 'supprime la dimension z une vidéo 2D, et' scalet '. - Tracer les trajectoires ONTO graphique à l'aide:
ma.plotTracks;
ma.labelPlotTracks; - Calculer les TMS des particules à l'aide:
MA = ma.computeMSD;
ma.msd - Tracer les TMS de chaque particule:
figure
ma.plotMSD - Combinez les trajectoires des particules d'autres vidéos du même categery (par exemple des particules intégrées dans microcolonies de type sauvage au jour 3) en répétant 3.5.1.1 à 3.5.1.4).
- Tracer la moyenne de l'ensemble ou de la moyenne sur toutes les courbes:
ma.plotMeanMSD
Changez le Y et l'axe x de linéaire à échelle logarithmique. Au temps de latence longs, les courbes de TMS deviennent bruyant à cause de manque de statistiques à plus longue échéance. Les courbes de TMS peuvent également augmenter fortement en raison d'une erreur dynamique. Ces régions de la courbe peuvent être retirés à l'aide de l'outil pinceaupour sélectionner la fin de la courbe et en sélectionnant «brossage»> «Retirer non gratté» dans le menu Outils.
- Importez les trajectoires des particules en tapant:
- Télécharger EzyFit au http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/ et ajoutez EzyFit à un dossier appartenant à la voie Matlab (par exemple C: Documents and Settings Mes Documents Matlab). Installez le menu EzyFit en tapant dans Matlab espace de travail efmenu installation. Redémarrez MATLAB avec le menu EzyFit dans la fenêtre de figure. Monter les courbes MSD à la loi de puissance en sélectionnant dans le menu EzyFit 'Show Fit'> 'Power'> 'a * x ^ n' étaient n est l'exposant de diffusion α estimé.
REMARQUE: msdanalyzer nécessite l'ajustement de courbe Toolbox dans Matlab pour le montage de courbes MSD. EzyFit est une alternative du logiciel libre et qui peut effectuer l'ajustement de courbe. - Les trajectoires des particules actuelles clair et TMS pour calculer de nouvelles TMS de particules d'autres endroits ou le temps:
clair - Après le calcul des diverses courbes moyennes de TMS de particules dans un milieu (contrôle), et microcolonies et zones indifférenciées de diverses souches, copier et coller les courbes dans un graphique pour la comparaison. Raideur échantillon et réticulation augmentation avec des valeurs inférieures de TMS. Courbes plat inférieurs α et l'échantillon est plus élastique que les courbes raides avec plus α.
- Sélectionnez la courbe et cliquez sur "Outils" de regarder les données statistiques, telles que la médiane et la gamme. La MSD de la bille est proportionnelle à la compliance de fluage, J (t) de la matière dans laquelle est noyée la bille en fonction de la relation,
où J = respect de fluage, d = diamètre de particule, k B = constante de Boltzman, T = température et t = temps.
- Extraire le dossiermsdanalyzer 15 et déposez-le dans un dossier qui appartient à la trajectoire Matlab (par exemple C: Documents and Settings Mes Documents Matlab). Commencez Matlab et de lancer l'analyseur en tapant:
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Résultats
Les propriétés viscoélastiques locaux du biofilm dans différentes régions du biofilm, qui comprenait les vides (moyennes au-dessus du biofilm), des plaines (couche de cellules indifférenciées plat) et microcolonies (voir les étiquettes de la figure 2A) ont été étudiés. Les changements temporels de propriétés viscoélastiques de la maturation du biofilm pendant 3 jours à 5 ont également été déterminés. La MSD des particules dans les vides a été utilisé comme témoin et comparable à la MSD ...
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Discussion
Microrhéologie est un outil utile pour les mesures rhéologiques locales dans les systèmes hétérogènes, tels que les biofilms microbiens. Il est une technique non destructive, ce qui permet la surveillance en temps réel des changements rhéologiques sein d'un même échantillon biologique sur plusieurs points temporels. Dans ce protocole, microrhéologie de traces de particules a été appliqué à Pel et mutants exopolysaccharide Psl afin d'enquêter sur la façon dont ils affectent l'élasticité et la réticulation eff...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Cette recherche est soutenue par la Fondation Nationale de la Recherche et de l'Education de Singapour Ministère en vertu de son Centre de recherche du Programme d'excellence, les subventions de démarrage (M4330002.C70) de l'Université technologique de Nanyang, et ACRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) du Ministère de l'Education, à Singapour. Les auteurs remercient Joey Yam Kuok Hoong pour participer à la manifestation de ce protocole.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Fluorsphères | Invitrogen | F-8821 | 1.0 μ ; Microsphères fluorescentes rouges (580/605) avec modification carboxylate |
| Zeiss Axio Imager M1 | Microscope épifluorescent | Carl Zeiss | |
| Masterflex L/S Entraînement numérique 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | Pompe péristaltique |
| Chambres de cellules d’écoulement | Université technique du Danemark | ||
| Piège à bulles | Université technique du Danemark | ||
| Tube en silicone | Dow Corning | 3 mm de diamètre extérieur, 1 ; mm de diamètre intérieur | |
| Connecteurs en plastique polypropylène transparent ; | Cole Parmer | 06365-83 | 1/16 po. (1,588 millimètre) |
| Pinces | Pour serrer les tubes | ||
| Lamelles Thermo | Scientific&trade ; Nunc&commerce ; | 50 x 24 mm | |
| Seringue 3 ml | Terumo | ||
| 27 ; G Aiguille | Terumo | ||
| 2 ; L Bouteilles de stockage/média | VWR® ; | ||
| Chariot | pour maintenir l’installation du biofilm |
Références
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Réimpressions et autorisations
