Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

miRNA expression analyses en cancer de la prostate tissus cliniques

10.5K vues

⸱

DOI :

10.3791/53123

⸱

8 septembre 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Veterans Affairs Medical Center, San Francisco, University of California San Francisco

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici un protocole simplifié pour l’analyse de l’expression des microARN (miARN) dans des tissus cliniques archivés de cancer de la prostate (FFPE) ou de cancer de la prostate (PCa) fraîchement congelés utilisant la PCR quantitative en temps réel (RT-PCR) et l’hybridation in situ (ISH).

Résumé

Un défi essentiel à cancer de la prostate (CaP) prise en charge clinique est posé par l'insuffisance des biomarqueurs actuellement utilisés pour le dépistage de la maladie, le diagnostic, le pronostic et le traitement. Au cours des dernières années, les microARN (miARN) ont émergé biomarqueurs suppléants prometteuses pour le diagnostic du cancer de la prostate et le pronostic. Cependant, le développement de biomarqueurs miARN comme efficaces pour cancer de la prostate repose en grande partie sur leur détection précise dans les tissus cliniques. miARN analyse des spécimens cliniques sur le cancer de la prostate est souvent difficile en raison de l'hétérogénéité tumorale, les erreurs d'échantillonnage, la contamination du stroma, etc. Le but de cet article est de décrire un flux de travail simplifié pour miARN analyse en FFPE archivé ou spécimens cliniques sur le cancer de la prostate frais congelé en utilisant une combinaison de quantitative PCR en temps réel (RT-PCR) et l'hybridation in situ (ISH). Dans ce flux de travail, nous optimisons les méthodologies existantes pour l'extraction de miARN FFPE et tissu de la prostate gelées et l'expression analyses par TaqMan sonde basée miARN RT-PCR. En outre, nous décrivons une méthode optimisée pour ISH analyse de la détection formiRNA dans les tissus de la prostate à l'aide de l'acide nucléique verrouillé (LNA) - sondes basées. Notre protocole optimisé ISH miARN peut être appliquée sur les lames de cancer de la prostate ou de tissus microarrays de tissu de cancer de prostate (TMA).

Introduction

Cancer de la glande de la prostate est une tumeur maligne mâle fréquemment diagnostiqué qui est l'une des principales causes de mortalité liée au cancer chez les hommes. Aux États-Unis, on estime que 220,800 nouveaux cas et 27,540 décès seront rapportés en 2015 1.

Cancer de la prostate est une maladie hétérogène avec une maladie très variable Cours-tumeurs peuvent être indolent ou très agressif. Un défi majeur dans le cancer de prostate gestion clinique est posé par l'insuffisance des méthodes actuellement utilisées / biomarqueurs pour le dépistage de la maladie, le diagnostic, le pronostic et le traitement 2. Méthodes de dépistage actuelles comprennent l'antigène (PSA) des tests spécifiques de la prostate et un toucher rectal (DRE), suivi par biopsies de la prostate 3. Antigène spécifique de la prostate (PSA) est le biomarqueur du cancer de la prostate le plus largement utilisé qui a considérablement révolutionné la gestion clinique et l'amélioration des taux de survie 4. Toutefois, en raison des limites inhérentes de PSA incluant le lack de spécificité, le dépistage à base de PSA-dessus a conduit à un diagnostic et un traitement sur de la maladie. Dans cette perspective, des efforts intensifs sont dirigés vers la recherche de biomarqueurs du cancer de la prostate de rechange, en particulier ceux qui peuvent prédire l'agressivité de la maladie et de conduire de meilleures décisions de traitement 4,5. Au cours des quelques dernières années, les microARN (miARN) sont apparus comme des biomarqueurs du cancer de la prostate alternatives prometteuses.

Les microARN (miARN) constituent une classe évolutif conservé de petits ARN non-codants qui suppriment l'expression génique post-transcriptionnelle par des interactions spécifiques de séquence avec les régions non traduites 3 'UTR () de cibles d'ARNm apparentés. On estime que> 60% des ARNm cibles sont conservées de miARN 6. miRNA gènes sont situés dans les régions intergéniques ou dans des introns ou exons de protéines / non-protéique gènes codant 7. Ces gènes sont préférentiellement transcrites par l'ARN polymérase II dans primamiARN ry (pri-miARN, plusieurs kilobases de long) qui forment en épingle à cheveux en forme de tige-boucle structures secondaires. Ces pri-miARN sont transformées en précurseurs miARN (pré-miARN, 60-75 nucléotides de long) qui sont exportés vers le cytoplasme et traitées ultérieurement dans miARN matures (18-25 nucléotides de long) 8-10. miARN régulent les processus cellulaires clés, y compris la prolifération, le développement, la différenciation et l'apoptose 11. Des études suggèrent une dérégulation généralisée des profils d'expression de miARN dans diverses affections malignes humaines, notamment le cancer de la prostate de 12 à 15. les profils d'expression de miARN ont été rapportés pour être largement dérégulée dans le cancer de la prostate primaire et métastatique. L'expression du miARN modifié ont été liés à la progression du cancer de la prostate, de l'agressivité et de la récurrence soulignant le potentiel pronostique des miARN 12,14,16-19. Un nombre croissant de preuves indique que miARN jouent des rôles importants dans l'initiation mécanistes de cancer de la prostate, le développement, le progrèsion et les métastases. Globalement, miARN sont en train de biomarqueurs suppléants prometteuses pour le diagnostic du cancer de la prostate et le pronostic qui peuvent distinguer entre les tissus normaux et cancéreux et de l'aide dans la stratification des tumeurs de la prostate 12. Aussi, miARN sont des cibles importantes pour le développement de traitements efficaces contre le cancer de la prostate 20.

En raison de leur petite taille et de résistance à l'activité de RNase endogène, miARN sont biomarqueurs stables qui peuvent être facilement détectés dans les tissus fixés au formol et 21 biopsies de la prostate 22. En outre, les profils d'expression des miARN ont été comparés dans les tissus fixés au formol et congelés et ont été trouvés à être fortement corrélé 21. Toutefois, l'expression des miARN profilage dans les tissus cliniques sur le cancer de la prostate est souvent difficile en raison de l'hétérogénéité tumorale, les erreurs d'échantillonnage, la contamination du stroma etc. Le développement des miARN comme biomarqueurs efficaces pour cancer de la prostate fortement relies sur leur détection précise dans les tissus cliniques. Nous décrivons ici un workflow simplifié utilisé dans notre laboratoire pour l'expression des miARN profilage dans FFPE archivé ou échantillons cliniques de cancer de la prostate frais congelé. Nous employons une combinaison de PCR quantitative en temps réel et l'hybridation in situ pour les miARN dans les analyses d'échantillons cliniques, avec l'ancien donnant davantage d'informations quantitatives et celui-ci pour visualiser l'expression différentielle des biomarqueurs miARN potentiels dans un éventail de tissus. Dans ce flux de travail, nous optimisons les méthodologies existantes pour l'extraction miARN de FFPE et les tissus de la prostate congelés, les analyses d'expression par TaqMan sonde basée miARN RT-PCR et miARN technique d'hybridation in situ en utilisant l'acide nucléique verrouillé (LNA) à base de sondes 23. Sondes à base de LNA offrent une sensibilité et une spécificité accrue par rapport à l'ADN ou de l'ARN sondes basées et permet une détection robuste de toutes les séquences de miARN, quelle que soit leur teneur en GC et permettent également discrimination des familles de miARN. Notre protocole optimisé ISH miARN peut être appliquée sur les lames de cancer de la prostate ou de tissus microarrays de tissu de cancer de prostate (TMA), ce dernier offrant la possibilité d'accélérer la découverte de biomarqueurs miARN.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Échantillons frais cancer de la prostate congelés fixés à la formaline, inclus en paraffine (FFPE) ou ont été obtenues à partir de la SFVAMC. Les échantillons provenaient de patients atteints de cancer de la prostate qui ont subi une prostatectomie radicale SFVAMC. Le consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients et l'étude a été approuvée par le Comité sur la recherche humaine UCSF. Alternativement, les tissus de cancer de la prostate puces ont été achetés auprès de sources commerciales et utilisés pour miARN analyses par ISH. Informations clinico-pathologique et le suivi des patients atteints de cancer de la prostate analysées ont été recueillies.

1. Les échantillons de tissus

  1. Couper des échantillons de tissu de cancer de la prostate dans 10 um sections à l'aide d'un microtome et coloration à l'H & E en suivant le protocole du fabricant.
  2. Revoir lames colorées pour l'identification de la prostate foyers de cancer ainsi que épithélium glandulaire normal adjacent.
    Remarque: Un conseil certifié pathologiste doit examiner les diapositives H & E colorées et mark de zones normales et tumorales. Utilisez les diapositives marqués comme guides dans les sections suivantes pour miARN analyses de la tumeur vs zones normales.

2. miRNA expression analyses par PCR quantitative en temps réel

Remarque: Ce flux de travail comprend les étapes suivantes: microdissection laser, l'isolement de l'ARN total (y compris les miARN et ARNm), le dosage des miARN matures en utilisant les tests d'expression TaqMan microARN comme détaillé dans les sections suivantes.

  1. Extraction de l'ARN
    1. Isolement des miARN de Cancer de la prostate tissus FFPE
      1. Microdissection laser (LCM)
        Remarque: Effectuer les étapes 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 dans une hotte chimique.
        1. Préparer des lames de tissus (10 um sections) pour LCM. Sections Deparrafinize de tissu par trempage dans du xylene (2 x), pendant 10 minutes chacun, puis réhydrater les tissus en incubant les lames pendant 5 min chacun dans de l'éthanol à gradient (100%, 95%, 90%, 80%, 70%), suivie de distillation eau(5 min).
        2. Après réhydratation, les sections de tache avec de l'hématoxyline pendant 30 secondes puis de l'eau.
        3. La place les tissus dans de l'éthanol gradué (70%, 95% à 90%, 80%, 70%) (5 min chacun) et du xylene (5 min).
        4. Diapositives sec dans une hotte et les placer dans l'instrument de LCM pour microdissection.
        5. Effectuer microdissections avec le système LCM en conformité avec les instructions du fabricant 24. Utiliser pathologiste balisé diapositives comme guides pour l'identification de la prostate foyers de cancer ainsi que le tissu normal adjacent. Utiliser le faisceau laser à impulsions d'un diamètre de 10-20 pm avec une puissance de 70 à 90 mW.
        6. Les zones de capture d'intérêt avec des impulsions laser infrarouges sur un bouchon d'LCM. Combiner les cellules de 2-5 bouchons pour l'extraction miARN par échantillon. Pour garantir l'intégrité de l'ARN extrait, traiter immédiatement cellules capturées pour l'extraction miARN.
        7. En variante, des cellules de lyse dans le tampon d'extraction miRNA (selon le protocole du fabricant) et store lysats à -80 ° C.
      2. Extraction miARN et Analyses de LCM microdisséquées tissus
        1. Extraire l'ARN total à partir de tissus FFPE microdisséquées utilisant un kit commercial en suivant les instructions du fabricant.
          Remarque: Le rendement de l'ARN à partir de capture laser miscrodissection est généralement faible. Par conséquent, l'ARN est élue dans de faibles volumes (20-30 pi) et utilisé pour le profilage d'expression en utilisant Taqman microARN essais d'expression suivant les instructions du fabricant (également décrits dans la section 2.2). Optimisation de l'ARN d'entrée pour la détection de PCR en temps réel de miARN matures suggère que 5 ul de l'ARN élue est optimale pour chaque réaction de transcription inverse spécifiques à des miARN. Comme un contrôle endogène, RNU48 / RNU24 est utilisé. Pour les réactions témoins, 2 ul de l'ARN élue est utilisé pour la réaction de transcription inverse.
    2. Isolement des miARN de Cancer de la prostate tissus congelés
      1. Homonize tissus prostatiques réséquées congelés par broyage des tissus dans de l'azote liquide en utilisant un mortier et un pilon. Transfert homogénéisés de tissu un tube de microcentrifugation en utilisant une spatule refroidi. Maintenir le mortier / pilon et spatule à la même température en plongeant dans l'azote liquide afin tissu homogénéisé peut être facilement transféré.
      2. Ajouter commercial isothiocyanate de guanidine-phénol réactif (1 ml / 0,1 g de tissu) dans le tissu homogénéisé et incuber à température ambiante pendant 5 min.
        Remarque: les tissus homogénéisés dans la guanidine réactif isothiocyanate-phénol commerciale peuvent être conservés à -80 ° C pendant plusieurs mois.
      3. Ajouter le chloroforme à l'homogénat (0,2 ml de chloroforme / ml) et agiter vigoureusement pendant 30 sec. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 3-5 min, suivie d'une centrifugation à 10 000 xg pendant 20 min à 4 ° C.
      4. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un tube stérile frais 1,5 ml sans RNase.
      5. Ajouter un volume égal d'alcool isopropylique. Mélanger et laisser incuber pendant 10 min à température ambiante suivie par centrifugation à 12.000 g pendant 20 min à 4 ° C pour sédimenter l'ARN.
      6. Aspirer le surnageant et laver le culot d'ARN avec 1 ml d'éthanol à 70%. Centrifugeuse à 12.000 g pendant 10 min à 4 ºC.
      7. Aspirer délicatement le surnageant. Culots d'ARN à sec à température ambiante pendant 5-10 min. Dissoudre ARN dans 50-100 eau sans nucléase ul.
      8. Effectuer la quantification de l'ARN à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop et de déterminer l'intégrité de l'ARN avec un bioanalyseur. Ajuster la concentration d'ARN de 10 ng / ul. Utilisez 10-50 ARN ng pour miRNA- réaction d'ADNc spécifique suivie en temps réel par les analyses PCR (section 2.2).
  2. PCR quantitative en temps réel pour miRNA expression Analyses
    Remarque: miARN matures dosage en utilisant un protocole de RT-PCR en deux étapes comme décrit ci-dessous.
    1. Transcription inverse (RT)
      1. Transcription inverse de l'ARN à partir de l'ADNc en utilisant un kit de transcription inverse miRNA conformément aux instructions du fabricant.Utilisez 10-50 ng d'ARN total avec miARN amorce spécifique du kit microARN dosages et RT. Utilisez RNU48 / RNU24 / RNU6B comme témoins. Diluer ADNc 1: 5 à 1:10 (en fonction de l'abondance du miRNA analysé) et utiliser dans la détection en temps réel PCR comme décrit dans l'étape suivante.
    2. PCR en temps réel pour la détection de miARN mûr
      1. Amplifier les produits de PCR à partir d'échantillons d'ADNc en utilisant les tests de microARN avec un mélange maître universel rapide en conformité avec les instructions du fabricant. Normaliser échantillons à RNU48 / RNU24 / contrôle de RNU6B. Utilisez la méthode comparative Ct (cycle seuil) pour calculer les changements relatifs dans l'expression des gènes sur le système de PCR en temps réel rapide. Analyser chaque échantillon en triple exemplaire.

3. miRNA expression analyses par hybridation in situ (ISH)

  1. Pré-traitement des tissus
    1. Couper coupes de 5 um à partir de blocs de tissus cancéreux de la prostate FFPE utilisant un microtome.
    2. fix coupes de tissu par incubation des lames à 56 ° C pendant 1 heure.
      Remarque: Les diapositives peuvent être stockées à température ambiante pendant plusieurs semaines pour les analyses de miARN.
    3. Deparrafinize les tissus en trempant les lames avec du xylene (2 x), pendant 15 minutes chaque.
    4. Réhydrater les tissus en incubant les lames pendant 5 min dans de l'éthanol gradué chaque (de 100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%) puis de l'eau distillée (5 min).
    5. Fixer les lames avec 4% de paraformaldehyde dans PBS à la température ambiante pendant 20 min.
    6. Laver les lames avec du PBS (2x) à la température ambiante pendant 5 minutes chacun.
    7. Traiter les lames avec 10 ug / ml de proteinase K à 37 ° C pendant 10 min dans du tampon K proteinase préchauffé (Tris-HCl 5 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, 1 mM de NaCl).
    8. Après le traitement à la protéinase-K, rincer les lames avec 0,2% de glycine dans du PBS pendant 30 sec.
    9. Laver les lames dans du PBS (1x) à la température ambiante pendant 5 min.
    10. Fixer les lames avec 4% de paraformaldehyde dans PBS pendant 15 min.
    11. Rincer les lames avecPBS pendant 5 min.
  2. Hybridation
    1. Pré-hybrider les diapositives avec solution de pré-hybridation pendant 3-4 heures à 55 ° C dans une chambre humidifiée. Utiliser des lingettes de laboratoire de tissus imbibés de formamide à 50% / 50% 5x SSC de garder la chambre humidifié.
    2. Utilisez 5 'des sondes marquées à la digoxigénine à une concentration de 20 à 50 nM dans du tampon d'hybridation. Diluer sonde spécifique miARN (20-50 nM) et une petite sonde de contrôle de U6 ARN nucléaire (20 nM), la chaleur à 90 ° C pendant 4 min, placez-le sur la glace, et d'ajouter de la glace tampon d'hybridation à froid (2-4 ng / pl ).
    3. Retirer solution de pré-hybridation, ajouter la solution d'hybridation (sonde + tampon d'hybridation, 100 pi par diapositive), incuber pendant 12-16 h à la température d'hybridation spécifique sonde (température = hybridation sonde-Tm 21 ºC). Effectuer des hybridations dans une chambre humidifiée (50% de formamide / 50% 5x SSC).
  3. Les étapes de lavage
    1. Laver les lames avec 2x SSC pendant 10 min à 45 ° C.
    2. Laver til glisse avec 1,5x SSC pendant 10 min à 45 ° C.
    3. Laver les lames avec 0,2x SSC (2x) à 37 ºC pendant 20 minutes chacun.
    4. Incuber les lames avec une solution de blocage de 1x pendant 1-2 heures à la température ambiante
  4. Détection
    1. Incuber les lames avec 1: 100 PBS dilué anticorps anti-digoxigénine conjugué AP-pour 1-4 heures ou une nuit à 4 ºC.
    2. Laver les lames avec du PBS (3x) à température ambiante pendant 10 minutes chacun.
    3. Laver les lames (2x) avec de la phosphatase alcaline tampon (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20) à température ambiante pendant 5 min chacun.
    4. Incuber les lames dans le substrat BM Violet AP dans l'obscurité à température ambiante pendant 1-20 h.
    5. Rincer les lames avec du PBS contenant 0,1% de Tween-20 et lavage (2x) dans l'eau.
    6. Monter les lames en utilisant un milieu de montage aqueux et d'examiner sous un microscope.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Expression profiling de miR-203 dans des échantillons cliniques LCM prostate primaire de cancer par analyse RT-PCR (Figure 1)

Les analyses par RT-PCR de l'expression par rapport miR-203 dans des tissus de cancer de la prostate primaire LCM et les régions adjacentes appariées normales a été réalisée comme décrit dans l'Saini et al. RNU48 15 a été utilisé comme témoin. Le tableau suivant résume l'expression relative miR-203 dans des tissus de tu...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Dans cet article, nous décrivons un flux de travail simplifié pour l'expression du miARN profilage dans FFPE archivé ou tissus cliniques sur le cancer de la prostate frais congelé. Dans le cancer de la prostate, plusieurs études suggèrent un rôle important des microARN dans cancer de la prostate initiation, la progression et les métastases. Cependant, des résultats contradictoires sont souvent obtenus sur un miRNA spécifique 22 depuis l'extraction des miARN et analyses méthodes diffèrent largement. Co...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas de divulgations financières.

Remerciements

Nous remercions le Dr Roger Erickson pour son soutien et aide à la préparation du manuscrit.

Ce travail a été soutenu par le National Cancer Institute à la National Institutes of Health

(Grant Nombre RO1CA177984; RO1CA138642), le projet de programme de VA sur cancer de la prostate (BX001604).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
MicrotomeLeica Biosystems  ;RM2255
Arcturus Autopix pour LCMArcturus/ Life TechnologiesLCM1621/LCM1110Alternativement, le système Arcutus Xt de Life Technologies® peut être utilisé.  ;
CapSure Macro LCM Caps LifeTechnologiesLCM0211
miRNeasy FFPE Kit  ;Qiagen217504
7500  ;Applied Biosystems/ Life Technologies4351106
Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit  ;Applied Biosystems/ Life Technologies4366596
Taqman Fast Universal PCR master mix  ;Applied Biosystems/ Life Technologies4352042
Sonde LNA marquée DIG pour U6Exiqon99002-01
BM Purple AP substratRoche11442074001
Solution de pré-hybridation  ;BiochainK2191050-1
Solution d’hybridation  ;BiochainK2191050-2
Solution de blocage  ;BiochainK2191050-8
Anticorps anti-digoxigénine conjugué à l’APBiochainK2191050-7
Milieux de montage aqueux  ;Laboratoires Vecteurs  ;H-5501  ;   ;
Trizol (réactif isothiocyanate-phénol de guanidine)  ;Life Technologies15596-018
Harris hematoxylinStatlabSL200
Eosin  ;StatlabSL201 ;
Système PCR rapide en temps réel

Références

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  2. Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
  3. Sequeiros, T., et al. Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Biomed Res Int. 2013, 283635(2013).
  4. Cary, K. C., Cooperberg, M. R. Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future. Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).
  5. Sartori, D. A., Chan, D. W. Biomarkers in prostate cancer: what's new. Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).
  6. Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
  7. Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).
  8. Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).
  9. Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).
  10. Lee, Y., et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).
  11. Bartel, D. P., et al. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  12. Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics. Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).
  13. Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading. Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).
  14. Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. Diet, microRNAs and prostate cancer. Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).
  15. Saini, S., et al. Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis. Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).
  16. Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).
  17. Martens-Uzunova, E. S., et al. Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer. Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).
  18. Porkka, K. P., et al. MicroRNA expression profiling in prostate cancer. Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).
  19. Schaefer, A., et al. Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma. Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).
  20. Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities. Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).
  21. Xi, Y., et al. Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples. RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).
  22. Lucas, S. M., Heath, E. I. Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers. Prostate Cancer. , 640968(2012).
  23. Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides. J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).
  24. Suh, S. O., et al. MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer. Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).
  25. Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions. BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).
  26. Nelson, P. T., et al. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
  27. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179(2005).
  28. Hanna, J. A., et al. Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization. Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Tissu FFPEmicrodissection laseranalyse par RT PCRhybridation in situsondes LNAmicroprojet de tissusextraction d ARNd tection de biomarqueurs
miRNA expression analyses en cancer de la prostate tissus cliniques
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.