Article de méthode

Solide Lipid nanoparticules (SLN) Applications pour le ciblage intracellulaire

DOI :

10.3791/53102

⸱

17 novembre 2015

 ,  ,  , 
1Research and Exploratory Development Department, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory, 2Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins School of Medicine, 3Asymmetric Operations Sector, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cette étude, une méthode de synthèse de populations ultra-petites de nanoparticules biocompatibles a été décrite, ainsi que plusieurs méthodes in vitro permettant d’évaluer leurs interactions cellulaires.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les véhicules d’administration à base de nanoparticules se sont révélés très prometteurs pour les applications de ciblage intracellulaire, fournissant un mécanisme permettant de modifier spécifiquement la signalisation cellulaire et l’expression des gènes. Dans une étude précédente, la synthèse de nanoparticules lipidiques solides (SLN) ultra-petites pour l’administration de médicaments topiques et la détection de biomarqueurs a été démontrée. Les SLN sont un exemple bien étudié d’un système d’administration de nanoparticules qui s’est révélé être un véhicule prometteur d’administration de médicaments. Dans cette étude, les SLN ont été chargés avec un colorant fluorescent et utilisés comme modèle pour étudier les interactions particules-cellules. La méthode de la température d’inversion de phase (PIT) a été utilisée pour la synthèse de populations ultra-petites de nanoparticules biocompatibles. Un dosage au bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphénylphényltétrazolium (MTT) a été utilisé afin d’établir des doses appropriées avant les études d’interaction nanoparticule-cellule. De plus, des fibroblastes dermiques humains primaires et des cellules dendritiques de souris ont été exposés à des SLN chargés de colorants au fil du temps, et les interactions relatives à la toxicité et à l’absorption des particules ont été caractérisées à l’aide de la microscopie à fluorescence et de la cytométrie en flux. Cette étude a démontré que les SLN ultra-petits, en tant que système d’administration de nanoparticules, conviennent au ciblage intracellulaire de différents types de cellules.

Introduction

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Véhicules de livraison à base de nanoparticules ont montré de grandes promesses pour les applications ciblage intracellulaire, fournissant un mécanisme de modifier spécifiquement la signalisation cellulaire et l'expression des gènes. Ces véhicules peuvent être chargés avec des médicaments, des protéines et des acides nucléiques destinés à influer sur les réponses cellulaires et obtenir un effet souhaité dans les tissus cibles. De nombreux types de nanocarriers ont été explorées pour un bénéfice thérapeutique et de diagnostic, y compris les lipides, les polymères, le silicium, et les matières magnétiques. Ces systèmes sont attrayants en raison de leur potentiel pour la livraison localisée de médicaments, augmentation de la concentration thérapeutique dans les tissus cibles, et la réduction de la toxicité systémique.

Nanoparticules lipidiques solides (SLN) en sont un exemple bien étudié d'un système de livraison de nanoparticules qui a émergé comme un véhicule de livraison de médicament prometteur au cours des dernières années. SLN peuvent être facilement formulés pour de multiples applications, y compris la bio-détection 1, cosmétiques 2, et tlivraison herapeutic 3-7. Leur utilité réside dans le fait qu'ils sont constitués exclusivement d'résorbables, des lipides non toxiques, ce qui entraîne une meilleure biocompatibilité. Au cours de la synthèse, les médicaments lipophiles peuvent être incorporées dans des véhicules SLN, ce qui augmente la solubilité du médicament et de l'aptitude à l'administration parentérale. SLN véhicules contribuent également à stabiliser thérapeutiques encapsulés, la réduction de leur dégradation et de dégagement, et de maximiser l'action thérapeutique. Ces véhicules sont particulièrement bien adaptés pour longue durée d'action, à libération contrôlée de préparations en raison de leur stabilité à 3,4,8,9 de la température du corps. Fait important, l'encapsulation de médicaments dans des nanoparticules lipidiques modifie les profils pharmacocinétiques intrinsèques des molécules de médicament. Ceci permet d'obtenir un avantage potentiel en permettant la libération contrôlée de médicaments ayant un indice thérapeutique étroit. Le taux de la thérapeutique de la SLN incorporée libération peut être réglé en fonction du taux de dégradation des lipides ou de la vitesse de diffusion de la drogue dans lematrice lipidique.

SLN sont souvent conçus pour accumuler dans les tissus cibles spécifiques. Par exemple, leur taille (typiquement supérieure à 10 nm) potentialise la rétention dans la circulation, où le système vasculaire qui fuit de tissu tumoral facilite le dépôt. En outre, la voie d'administration de particules a été montré pour modifier la biodistribution avec le potentiel de cibler des structures physiologiques spécifiques tels que les ganglions lymphatiques 10,11. Après dépôt dans les tissus cibles, la réalisation des interactions cellulaires appropriées et internalisation éventuelle des nanoparticules est difficile en raison de la capacité de la membrane cellulaire pour commander sélectivement le flux d'ions et de molécules dans et hors de la cellule 12. Afin de faciliter l'absorption cellulaire, il est possible de modifier nanocarriers avec des ligands spécifiques, y compris des peptides, des petites molécules et des anticorps monoclonaux, 13,14. Plusieurs mécanismes, y compris à la fois la pénétration passive et le transport actif de nanoparticulesà travers la membrane cellulaire ont été précédemment décrite 3,12,15. En général, il a été démontré que les interactions cellule-nanoparticules sont influencées par les propriétés physico-chimiques des nanoparticules, y compris la taille, la forme, la charge de surface et de chimie de surface, en plus des paramètres spécifiques de cellules telles que le type de cellule ou cellule phase du cycle 12.

Une enquête précédente a démontré la synthèse de sous-SLN 10 nm pour les topiques 16 et biomarqueurs applications de détection 1 selon la méthode 17 température d'inversion de phase (PIT). Ceci est un procédé de synthèse doux 2 ​​où la composition reste constante tandis que la température est progressivement modifiée. Sous agitation continue de la solution chauffée, lors de son refroidissement à RT résultats dans une nanoémulsion. Ce procédé conduit à la synthèse de la SLN de plus petite taille de particule de 1 que précédemment rapporté en utilisant divers procédés pour la synthèse de lipides nanoparticles 17-22. L'échelle de taille résultante, inférieure à 20 nm, fournit un avantage pour les applications de ciblage intracellulaire due à l'augmentation de la surface et le potentiel d'interactions cellulaires améliorées.

Un schéma de SLN, conçu pour fournir un colorant fluorescent ou thérapeutique, est représenté sur la Figure 1. Les SLN sont constitués d'un intérieur (par exemple alcane linéaire) qui permet l'incorporation de composés lipophiles (par exemple, des colorants ou des agents thérapeutiques) et un extérieur de tensioactif lipidique (tensioactif non ionique, par exemple, linéaire) entourée par l'eau. Dans cette étude, SLN ont été chargées avec un colorant fluorescent et utilisées comme modèle pour étudier les interactions de particules cellulaires. Fibroblastes dermiques humains primaires et les cellules dendritiques de souris ont été exposées à colorant chargé SLN au fil du temps afin de caractériser les interactions par rapport à la toxicité et l'absorption de particules. Un dosage 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-de diphenylphenyltetrazolium (MTT) est utilized afin d'établir les niveaux de dosage appropriées. La microscopie à fluorescence et la cytométrie en flux, deux méthodes employées pour étudier l'absorption de particules in vitro.

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Figure 1. Schéma de la SLN montrant les principaux constituants. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Protocole

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1. Traitement des SLN

  1. Synthèse de SLN
    Remarque: Utilisez la méthode PIT 1,17,20 pour préparer les sous-SLN 1 20 nm.
    1. Utiliser une technique aseptique, bioréactifs ou culture cellulaire réactifs de qualité, et les matériaux stériles (ie, pipettes, spatules, flacons, etc.).
    2. Utilisez une armoire de biosécurité pour la synthèse de SLN (Figure 2).
    3. Moissonneuse 0,6 mg de colorant fluorescent (rouge Nil (NIR), la concentration NiR est d'environ 0,3 mg / ml) et 0,10 g de heneicosane (lipides, 5% poids / poids concentration des lipides) dans un flacon (15 ml), co-fusion à 90 ° C, et remuer.
    4. Ajouter 0,11 g de polyoxyéthylène (10) oléyl éther (tensioactif, 5,5% poids / poids tensioactif concentration). Co-fondre le mélange obtenu à 90 ° C et remuer.
    5. Ajouter 1,79 g d'eau stérile pour le mélange, la chaleur à 90 ° C, et remuer jusqu'à une nanoémulsion transparente est formé.
      Remarque: Sous agitation continue et refroidissement contrôlé, SLNs sont créés. Ces conditions provoquent une inversion de l'émulsion eau-dans-huile à une émulsion huile-dans-eau. Les molécules lipophiles telles que la partition NiR aux gouttelettes lipidiques.
    6. Préparer une nanoémulsion en parallèle sans addition du colorant fluorescent, afin de servir comme un échantillon de contrôle. Mélanger 0,10 g de heneicosane et 0,11 g de polyoxyéthylène (10) oléyléther dans un flacon (15 ml) co-fusion à 90 ° C, et remuer.
      1. Ajouter 1,79 g d'eau stérile pour le mélange, la chaleur à 90 ° C, et remuer jusqu'à une nanoémulsion transparente est formé.
    7. Stériliser plus, chaque nanoémulsion l'aide d'un filtre de 0,2 um stérile.
    figure-protocol-1
    Figure 2. Schéma de synthèse de SLN. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
  2. Taille des particules et Polydispersity
    1. Utilisez diffusion de lumière dynamique (DLS) pour mesurer la taille des particules et la polydispersité des SLN 1 en utilisant une cuvette de verre et un instrument conçu pour mesurer la taille des particules.
    2. Avant les mesures des échantillons, mesurer les tailles de particules de deux normes connues suivant le protocole du fabricant pour la préparation des normes et de la mesure.
    3. Remplir la cuve en verre avec 1,5 ml de la solution étalon et de mesurer la solution standard en utilisant les mêmes conditions de mesure que les échantillons.
      Remarque: l'étape précédente a été répétée pour chaque norme.
    4. Mesurer les échantillons tel que préparé. Pour chacun, utiliser les paramètres expérimentaux suivants: un temps de fonctionnement de 100 s, indice de réfraction de l'eau (1.33), la viscosité de l'eau à 20 ° C (1.002 mPa.s).
      Remarque: Cette technique utilise une fréquence décalée lumière pour mesurer la taille des nanoparticules.
    5. Signaler le diamètre de particule moyen et la polydispersité de partidistribution de taille de cle.
  3. Point de fusion et la chaleur latente de fusion
    1. Utiliser un calorimètre à balayage différentiel (DSC) équipé d'un auto-échantillonneur et la source de refroidissement à l'azote liquide à étudier le comportement thermique de 1 SLN.
    2. Introduire à la pipette les SLN comme préparés dans une casserole en aluminium de 40 pi avec une masse d'environ 25 mg et fermer hermétiquement la casserole à l'aide d'une presse à sertir universelle pour minimiser la perte d'humidité lors de l'analyse de DSC.
    3. Mesurer chaque nanoémulsion de 5 à 80 ° C.
    4. Déclarez le point de fusion et la chaleur latente de fusion de la parcelle de DSC, où la vallée représente le point de fusion et de l'intégrale de l'aire sous la courbe dans la parcelle de DSC divisée par la quantité de matière représente la chaleur latente de fusion.

2. SLN Interaction avec fibroblastes et les cellules dendritiques

  1. Culture de fibroblastes humains primaires
    1. Culture fi humaine primairefibroblastes selon les instructions du fabricant en milieu liquide pour la culture de fibroblastes dermiques humains (moyenne 106), complétés avec le kit supplément faible croissance de sérum (LSGS). Maintenir les cellules dans une atmosphère humidifiée à 37 ° C, 5% CO 2 et de sous-culture après avoir atteint 80% de confluence.
    2. Pour les deux MTT et l'analyse de l'imagerie, les cellules de semences dans une plaque à 96 puits, à une densité de 2 x 10 4 cellules par puits, et ramener à 37 ° CO / N avant l'exposition SLN.
    3. Au temps zéro, diluer SLN dans un milieu complet comme indiqué (Figure 4), par rapport à la concentration de lipides, et ajouter 10 ul par puits à chaque répliquer bien dans la plaque de 96 puits.
    4. Maintenir les cellules à 37 ° C, 5% CO 2, au cours de la période d'incubation.
  2. MTT Essai de toxicité
    1. Après 24 h d'incubation avec SLN, déterminer la viabilité cellulaire en utilisant le test MTT, selon le protocole du fabricant.
    2. Laver les cellules une fois et ajouter du milieu frais à chaque puits (100 pl / puits). Tuer puits témoins par incubation dans une solution de methanol à 70% pendant 10 min avant de le remplacer par du milieu frais.
    3. Ajouter le réactif MTT (10 pi par puits) à chaque puits de la microplaque et incuber O / N à 37 ° C.
    4. Après O / N incubation, solubiliser cristaux de formazin intracellulaires avec la solution de détergent fourni (100 pi par puits) selon le protocole du fabricant.
    5. Après 3 h d'incubation à TA, obtenir des valeurs d'absorbance à une longueur d'onde de mesure de 570 nm en utilisant un lecteur de microplaque.
      Réactif MTT utilisée doit être inférieure à 1% (p / v) 3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2, le bromure de 5-diphényl-tétrazolium: Remarque.
  3. Microscopie à fluorescence
    1. A des moments spécifiques suivants dosage des fibroblastes avec la SLN, laver les fibroblastes deux fois avec un tampon phosphate salin stérile (PBS), et fixer pendant 10 min avec 70% de méthanol froid.
    2. Après 10 min, Remplacer le méthanol avec du PBS et de capturer des images à l'aide d'un microscope inversé, en utilisant un passe-bande (BP) 690/50 nm de jeu de filtres.
  4. Culture de cellules dendritiques de moelle osseuse de souris
    1. Induire osseuse de souris des cellules dendritiques dérivées de moelle (BMDC) tels que décrits précédemment 23,24. Brièvement, suspensions plaque monocellulaires de C57BL / 10 moelle osseuse à 100 mm boîtes de Petri à 2 x 10 6 / plaque avec murin facteur stimulant les colonies de granulocytes-macrophages recombinant (GM-CSF, 300 U / ml) et murine IL-4 recombinante (cellules B facteur de stimulation, 200 U / ml). Changer de support tous les 3 jours.
    2. Au jour 7, ajouter SLN NIR chargés aux plats à une concentration finale de 0,5 et 5,0 ug / ml de lipide et de maintenir les cellules dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur pendant toute la durée de l'exposition désiré.
    3. Recueillir des cellules de la vaisselle en aspirant tous les médias de la plaque, en la recueillant dans un tube de 50 ml, suivi par un lavage soigneux de la plaque (pour déloger annonce lâcheHerent cellules) avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 4 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Recueillir la suspension cellulaire obtenue dans le même tube de 50 ml.
  5. Évaluation de la SLN Incorporation par cytométrie en flux
    1. Déterminer la concentration de la suspension cellulaire obtenue au point 2.4.3 et distribuer 3x10 5 cellules dans un 12 mm x 75 mm à fond rond FACS tube.
    2. Laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS, puis centrifuger les tubes pendant 5 min à 400 x g, à une température de 4 ° C.
    3. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot avec 100 ul d'EDTA / 0,1% d'albumine de sérum bovin PBS / 2 (BSA) (tampon de coloration) contenant des anticorps anti-CD11c monoclonal FITC (0,25 ug / ml final). Incuber pendant 30 min sur de la glace dans l'obscurité.
    4. Laver les cellules avec 1 ml de PBS, puis centrifuger les tubes pendant 5 min à 400 x g, à une température de 4 ° C.
    5. Jeter le surnageant et remettre chaqueun culot avec 400 ul de tampon de coloration. Les cellules sont maintenant prêts pour l'acquisition des échantillons avec un cytomètre de flux (peut-être équipé avec des lasers bleus et rouges).
    6. Utilisation de la cytométrie de flux logiciel d'analyse, d'évaluer le niveau d'incorporation de SLN par DC par gating sur la population de CD11c + cellules (FITC positif) et en comparant l'intensité de la SLN-associés fluorescence (mesurée dans les canaux PerCP-Cy5.5 ou APC).

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Résultats

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La méthode de PIT a été utilisé pour synthétiser les SLN et la température d'inversion de phase a été déterminée en utilisant un bain d'eau. Les échantillons ont été chauffés lentement et doucement agitée jusqu'à ce que la solution est apparue clairement. La température d'inversion de phase pour les SLN faites en utilisant des lipides heneicosane est de 45 ° C. Le tableau 1 résume la taille des particules, polydispersité, point de fusion et la chaleur latente de la fonte pour les SLN. Les SLN synthétisé...

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Discussion

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Dans cette étude, la synthèse de la SLN et de leur applicabilité pour les applications ciblage intracellulaire ont été explorées. Ces nanoparticules biocompatibles ont montré des résultats prometteurs en tant que véhicules de livraison pour de multiples applications, y compris l'administration de médicaments, le silençage génique, et technologies vaccinales 25-30. Ultra-petits SLN ont été synthétisés en utilisant un processus facile, et leurs interactions avec les cellules de la peau et des cellules immun...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par le département de recherche et de développement exploratoire du Johns Hopkins Applied Physics Laboratory, l’Office of Technology Transfer et le programme de bourses Stuart S. Janney, en plus du National Heart, Lung, and Blood Institute des National Institutes of Health sous le numéro de bourse R21HL127355.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Rouge du Nil (NiR)Sigma19123BioReagent, adapté à la fluorescence, &ge ; 98.0 %
HeneicosaneAldrich28605298 %
Brij O10SigmaP6136Brij 97, C18-1E10, Polyoxyéthylène (10) oleyléther
EauSigmaW3500Filtré stérilement, BioRéactif, adapté à la culture cellulaire
Seringue Filtre 0.2 µ ; m Membrane Supor Low Protein Binding Sciencesde la viePN4612Non-Pyrogenic
Nanotrac Ultra  ;Numéro de sérieMicrotrac
Calorimètre différentiel à balayagede l’instrument Institut Mettlet-Toledo
Fibroblastes humains primaires  ;Life TechnologiesC-004-5CNéonatal (HDFn)
Medium 106Life TechnologiesM-106-500Un milieu liquide stérile pour la culture de fibroblastes dermiques humains.
Kit de supplément à faible croissance sérique (LSGS Kit)Life TechnologiesS-003-KTous les composants du kit complet de test de prolifération cellulaire LSGS
MTTTrevigen4890-025-KKit sensible pour la mesure de la prolifération cellulaire basée sur la réduction du sel de tétrazolium, le bromure de 3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphényl-tétrazolium (MTT)Lecteur de
microplaques Safire2Tecan----Instrument
Saline tamponnée au phosphate  ;SigmaP5493Pour la biologie moléculaire
Souris recombinante GM-CSF  ;Peprotech315-03>97 %, par SDS-PAGE dans des conditions réductrices et visualisé par coloration à l’argent.
IL-4 murine recombinante  ;Peprotech214-14>97 %, par SDS-PAGE dans des conditions réductrices et visualisé par coloration à l’argent.
U1985IS

Références

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