Article de méthode

Utilisation de l'analyse confocale

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DOI :

10.3791/53162

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14 décembre 2015

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1Department of Biomedical Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, 2Institute of Genetic Medicine, Newcastle University, 3Department of Cardiovascular Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, 4School of Biochemistry, University of Bristol, 5Biology Department, University of York

Dans cet article

Résumé

Le manuscrit ici fournit un jeu simple de méthodes pour analyser la sécrétion et la diffusion de ligands marqués par fluorescence dans Xenopus. Ceci permet d'obtenir un contexte pour tester la capacité des autres protéines de modifier la distribution de ligand et en permettant des expériences qui peuvent donner un aperçu des mécanismes de régulation des gradients de morphogènes.

Résumé

Ce protocole décrit un procédé pour visualiser des ligands distribués à travers un champ de cellules. La facilité de l'expression de protéines exogènes, ainsi que la taille de leurs cellules dans des embryons précoces, faire Xenopus laevis un modèle utile pour visualiser des ligands GFP étiqueté. ARNm synthétiques sont efficacement convertis après l'injection dans des embryons de xénope à un stade précoce, et les injections peuvent être ciblés pour une seule cellule. Lorsqu'il est combiné avec un traceur de lignage comme membrane attaché DP, la cellule injectée (et ses descendants) qui sont la production de la protéine surexprimée peuvent facilement être suivies. Ce protocole décrit un procédé pour la production de fluorescence étiquetée Wnt et Shh ligands injecté à partir de l'ARNm. Les procédés impliquent la micro dissection des explants ectodermiques (caps animales) et l'analyse de la diffusion de ligand dans plusieurs échantillons. En utilisant l'imagerie confocale, informations sur la sécrétion ligand et la diffusion sur un champ de cellules peut être obtenue. Les analyses statistiques des images confocales fournissent des données quantitatives sur la forme de gradients de ligands. Ces méthodes peuvent être utiles aux chercheurs qui veulent tester les effets des facteurs qui peuvent réglementer la forme de gradients de morphogènes.

Introduction

Au cours du développement embryonnaire précoce, les cellules sont progressivement engagés à suivre lignées spécifiques de différenciation: cela signifie un groupe de totipotentes (ou pluripotentes) cellules deviennent progressivement limité à établir des populations de cellules progénitrices déterminées pour donner naissance à un type de cellule. Signalisation cellule-cellule est au cœur de la régulation de la spécification de la lignée cours du développement embryonnaire. La manipulation de ces signaux sera nécessaire pour diriger les cellules souches vers destins particuliers pour soutenir nouveaux traitements médicaux.

Un nombre relativement faible de voies de signalisation sont réitéré au cours du développement, y compris les voies répondant à la superfamille TGF (nodals et BMP) 1-2, FGF 3, Wnts 4, 5 et hérissons. Ces protéines sécrétées lient des récepteurs présents sur la membrane de la cellule pour activer la transduction du signal en modifiant ainsi l'expression du gène et / ou le comportement des cellules. La réglementation stricte du signe de la celluleAlling est essentiel pour la spécification de la lignée cellulaire et le développement normal. Alors que la diaphonie entre ces voies est importante pour déterminer le destin des cellules, un seul ligand peut se solliciter des réponses distinctes à différentes concentrations. Gradients de morphogènes ont été décrits il ya plus de 100 ans comme une théorie pour expliquer comment les différents types de cellules peuvent dériver d'un domaine de 6 cellules. Signalisation des molécules produites par un groupe de cellules peut se diffuser sur une certaine plage, la diminution de la concentration avec une plus grande distance de la source. Les cellules exposées au signal répondront à la concentration locale à leur position dans le domaine des cellules, avec des cellules à des positions distinctes répondant différemment à différents niveaux du signal. Preuve de l'existence de morphogènes proviennent d'études sur l'embryon précoce Drosophila 7 et le disque de l'aile 8, ainsi que la branche des vertébrés 9 et 10 tube neural.

Les méthodes sont nécessaires pour envestigate comment gradients morphogène sont établis et d'identifier d'autres molécules importantes dans la régulation de ces gradients. Élégantes immunohistochimie en utilisant des expériences de visualiser in vivo des protéines endogènes dans le contexte de différents contextes génétiques ont été utilisées pour étudier les gradients de morphogènes 11-12. Toutefois, les bons anticorps et des mutants spécifiques ne sont pas toujours disponibles, de sorte que nous décrivons ici un protocole utilisant la surexpression de ligands fluorescents dans Xenopus, de fournir une alternative, méthode simple pour disséquer la façon dont les produits de gènes exogènes peuvent influencer la distribution de ligands à travers un champ de cellules. Xenopus laevis fournit un excellent système pour entreprendre ces types d'expériences que leurs embryons se développent à l'extérieur afin qu'ils soient accessibles dès les premiers stades. Leur grande taille (1-1.5mm de diamètre) simplifie la micro-injection et la manipulation chirurgicale et par étapes, la blastula cellules sont faciles à l'image car ils sont encore relativement grande (environ 2081; m de diamètre). Études de surexpression dans Xenopus sont simples à faire: ARNm injectés dans l'embryon précoce peuvent être ciblés vers des cellules particulières et est efficacement traduits.

Les constructions Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP fluorescence marqués ont été générés en utilisant pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 et eGFP. Le peptide HA est important de comprendre, non seulement pour fournir une étiquette supplémentaire moléculaire, mais aussi parce que l'on pense à agir comme une entretoise qui sépare les protéines Wnt et eGFP permettant à la fois des produits de gènes de fonctionner. Le produit d'assemblage utilisé pour la visualisation de Shh a été précédemment utilisée pour générer une souris transgénique exprimant une protéine de fusion eGFP Shh-15; cela a été aimablement fourni par Andy McMahon. Fait important, l'étiquette de GFP pour toutes les constructions est clonée en 3 'de la séquence de signal de telle sorte qu'il est retenu après le traitement. Il est également essentiel de veiller à ce que la protéine finale comprend des séquences nécessaires à la modification, par exemple supplén des lipides comme est le cas pour Shh et Wnt ligands ADNc ont été sous-cloné dans le vecteur d'expression pCS2 + qui est optimisé pour la prodution de l'ARNm synthétique; il comprend un promoteur SP6 et le signal de polyadénylation (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).

Le travail décrit ici fournit un protocole simple pour comparer la sécrétion et la diffusion de fluorescence étiqueté Wnt et Shh marqués ligands. En injectant des quantités définies de l'ARNm synthétique, le protocole fait le tour des problèmes associés à l'expression variable à partir de différents vecteurs utilisant différents promoteurs. Ces méthodes ont été récemment appliqué pour étudier les effets du sulfate d'héparane endosulfatase Sulf1 sur Shh-eGFP et Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP la sécrétion et la diffusion chez Xenopus 16-17.

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Protocole

Ethique déclaration: Les expérimentations animales ont été effectuées au Royaume-Uni en vertu d'une licence de foyer de bureau pour MEP et les expériences réalisées a été approuvé par le Comité de l'Université de York à l'éthique en conformité avec la ARRIVE (Animal Research: déclaration des expériences in vivo) des lignes directrices. (https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

1. Stratégie pour générer fluorescence Tagged Ligands

Voici un exemple de protocole pour le sous-clonage Wnt8a-HA et eGFP dans pCS2, afin de produire de la fusion dans le cadre construire WNTA-HA-eGFP:

  1. Les réactions de PCR en place et exploite pour Wnt8a-HA et eGFP. Utilisez les informations affichées dans amorce la réaction et Tableau 1 Exemple Exemple PCR et PCR conditions affichées dans le tableau 2. Remarque: Template ADN varie en fonction de la construction en cours de production, dans cet exemple, Wnt8a-HA est utilisé comme matrice d'ADN.
  2. Nettoyer réactions de PCR en utilisant un kit d'extraction sur gel, à effectuer une élution finale 30μl d'eau moléculaire de qualité.
  3. Vérifiez 2 pi de produit de PCR sur un gel agarose à 1% préparé dans TAE.
  4. Digest Wnt8a-HA et de produits PCR EGFP et pCS2 en utilisant les enzymes de restriction appropriées (voir le tableau 1), mis en place des réactions comme décrit dans le tableau 2 (produit de l'exemple PCR digest).
  5. Incuber réactions pendant 3 heures à 37 ° C, puis stocker Wnt8a-HA et GFP PCR produits sur la glace.
  6. Ajouter 1 ul de phosphatase intestinale de veau alcaline (ACFI) pour pCS2 Digest et incuber pendant 6 min à 37 ° C.
  7. Chaleur inactiver ACFI par incubation pendant 15 min à 65 ° C.
  8. Exécuter pCS2 PCR et de digestion sur un gel d'agarose ultrapur 1% préparée dans du TAE.
  9. Extrait de gel et de nettoyer pCS2 et les produits de PCR utilisant un kit d'extraction de gel, effectuent élution finale dans 30 pi d'eau moléculaire de qualité.
  10. Mettre en place une ligature comme décrit dans le tableau 2 (Exemple T4 ligature) et incuber à 12 ° C pendant 16 heures.

2. ARNm Synthèse: Génération de la Template

  1. Produire modèles en utilisant l'enzyme de restriction digestion des plasmides suivants (tous dans le vecteur d'expression pCS2): membrane Cerulean (memCerulean), membrane-DP (memRFP), Shh-GFP, Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP.
    1. Mettre en place restriction digère comme décrit dans le tableau 2 (Exemple modèle digérer).
    2. Mélanger doucement et incuber les réactions pendant 2 heures à 37 ° C.
  2. Exécutez 2,5 pi de plasmide digéré sur un gel agarose à 1% (TAE) pour vérifier que la réaction a coupé à la fin.
  3. Nettoyer les digestions en utilisant un kit d'extraction de gel, effectuez élution finale dans 50 pi d'eau moléculaire de qualité.

3. ARNm Synthèse: Transcription in vitro

  1. Synthétiser ARNm fonctionnels en utilisant le kit de transcription SP6 ARNm. Assemblez les réactions dans 1,5 ml de DNAse / RNAse microtubes libre.
  2. Mise en place des réactions de transcription de l'ARNm, comme décrit dans le Tableau 2 (Exemple de synthèse de l'ARNm).
  3. Mélanger leréactions doucement avec une pipette puis incuber à 37 ° C pendant 4 heures.
  4. Voir les 1 pi de la réaction sur un gel d'agarose à 2% (TAE).
  5. Ajouter 1 ul de désoxyribonucléase à la réaction, mélanger doucement avec une P20 et incuber la réaction pendant encore 15 min à 37 ° C.
  6. Ajouter 340 ul d'eau à niveau moléculaire, 40 ul d'acétate d'ammonium et 400 ul de phénol-chloroforme au mélange réactionnel. Vortex les réactions pendant 30 sec.
  7. Spin l'ARNm pendant 5 min, 14 000 xg, 4 ° C.
  8. Pipeter haut (aqueuse) couche de chaque réaction déplaçant vers un nouveau tube de 1,5 ml vis bouchon de microcentrifugeuse.
  9. Ajouter un volume égal de chloroforme pour chacune des réactions décantées. Vortexer les échantillons pendant 30 sec.
  10. Produit dérivé de l'ARNm de 5 min, 14000 xg, 4 ° C
  11. Introduire à la pipette la couche aqueuse supérieure de chaque réaction déplacer vers un 1,5 ml bouchon à vis nouveau tube à centrifuger.
  12. Ajouter un volume égal d'isopropanol à chacune des réactions et précipiter le mRNA à -80 ° C pendant 30 min.
  13. Spin chacune des réactions pendant 15 min à 14 000 xg, 4 ° C pour sédimenter l'ARNm
  14. Eliminer le surnageant en prenant soin de ne pas perturber l'ARNm granulés
  15. Ajouter 200 pi d'éthanol à 70% à chacune des réactions, mélanger les réactions et ensuite tourner pendant 10 min à 14 000 xg, 4 ° C.
  16. Éliminer l'éthanol en prenant soin de ne pas perturber l'ARNm, sécher le culot à la température ambiante en utilisant un dessiccateur à vide ou speed-vac.
  17. Re-suspendre l'ARNm dans 10-20 pi d'eau moléculaire de qualité. Spin brièvement et conserver les échantillons sur la glace. Remarque: Le chauffage de l'échantillon à 80 ° C pendant 1 min peut aider à se dissoudre.
  18. 1 ul d'exécution de l'ARNm sur un gel d'agarose à 2% (TAE) et 1,2 ul analyser sur un spectrophotomètre pour obtenir une lecture précise de la concentration.
    Étape critique: Une concentration de 400 ng / ul d'ARNm synthétique est nécessaire pour réaliser les expériences suivantes.
    Étape cruciale: Si le rapport est 260/280en dehors de la gamme de 2,00 à 2,20, ou la quantité totale d'ARNm est supérieure à 12 pg, de procéder à une précipitation au chlorure de lithium.
  19. Magasin ARNm dans 1 ul aliquotes à -80 ° C. Utilisez aliquotes puis jeter; ne recongeler pas ARNm.

4. Génération Xenopus laevis embryons

  1. Premier Xenopus laevis femelles par injection sous-cutanée avec 50 unités de l'hormone gonadotrophine chorionique humaine (HCG); Chorulon une semaine avant l'expérience.
  2. Provoquer Xenopus laevis femelles la nuit avant l'expérience en injectant 250 unités de HCG et en les incubant dans l'obscurité, O / N à 19 ° C.
  3. Disséquer les testicules de grenouille mâle euthanasiés et stocker dans 1xNAM à 4 ° C. REMARQUE: grenouille mâle est euthanasié par anesthésie terminale conformément à l'annexe 1 des animaux (Scientific Procedures) Act 1986 (https://www.nc3rs.org.uk/euthanasia).
  4. Massage femme Xenopus laevis pour induire l'ovulation, recueillir le laœufs de id dans une boîte de Pétri ronde de 55 mm de diamètre.
  5. Produire une suspension de spermatozoïdes par écrasement d'un testicule ¼ de Xenopus laevis dans 1 ml d'eau désionisée.
  6. Brosse ovocytes de Xenopus avec la suspension de spermatozoïdes broyé à l'aide d'une pipette et la pipette Pasteur ampoule étape critique:. Réaliser des réactions de fertilisation à environ 16h30 le jour de l'expérience.
  7. Embryons de culture à 21 ° C dans NAM / 10 (voir le tableau 3) pour les solutions à 55 mm boîtes de Pétri revêtues d'agarose à 1% dilué dans l'eau (l'eau).
  8. De-embryons gelée après 45 min en utilisant cystéine / HCL (tableau 3). Remarque: A 21 ° C, les embryons atteignent le stade 2 cellules après 90 min et cliver toutes les 20 min après.

5. micro-injection d'embryons de xénope

  1. Utilisation 1 x 90mm capillaires en verre et une Narishige PC-10 à double étage micropipette de verre extracteur, tirez micropipettes pour préparations injectables. Réglez les paramètres de manière empirique pour atteindre une pointe fine (moins d'un micron Diameter).
  2. Joindre une micropipette (aiguille) à un micro-injecteur de gaz (par exemple, le Harvard Appartaus PLI-100 PICO-injecteur) pour fournir de manière répétée des volumes précis de liquide en appliquant une pression régulée pour une période de temps définie numériquement. Régler la pression pneumatique pour délivrer un volume de 1,25 à 10 nanolitres comme déterminé en utilisant une lame de calibrage ou réticule.
  3. Manteau une boîte de Pétri de 55 mm avec 5 ml d'agarose à 1% (l'eau). Couper un carré de 35-35 mm d'agarose sur le plat, ce qui fournira une surface stable à micro-injection d'embryons.
  4. Embryons de transfert dans NAM / 3 + Ficoll (tableau 3) et passer à plat d'injection.
  5. Injecter des embryons dans l'hémisphère animal une fois qu'ils atteignent le stade requis pour l'expérience.
    1. Pour analyser la distribution des ligands GFP marqués sur la surface cellulaire, injecter les embryons bi-latéralement au stade de deux cellules, NL10 par cellule. Dilutions Exemple ARNm dessous pour Wnt8a-HA-EGFP. Étape critique: Assurez-vous que tous les ARNm concentrations start à 400 ng / ul.
      Remarque: La quantité d'ARNm à injecter doit être déterminée empiriquement en testant des concentrations et à trouver la quantité minimale nécessaire pour visualiser le ligand fluorescent. Western blot en utilisant un anticorps anti-HA est une étape essentielle pour déterminer que les ARNm sont traduits à des niveaux similaires afin de permettre la comparaison des deux ligands marqués par fluorescence différentes; nous avons fait cela pour Wnt8a-HA-eGFP et Wnt11b-HA-eGFP dans Fellgett et al., 2015.
      Remarque: Lors de l'évaluation de l'effet d'une injection d'ARNm (comme celui codant pour un régulateur de candidat), un contrôle typique consiste à injecter un ARN non-actif, comme LacZ, dans des embryons de frères et soeurs afin de contrôler les éventuels effets de la supplémentaires transcrits dans l'embryon.
      1. Diluer une memRFP ARNm en 4 (1 pi 3 pi + dH 2 O) avec de l'eau de qualité moléculaire pour réduire la concentration de 100 ng / ul.
      2. Diluer Wnt8a-HA-eGFP ARNm 1 à 4 (1 pi 3 pi + dH2 O) avec de l'eau de qualité moléculaire pour réduire la concentration de 100 ng / ul.
      3. Mélanger memRFP ARNm dans un rapport de 1: 1 avec Wnt8a-HA-eGFP ARNm.
      4. Mélanger 5.5.1.3 ARNm à partir d'un rapport de 1: 1 soit avec l'ARNm LacZ ou contrôle un modulateur tel que Sulf1.
      5. Injecter embryons bilatérale à l'étape 2 de la cellule avec NL10 de l'ARNm par cellule (total de 20NL). Note: Ceci se traduit par 250 pg de m em DP, 250 pg de Wnt8a-HA e GFP, 500 pg de Wnt11b-HA e GFP et 2 ng de LacZ ou Sulf1 ARNm étant injecté dans chaque cellule.
    2. Pour analyser la diffusion de GFP étiqueté ligands, injecter l'ARNm codant pour le ligand-GFP avec un marqueur de lignage tel que memRFP au stade 16-32 cellulaire, 1,25 nl par cellule.
    3. Pour analyser les effets d'un modulateur potentiel de diffusion de ligand, co-injecter l'ARNm codant pour le modulateur avec le ligand et le traceur lignée. Alternativement, injecter des cellules voisines: l'une avec des ARNm codant pour la GFP ligan baliséd et un traceur de lignage (memRFP) et l'autre avec ARNm codant pour le modulateur et un traceur de lignage différent (memCerulean).
  6. Embryons de transfert à un incubateur et la culture 12,5 ° jusqu'à ce que le lendemain, Nieuwkoop et Faber (NF) étape 8.

6. excision animaux Cap explants

  1. Embryons de transfert à un 55 mm boîtes de Pétri revêtues de 5 ml d'agarose à 1% (l'eau). Remplissez le plat avec NAM / 2 (Tableau 3).
  2. Prenez calottes animales circulaires utilisant des aiguilles de tungstène étape critique:. Prenez les grandes capitalisations à ce stade car ceux-ci guérissent mieux et seront plus faciles à l'image, gardez bouchons de contrôle pour assurer aucune extension convergente se produit.
  3. Transfert explants d'animaux à 55 mm boîtes de Pétri revêtues d'agarose à 1% (l'eau) et les embryons de culture à 21 ° C pendant 4 heures étape critique:. L'incubation de 4 heures est nécessaire pour permettre protéines fluorescentes de mûrir.
  4. Générer toboggans de secours en collant bas deux couches de PVC insulation bande sur des lames de microscope. Coupez un 14 mm par 10 mm rectangle sur la bande de quitter une chambre pour le montage calottes animales étape critique:. Aplatir les deux couches de ruban à fond sur la lame avant de couper le rectangle.
  5. Pipette 2 gouttelettes distinctes de NAM / 2 (Tableau 3) dans la culasse de secours, environ 30 pi par goutte.
  6. Transfert explants d'animaux à des diapositives de secours à l'aide d'une pointe de P20 couper et d'orienter de sorte que le côté apical tournée vers le haut. Remarque: Chaque diapositive peut contenir 10-15 calottes animales étape critique:. A ce stade, les calottes animales auraient partiellement guéri, ce qui signifie qu'ils sont moins fragiles et peuvent être orientées en utilisant une pince.
  7. Abaissez délicatement une lamelle de verre sur la glissière de secours et de permettre la lamelle à sécher pendant 20 min étape critique: La taille de la calotte animale est cruciale;. assurer le bouchon est assez grand que lorsque la lamelle de verre est abaissée sur la glissière de secours il comprime la couche apicale des cellules suffisant pour pr capitalisation animaleoduce une surface plane à l'image. Si les calottes animales sont encore trop petit puis réduire la bande de PVC à une couche.
  8. Sceller la diapositive à l'aide de vernis à ongles étape critique:. Ne pas utiliser trop de vernis à ongles pour sceller les toboggans de secours parce que si la bande PVC devient trop humide, il ressuscitera et la ruine de la diapositive.
  9. Toboggans de secours sec pendant 20 minutes dans l'obscurité et ils sont prêts à l'image, généralement calottes animales resteront sain pour 4-6 heures, une fois scellé dans la diapositive.

7. Imaging

Remarque: L'imagerie a été effectuée en utilisant un microscope confocal inversé. Mode Lambda a été choisi pour l'imagerie que cela a permis de multiples fluorophores avec chevauchement de signatures pour être utilisés, et retiré le problème du mouvement de l'échantillon potentiel entre les balayages.

  1. Trouver explants utilisant un objectif faible grossissement passe alors au 63x / 1.4 objectif de pétrole aux images à haute résolution.
  2. Allumez lasers nécessaires; pour cet exemple, le 405laser a été utilisé pour exciter memCerulean, le laser 488 a été utilisée pour exciter le laser et la GFP pour exciter memRFP 561 405 et 488/561 en utilisant des miroirs dichroïques.
  3. Utilisez le mode de lambda (Dans le Zen 2011, sélectionnez le mode de lambda - 32 bacs).
  4. Sélectionnez le 405nm, 488nm et 561nm lasers.To permettre un plus large champ de vue, rétrécir l'image (à 0.6x).
  5. Réglez la taille de l'image à la taille de l'image souhaitée (1024 x 1024 avec des tailles de pixels de 220 nm a été utilisé pour cet ensemble de données).
  6. Mettre en moyenne typiquement de 4 à 8 pour augmenter le rapport signal à bruit.
  7. Optimiser le (unité 1 aérée selon le laser de 561nm a été utilisé pour cet ensemble de données) sténopé.
  8. Optimiser les puissances laser étape critique:. Équilibrer les 405nm, 488nm et 561nm lasers tels que tous les fluorophores peuvent être détectés à l'aide du tableau 32 du détecteur tout en minimisant la quantité de tension et de gain requis.
  9. Recueillir l'être la lumière émise par memCerulean, GFP et memRFP. Pour cette lampe de travail ont été recueillies chaque ~10nm de 415-720nm, bien que les intervalles de collecte plus grands sont également possibles (par ex., Tous les ~ 20 nm).

Analyse 8. Image

  1. Étudier les effets des modulateurs sur l'expression de surface cellulaire des ligands de la GFP étiqueté
    REMARQUE: Les étapes suivantes sont un guide détaillé de la façon dont l'analyse a été effectuée dans notre laboratoire. L'utilisateur final peut vouloir rationaliser le processus en écrivant un script ImageJ ou FIDJI à supprimer certains des étapes manuelles.
    Étape critique: Il est important que l'utilisateur échantillons finaux du spectres de toutes les fluorophores utilisés dans les mêmes conditions que la dernière expérience est réalisée afin de perf orm démixage spectral efficace des multiples fluorophores utilisés dans l'expérience finale.
    Deux principaux types d'analyses sont effectuées dans cette section:
    1. Le calcul du nombre total de Wnt-HA-eGFP pixels co-Localising avec la membrane cellulaire.
      1. UNMIX le vert,canaux rouge et bleu azur en utilisant les spectres de l'échantillon à partir des injections uniques de ces fluorophores dans le logiciel ZEN. Enregistrer ces images comme documents de LSM séparés à utiliser dans toutes les étapes suivantes.
      2. Ouvrir LSM fichiers directement dans le logiciel de retouche d'image. Remarque: Les instructions suivantes sont pour les Fidji J. Image
      3. Enregistrez les images de LSM comme documents de séquences d'images, cela va diviser automatiquement les images dans les canaux séparés.
      4. Enregistrer la séquence d'images dans le même dossier que les scripts pour le logiciel d'analyse de script qui seront utilisés pour analyser les données (voir les fichiers de code supplémentaires pour un script réelle). Remarque: Les instructions suivantes sont pour Matlab.
      5. Ouvrez le logiciel d'analyse de script et ouvrez le répertoire dans lequel les scripts sont écrits.
      6. Entrez le nom du fichier en cours d'analyse de localisation, le logiciel va prendre le nom de fichier et effectuer l'analyse.
        Remarque: Les noms de fichiers vont lire ImageA0000 et ImageA0001 pour chaque image. Le logiciel d'analyse de script va utiliser l'image marqué 0001 que le masque et d'analyser le pourcentage de pixels dans l'image 0000 que la co-localisation avec ce masque.
      7. Prenez le nombre pourcentage co-localisation (annoté que la membrane cellulaire peuplée) et le copier vers un tableur. Remarque: Les instructions suivantes sont pour Excel.
      8. Tracer le nombre pourcentage co-localisation sur un graphique à barres soit en valeur absolue ou relative.
    2. Analysant le nombre, la taille et la forme de Wnt-HA-eGFP lacrymaux.
      1. Ouvrir LSM mêlée fichiers directement dans le logiciel de retouche d'image. REMARQUE: Les instructions suivantes sont pour les Fidji J. Image
      2. Fendez chaque image en ses canaux séparés (Image> Couleur> canaux Split).
      3. Seuil fois la voie Wnt-HA-eGFP et les canaux de marqueurs de membrane (Image> Réglages> Auto-seuil) étape critique:. Essayez un certain nombre de seuils pour voir celle qui donne une image représentative, sans surexposerla chaîne.
      4. Convertir le canal de marqueur membranaire à un masque (Processus> Binary> Assurez-masque).
      5. Inversez ce masque (Edition> Inverser).
      6. Convertir les points lacrymaux Wnt-HA-eGFP à un masque comme ci-dessus.
      7. Soustraire le masque de marqueur de la membrane du masque ligand-GFP (Processus> Calculateur Image> masque Wnt dans top box, le masque de la membrane dans la case du bas).
      8. Utilisez la fonction de particules analyser. De là, sélectionnez les paramètres requis et analyser les données (particules Analyse> Analyser).
      9. Copiez le nombre de particules, la taille moyenne des particules et des données de circularité dans un tableur, puis tracer des graphiques à partir de ces données. Remarque: Pour cette analyse, seules les particules entre 2 0.1-10μm taille ont été analysés, pas de restrictions ont été placés sur la circularité des particules. Cette instruction est pour Excel.
  2. L'analyse de la gamme de la diffusion de ligand
    1. Ouvrez toutes les images non mélangés dans im confocalevieillissement de logiciel, puis exporter les fichiers dans un format TIF, comme données brutes et comme une image RVB Remarque:.. Cette instruction est pour Zen Lite 2,011 étape critique: Inclure une barre d'échelle sur au moins l'une des images de telle sorte que la distance peut être calculé au cours de l'analyse.
    2. Ouvrir les images à analyser dans un logiciel d'analyse d'image. Remarque: Les instructions suivantes sont pour Photoshop 8.2.3) clic droit sur ​​le fond de l'image et sélectionnez "couche de fond ', pour créer une nouvelle couche..
    3. Réglez les canaux de marqueur membranaire à 0, de sorte que seul le canal de ligand-GFP est visible (Calque> Nouveau calque de réglage> Mélangeur de canaux) ÉTAPE CRITIQUE:. Fixez le nouveau calque de réglage de l'image en cours d'analyse, l'option à clipser la nouvelle couche à cette image est disponible comme une case à cocher après avoir cliqué sur l'option de mélangeur de canaux.
    4. Ouvrez un nouvel espace de travail. Réglez la résolution sur 300 pixels par pouce et le mode de couleur à la couleur RGB (Fichier>Nouveau> Clipboard).
    5. Copie de toutes les images en cours d'analyse dans le seul espace de travail (Cliquez sur l'image et il est coupé mélangeur de canaux en maintenant le contrôle puis maintenez contrôle et Alt et faites glisser l'image dans l'espace de travail).
    6. Orienter l'ensemble des images de sorte que la longueur maximale de diffusion pour chaque image peut être mesurée le long de l'axe horizontal, avec les cellules exprimant Wnt-HA-eGFP orienté vers la gauche.
    7. Enregistrer l'espace de travail en tant que TIF, puis ouvrir ce dans le logiciel d'analyse d'image. Remarque: Les instructions suivantes sont pour les Fidji J. Image
    8. Ouvrez la fenêtre du gestionnaire de ROI (Analyser> Outils> Gestionnaire de ROI).
    9. Dessiner un rectangle sur la première image, la taille exacte du rectangle peut être spécifié (outil de sélection rectangle et dessinez un rectangle> Modifier> Sélection> Spécifiez). Remarque: Une taille de 650 x 100 pixels longueur x largeur a été utilisée dans cette étude.
    10. Positionnez le rectangle sur le bord du domaine exprimant Wnt-HA-eGFP. Placez le rectangle sur la zone de la distance maximale de diffusion Wnt-HA-eGFP. Étape critique: Même sans le marqueur de la membrane des régions exprimant Wnt-HA e GFP devrait être visible en raison de la fluorescence de fond; si pas alors consulter les images brutes.
    11. Maj la boîte 10 pm à la droite. Déterminer le nombre de micromètres en mesurant la longueur de la barre d'échelle inclus dans l'une des images (Tracez une ligne traçant la barre d'échelle> Analyse> set d'échelle). Note: Ceci fournit une valeur pour 10 uM en pixels.
    12. Ajouter la boîte à la gestionnaire de ROI en appuyant sur le bouton d'ajout dans la fenêtre du gestionnaire ROI.
    13. Déplacer rectangle à l'image suivante à mesurer en cliquant retour sur l'outil Rectangle pour déplacer le rectangle. Répétez les étapes 8.2.10-11.
    14. Une fois que tous les panneaux ont été mesurés, sélectionnez multicourbes dans le menu de gestionnaire de ROI (gestionnaire de ROI> Plus> multicourbes> Liste).
      Remarque: les données représentent Wnt pixel intensity (Y) avec la distance le long de l'axe horizontal (X, mesurée en pixels). La valeur de Y est l'intensité de signal moyenne de ligand-GFP au point X et la moyenne est calculée à partir de tous les pixels de l'axe Y pour chaque valeur de X. Par conséquent, le plus grand de la boîte, plus les pixels seront analysés pour produire cette moyenne. Une petite boîte (dans l'axe Y) sera plus bruyant; une boîte de hauteur aura très faible intensité de pixel moyenne.
    15. Copier les données de la boîte de multicourbes dans un tableur et re-étiquette en conséquence. Remarque: Les instructions suivantes sont pour Excel.
    16. Jeter le premier 10-20μm des données de chaque analyse, car cela représente la fluorescence de fond provenant de cellules exprimant ligand-GFP et déforme les graphiques.
    17. Ouvrez l'analyse graphique et des logiciels scientifiques et de créer un nouvel ordinateur portable. Remarque: Les instructions suivantes sont pour Sigmaplot 13.
    18. Etiqueter le nombre requis de colonnes pour les données en double-cliquant sur les chiffres horizontales on la feuille de calcul et de les étiqueter distance en um, Wnt8a-HA-eGFP et Wnt11b-HA-eGFP.
    19. Copier des données à partir de la feuille de calcul dans les colonnes pertinentes dans l'analyse et graphique des logiciels scientifiques.
    20. Créez un nuage de points (Créer graphique> Scatter> scatter Multiple> Sélectionner X nombre Y> Sélectionnez la colonne à distance pour X> Sélectionnez Wnt8a-HA-eGFP et Wnt11b-HA-eGFP pour les valeurs Y> Terminer).
    21. Effectuer une analyse de régression sur la courbe Wnt8a-HA-eGFP par un clic gauche sur un point Wnt8a-HA-eGFP sur le nuage de points. Tous les points doivent mettre en évidence. Cliquez sur Analyse> Assistant de régression.
    22. Sélectionnez la catégorie de l'équation de la courbe (de décroissance exponentielle) et le nom de l'équation (Simple, 3 paramètres) puis appuyez sur suivant.
    23. Sélectionnez les valeurs X et Y à laquelle doit être monté la courbe (si les données a été souligné précédemment, cela devrait être fait automatiquement) puis appuyez sur Suivant.
    24. Continuez de l'Assistant jusqu'à ce que l'option de sortie numériques page assurer «Créer le rapport" est cochée puis cliquez sur Suivant. Remarque: Les paramètres de la courbe ajustée seront affichés dans le rapport 1 *.
    25. Sur la page des options du graphique assurer 'ajouter équation pour représenter graphiquement le titre' est cochée puis appuyez sur Terminer. Remarque: L'assistant aura créé Rapport 1 * et le graphique 1 * onglets en haut du carnet de note. En outre, la courbe ont été ajoutés à la courbe produite en (02/08/20).
    26. Répétez les étapes 8.2.21-8.2.25 à ajuster une courbe pour Wnt11b-HA-eGFP étape critique:. Essayer de montage multiples catégories d'équations et les noms d'équations aux données. Remarque: La courbe avec le meilleur ajustement devrait produire le R 2 plus haute valeur avec le plus faible somme résiduelle des carrés.

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Résultats

Analyse confocale des explants de plafonnement des animaux exprimant des protéines par fluorescence taggés fournit un système efficace pour la visualisation de la distribution de ligand dans différentes conditions expérimentales. Dans un exemple, la distribution de la GFP étiqueté Shh est représenté (figure 1). Au stade 2 cellules, les embryons de Xenopus sont injectés dans les cellules avec soit avec un ARNm de commande ou avec l'ARNm codant pour Sulf1, une enzyme qui modifie l'héparan...

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Discussion

Une partie essentielle de ce protocole est de générer des ligands biologiquement actifs qui sont normalement traitées, sécrétés, et capables de déclencher une réponse dans la cellule réceptrice, en dépit d'un fragment fluorescent attachée. Il est essentiel d'établir que le produit du gène étiquetées par fluorescence est biologiquement active avec un essai approprié. Pour Shh-GFP, la capacité d'activer l'expression de PTC1 16 a été confirmée. Wnt8a a une capacité remarquablement puissa...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été financé par un BBSRC accorder aux MdPE (BB / H010297 / 1), un quota de stagiaire de BBSRC SAR, et une bourse d'études de la MRC au format SWF.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AgaroseMelfordMB 1200
Acétate d’ammoniumAmbionFrom Megascript SP6 Kit AM 1330
BicarbonateVWR InternationalRC-091
Nitrate de calciumSigmaC13961
Capuchon analogue (m7G(5'))AppliedBiosystemsAM 8050
ChloroformeSigmaC 2432
Chlorhydrate de L-cystéine monohydratéSigmaC7880
dNTPsInvitrogen18427-013
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)SigmaO3690
ÉthanolVWR International20821.33
Ficoll 400SigmaF 4375
Fiji image J softwareTéléchargement gratuit http://fiji.sc/Fiji
GentamycinMelfordG 0124
Acide acétique glacialFisher ScientificA/0400/PB17
Couvercles en verre, n°1.5  ;Fournitures de laboratoire scientifique22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030  ;
Extracteur d’aiguille en verreNarishigeNarishige PC -10
Aiguilles en verreDrummond Scientific3-000-203-G/X
Gonadotrophine chronique humaine (HCG)Intervet
IsopropanolFisher ScientificP/7500/PB17
Chlorure de lithium (LiCl)SigmaL-7026
LSM710 et Logiciel Zen (2008-2010)Logiciel Carl Zeiss
MatlabMathworkshttp://uk.mathworks.com/
Eau de qualité moléculaire  ;Fisher ScientificBP 2819-10
Vernis à ongles  ;Bootscode-barres 3600530 373048
SpectrophotomètreLab.tech InternationalND-1000 / ND8000
Boîte de Pétri (55 mm)VWR International391-0865
Phénol-chloroformeSigmaP3803
Logiciel PhotoshopAdobehttp://www.photoshop.com/products
ADN polymérase haute fidélité et tampons  ;BiolabsM0530S  ; Tampon - M0531S
Chlorure de potassium (KCl)Fisher ScientificP/4280/53
Ruban isolant PVCOnecallSH5006MPK
Kit d’extraction de gel  ;QiagenS28704
Tampons d’enzymes de restrictionRocheSuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001
DNAse sans RNAsePromegaME10A
Lames à simple tranchant à dos en acierPersonna66-0403-0000
Chlorure de sodium (NaCl)Fisher Scientific27810.364
SP6 kit de transcriptionAmbionAM1330
Lames en verreThermo FisherSHE 2505
Base TrisInvitrogen15504-020
Aiguilles en tungstène faitesmaison
Zen lite softwareCarl ZeissTéléchargement gratuit http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html
,

Références

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Mots-clés

Microscopie confocalediffusion des ligandsmarquage fluorescentligands Wntligands Shhmicrodissectioncalottes animalesanalyse d images

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