Bactérienne Artificial Chromosomes: Un outil de génomique fonctionnelle pour l'étude du brin positif de virus à ARN

Résumé

Ici, un protocole est présenté pour la création d’un chromosome artificiel bactérien infectieux contenant un ADNc pleine longueur de l’ARN génomique à brin positif du virus de l’encéphalite japonaise. Ce protocole peut être utilisé pour construire un ADNc fonctionnel d’autres virus à ARN à brin positif, ce qui en fait un outil génomique puissant pour l’étude de la biologie des virus.

Résumé

La génétique inverse, une approche visant à sauver un virus infectieux entièrement à partir d’un ADNc cloné, a révolutionné le domaine des virus à ARN à brin positif, dont les génomes ont la même polarité que l’ARNm cellulaire. Le système de génétique inverse basé sur l’ADNc est une méthode fondamentale qui permet la manipulation directe de l’ARN génomique viral, générant ainsi des virus recombinants pour les études moléculaires et génétiques des éléments de l’ARN viral et des produits géniques dans la réplication virale et la pathogenèse. Il fournit également une plate-forme précieuse qui permet le développement de vaccins génétiquement définis et de vecteurs viraux pour l’administration de gènes étrangers. Cependant, pour de nombreux virus à ARN à brin positif tels que le virus de l’encéphalite japonaise (JEV), les ADNc clonés sont instables, ce qui constitue un obstacle majeur à la construction et à la propagation de l’ADNc fonctionnel. Le présent rapport décrit ici les considérations stratégiques liées à la création et à l’amplification d’un ADNc infectieux JEV pleine longueur génétiquement stable en tant que chromosome artificiel bactérien (BAC) à l’aide des procédures expérimentales générales suivantes : isolement de l’ARN viral, synthèse de l’ADNc, sous-clonage et modification de l’ADNc, assemblage d’un ADNc complet, linéarisation de l’ADNc, in vitro Synthèse de l’ARN et récupération du virus. Ce protocole fournit une méthodologie générale applicable au clonage de l’ADNc complet pour une gamme de virus à ARN à brin positif, en particulier ceux dont le génome est de >10 kb de longueur, dans un vecteur BAC, à partir duquel les ARN infectieux peuvent être transcrits in vitro avec une ARN polymérase bactériophage.

Introduction

Pour virologues d'ARN, l'avènement de la technologie de l'ADN recombinant dans les années 1970 a permis de convertir des génomes d'ARN viraux dans des clones d'ADNc, qui pourrait ensuite être propagées sous forme de plasmides dans des bactéries pour la manipulation génétique des virus à ARN. ¹ Le premier virus à ARN soit clonage moléculaire était bactériophage Qß, un virus à ARN brin positif qui infecte Escherichia coli. Un plasmide contenant une copie complète de l'ADNc de l'ARN génomique Qß a donné lieu à des phages infectieux Qß lorsqu'il est introduit dans E. coli. ² Peu de temps après, cette technique a été appliquée au poliovirus, un virus à ARN brin positif des humains et des animaux. Un plasmide portant un ADNc pleine longueur de l'ARN génomique du poliovirus a été infectieuse quand transfecté dans des cellules de mammifères et capable de produire des virions infectieux ³ Dans cette approche "de l'ADN-lancé", les ADNc clones devraient être transcrites intracellulaire pour lancer la réplication de l'ARN viral.cependant, il est difficile de savoir comment la transcription est initiée et la façon dont les transcriptions sont traitées à la séquence virale correcte. Cette préoccupation a conduit au développement d'une variante "ARN-lancé" approche, grâce à quoi une copie d'ADNc complète du génome de l'ARN viral est clone sous un promoteur reconnu par une E. coli ou de l'ARN polymérase du phage pour la production d'ARN de synthèse in vitro avec défini 5 'et 3', qui subissent le cycle complet de la réplication virale lorsqu'il est introduit dans des cellules hôtes. ^4,5 Le premier succès avec cette approche a été signalé pour Brome virus de la mosaïque , ^6,7 un virus à ARN brin positif de plantes. Depuis lors, l'approche de l'ARN lancé a été développé pour une large gamme de virus à ARN positif, y compris les calicivirus, les alphavirus, flavivirus, arterivirus et les coronavirus. ^1,4,5,8

Dans les deux ADN et ARN lancé systèmes de génétique inverse, la construction d'un full-ADNc clone est la clé pour générer l'ADN infectieux ou d'ARN de virus à ARN à brin positif, mais il devient un véritable défi technique que la taille du génome viral augmente. ^9-17 En particulier, un grand génome d'ARN de ~ 10 -32 kb présente trois obstacles majeurs à le clonage d'un ADNc fonctionnelle pleine longueur. ¹⁸ La première difficulté est la synthèse d'un ADNc fidèles copier, puisque la fidélité de RT-PCR est inversement proportionnelle à la longueur de l'ARN viral. Le second obstacle est la présence de séquences potentiellement toxiques, depuis de longues molécules d'ARN sont plus susceptibles de contenir des séquences imprévues capables de faire le fragment d'ADNc dans des plasmides instables dans E. coli. Le troisième et le plus important problème est la disponibilité d'un vecteur approprié, car il est difficile de trouver un vecteur de clonage qui peut loger un insert d'ADNc viral de> 10 kb. Au cours des trois dernières décennies, ces obstacles ont été surmontés par plusieurs avancées en enzymologie, la méthodologie, und vectorologie. ^1,4,5,8 Parmi ceux-ci, le développement le plus prometteur et innovant est le clonage de grands virus à ARN brin positif chromosomes bactériens artificiels comme infectieuses (BAC). Le vecteur BAC est un plasmide à faible copie clonage (1-2 copies / cellule) en fonction du E. coli facteur de fertilité, avec une taille d'insert moyenne d'ADN de ~ 120 à 350 kb ^{de 19 à 21} Un fragment d'ADN est inséré dans le vecteur BAC d'une manière similaire à clonage dans des vecteurs de clonage généraux. les clones BAC résultant sont stables depuis de nombreuses générations dans E. coli. ^22,23 À ce jour, la technologie de BAC a été utilisé pour créer des clones d'ADNc infectieux pour> 10 membres de trois familles de virus à ARN brin positif, à savoir, Flaviviridae, ^24-29 Arteriviridae, ^{30 et} Coronaviridae. ^{9,16,17 , 31,32}

Utilisant le virus de l'encéphalite japonaise (JEV) comme un exemple, le présent ouvrage présente les procédures détaillées qui peuvent êtreutilisé pour construire une pleine longueur BAC infectieuse génétiquement stable pour une variété de virus à ARN brin positif. JEV est un flavivirus zoonotique ³³ qui est transmis dans la nature entre les oiseaux, les porcs, et d'autres hôtes vertébrés par les moustiques vecteurs. ^34,35 Chez l'homme, l'infection peut provoquer le JEV grave souvent mortelle maladie neurologique encéphalite japonaise (EJ), ³⁶ qui se produit dans Asie et certaines parties du Pacifique occidental, ^37,38 avec une incidence annuelle estimée de ~ 50,000-175,000 cas cliniques. Le génome de ^39,40 JEV est un ~ 11 kb, simple brin, molécule d'ARN de sens positif et se compose de un seul cadre de lecture ouvert (ORF) flanqué de deux régions non codantes (DND) aux extrémités 5 'et 3' se termine. ^41,42 L'ORF code pour une polyprotéine qui est clivée par des protéases virales et hôte pour générer des 10 protéines individuelles, désigné C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B et NS5 dans la direction N- à C-terminale. De plus ^34,43,44, eXtended forme de NS1 (NS1) est exprimée par -1 déphasage ribosomique au niveau des codons 8-9 de NS2A. ^45,46 Sur ces 11 protéines, les trois protéines structurales (C, prM et E) sont indispensables pour la formation des maladies infectieuses ^47,48 virions, et les huit autres protéines non structurales (NS1 à NS5, et NS1 ') sont essentiels pour la replication virale de l'ARN, l'assemblage de particules ^{de 49 à 51, 52 à 56} et l'immunité innée évasion. ^57-59 Les deux extrémités 5' et 3 «DND contiennent conservées séquences primaires et les structures sous forme d'ARN secondaire / tertiaire, ^60-62 qui sont importants pour moduler la réplication de l'ARN viral. ^63,64

Ce protocole décrit les outils, les méthodes et les stratégies pour générer une pleine longueur BAC infectieuse de JEV SA ₁₄ -14 à 2. ²⁸ Ce clone BAC fonctionnel contient une copie complète de l'ADNc de l'ARN génomique JEV, ^{65 qui est} entouré par un promoteur pour l'ARN polymérase SP6 en amontde l'extrémité 5 'virale et un site de restriction Xba I unique, en aval de l'extrémité 3' virale pour la transcription in vitro de ruissellement. Cette technologie de BAC est applicable à la construction d'un clone moléculaire d'ADNc entièrement fonctionnelle pour un réseau de virus à ARN à brin positif.

Protocole

Remarque: La figure 1 présente une stratégie pour la construction d'une pleine longueur infectieux JEV ADNc comme un taux d'alcoolémie ^{de 28} Tableau 1 fournit une liste des oligonucléotides utilisés dans ce protocole ^28..

1. Extrait ARN viral à partir de particules JEV dans Cell surnageants de culture

1. Commencez avec le milieu de culture cellulaire contenant JEV SA ₁₄ -14 à 2, un virus de vaccin JE Live qui nécessite de biosécurité de niveau 2 de confinement.
   Remarque: Le titre viral est d'environ 1-3 × 10 ⁶ unités formant des plaques / ml.
2. Prenez la formation nécessaire en matière de biosécurité pour toutes les pratiques standards microbiologiques, équipements de sécurité, et des installations de laboratoire avant de travailler avec JEV SA ₁₄ -14 à 2.
3. On purifie l'ARN viral à partir d'un aliquote du milieu de culture de cellules contenant le virus en utilisant une solution monophasique de phénol et d'isothiocyanate de guanidine ⁶⁶ (figure 1A).
   1. Un dd 600 ul du réactif monophasique à 200 ul de surnageant de culture dans un microtube de 1,7 ml. Homogénéiser le mélange à la main-secouant vigoureusement le tube pendant 30 secondes et incubation pendant 5 min à température ambiante.
   2. Ajouter 160 pi de chloroforme pour l'échantillon homogénéisé. Mélanger soigneusement à la main-secouant vigoureusement le tube pendant 15 secondes et laisser pendant 2-3 min à température ambiante.
   3. Centrifuger le lysat à 13 400 × totale g pendant 15 min à 4 ° C, ce qui entraîne une séparation des deux phases liquides, à savoir, une phase organique inférieure et une phase aqueuse supérieure. Transférer la phase aqueuse supérieure (moins de 200 ul) contenant de l'ARN à un nouveau microtube.
   4. Précipiter l'ARN par addition de 1 pl de 5 pg / pl de glycogène et 400 ul de 100% d'isopropanol et en incubant pendant 10 min à température ambiante.
   5. Centrifugeuse le mélange à 13 400 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et laver le culot d'ARN avec 1 ml d'éthanol à 75% par impulsion vortex trois à cinqfois et centrifugation à 13 400 g pendant 5 min à 4 ° C.
   6. Sécher à l'air le culot d'ARN pendant 10 min et le dissoudre dans 40 pi de dH ₂ O. Stocker l'ARN extrait à -80 ° C jusqu'à utilisation.

2. Synthétiser un ensemble de quatre chevauchement ADNc Fragments (F1 à F4) couvrant toute la génomique virale ARN par transcription inverse (RT) -PCR

1. Effectuer une réaction de RT 20 pl avec une aliquote de 10 ul de l'ARN viral purifié comme matrice et une forme modifiée du virus de la leucémie murine de Moloney transcriptase inverse. ⁶⁷
   1. Configuration d'un mélange 13 ul contenant 10 ul de l'ARN purifié, 1 ul de 10 mM dNTP mix, 1 ul de 4 pmol / ul d'amorce et 1 ul de dH ₂ O. Utilisez l'amorce spécifique fragment pour chaque réaction RT: 1RT pour la F1, F2 pour 2RT, 3RT pour F3 et F4 pour 4RT.
   2. Incuber le mélange à 65 ° C pendant 5 min, placer sur la glace pendant 1 min, puis rapide centrifugation pour recueillir le contents au fond du tube.
   3. Ajouter 4 pi 5 x tampon RT, 1 pl de 0,1 M DTT, 1 inhibiteur de RNase ul 40 U / pl et 1 pl 200 U / ul transcriptase inverse. Mélanger par pipetage de haut en bas trois à cinq fois.
   4. Que la réaction se déroule à 50 ° C pendant 1 h, puis la chaleur inactiver l'échantillon à 70 ° C pendant 15 min. Stocker l'ADNc premier brin synthétisé à -20 ° C jusqu'à utilisation.
2. Effectuer une réaction de PCR de 100 pi avec une partie aliquote de 5 ul de la réaction RT inactivé par la chaleur en tant que matrice et une haute fidélité de l'ADN polymerase thermostable ⁶⁸ (figure 1B).
   1. Mettre en place une réaction de PCR de 100 pi sur de la glace, contenant 5 ul de la réaction RT, le tampon 20 ul de 5 x PCR, 4 pi de 10 mM dNTP mix, 5 ul de 10 uM d'amorce vers l'avant, 5 ul de 10 uM d'amorce inverse, une pi 2 U / ul d'ADN polymerase, et 60 ul de dH ₂ O. Utilisez la paire d'amorces spécifiques pour chaque fragment reactio PCRn: 1F + 1R pour la F1 (2 573 pb), 2F + 2R pour F2 (4171 pb), 3F + 3R pour F3 (3922 pb), et 4F + 4R pour F4 (1798 pb).
   2. Mélanger doucement en doigts de retournement le tube trois à cinq fois et brièvement de centrifugeuse pour recueillir son contenu au fond.
   3. Commencez thermocyclage avec une étape de dénaturation initiale de 30 sec à 98 ° C, suivi par 25-30 cycles avec le profil PCR suivant: 10 sec à 98 ° C, 30 sec à 60 ° C, et 1-2 min (30 l / kb) à 72 ° C. Stockez les produits de PCR à 4 ° C jusqu'à l'analyse.
3. Exécuter une aliquote de 2 à 5 pi de chaque réaction de PCR sur un gel d'agarose à 0,8% contenant 0,5 pg / ml de bromure d'éthidium (EtBr) (Figure 2).
   ATTENTION: EtBr est un mutagène puissant et nécessite des blouses de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants pour être portés et une extrême prudence à observer lors de son utilisation, le stockage et l'élimination.

3. Le sous-clone de chacun des quatre fragments d'ADNc (F1 à F4) dans un vecteur BAC à Créer pBAC / F1 pour pBAC / F4 bMolecular Cloning Techniques y

1. Digérer le vecteur et insérez ADN avec deux endonucléases de restriction appropriées, comme suit:
   1. Effectuez une digestion séquentielle de pBAC / SDRP / FL (vecteur), ³⁰ un dérivé du plasmide pBeloBAC11 (7507 pb, numéro d'accès GenBank U51113), avec Pme I et Not I dans un volume total de 60 ul (contenant ~ 500 ng d'ADN , 10 U enzyme, un tampon de digestion 1x, et 1 x BSA) à 37 ° C pendant 12 à 15 h, ce qui donne le fragment de vecteur 15 426 pb.
   2. Effectuer une digestion séquentielle de chacun des quatre amplicons d'ADNc (insert) avec Sma I et Not I dans un volume total de 60 ul (contenant ~ 1 pg d'ADN, 20 U enzyme, 1 x tampon de digestion, et 1 x BSA) à 25 ° C (Sma I) ou 37 ° C (Not I) pour 12 à 15 h, ce qui donne les fragments d'insertion ci-après de la taille souhaitée: F1 (2559 pb), F2 (4157 pb), F3 (3908 pb), et F4 (1784 pb).
2. Purifier ledésiré vecteur et insérer des fragments d'ADN par extraction de gel.
   1. Séparer les produits doublement digéré sur un gel d'agarose à 1 point de% bas point de fusion contenant 0,5 pg / ml EtBr. Découper une bande du fragment d'ADN souhaité avec un minimum d'agarose (habituellement ~ 200 ul) sous une lumière ultraviolette à ondes longues.
   2. Ajouter un volume égal de tampon TEM (10 mM de Tris-Cl, 1 mM d'EDTA et 10 _mM de MgCl2) à l'agarose excisé dans un microtube de 1,7 ml. Incuber l'échantillon à 72 ° C pendant 10 à 15 min, en vortexant toutes les 2-3 min jusqu'à ce que l'agarose soit complètement fondu.
   3. Ajouter un volume égal de phénol saturé de tampon préchauffé, vortexer vigoureusement pendant 1 min, et centrifuger à 13 400 xg pendant 10 min à température ambiante.
      Remarque: Le mélange se sépare en une phase organique inférieure et une phase aqueuse supérieure. Transférer la phase aqueuse supérieure contenant l'ADN dans un nouveau microtube.
   4. Ajouter un volume égal de chloroforme: alcool isoamylique (24: 1), vortex pendant 1 min, et centrifuger à 13,400 xg pendant 10 min à température ambiante. Transférer la phase aqueuse supérieure à un nouveau microtube.
   5. Ajouter 0,5 pi de 10 ug / ul d'ARNt de levure, 1/10 de volume de 3M acétate de sodium et 2,5 volumes d'éthanol à 100%. Gardez le mélange sur de la glace pendant 20 min.
   6. Centrifuger le mélange à 13 400 xg pendant 10 min à température ambiante. Retirer le surnageant et laver le culot d'ADN avec 1 ml d'éthanol à 70% par impulsion vortex trois à cinq fois et centrifugation à 13 400 g pendant 10 min.
   7. Sécher à l'air le culot d'ADN pendant 10 min et le dissoudre dans 20 pi de tampon TE (10 mM Tris-Cl et EDTA 1 mM [pH 7,6]).
3. Ligaturer le vecteur souhaité et insérer des fragments d'ADN en utilisant l'ADN ligase T4.
   1. Mettre en place une réaction de ligature de 20 pi contenant 50 à 100 ng de l'ADN vecteur, un excès molaire de ~ 3 fois de l'ADN d'insertion, 400 U d'ADN ligase de T4, et une mémoire tampon de ligature ×. Incuber la réaction de ligature à 16 ° C pendant 12-15 h.
      Note: Inclure un contr négativeréaction de l'OL, ie, le vecteur seulement sans l'insert, en parallèle.
   2. Effectuer quatre ligatures séparées, rejoignant chaque I- la Pme Non fragment 15426 pb de pBAC / SDRP / FL avec le 2559 pb (F1), 4157 pb (pour F2), 3908 pb (pour F3), ou 1784 pb (pour F4) Sma I-Not I fragment de l'un des quatre amplicons d'ADNc, pour générer des sous-clones pBAC / F1 à pBAC / F4.
4. Transformer l'ADN ligaturé dans E. coli DH10B par la méthode de choc -Chauffer _CaCl2.
   1. Prendre des aliquotes de 100 pi de _CaCl2 imprégnées cellules DH10B compétentes ⁶⁹ stocké à -80 ° C et du dégel sur la glace.
      Remarque: Utilisez 100 pi de cellules par transformation.
   2. Ajouter un aliquote de 10 pi de la réaction de ligature d'ADN à 100 pi des cellules décongelées dans un microtube de 1,7 ml, mélanger doucement en appuyant sur le tube, et garder sur la glace pendant 30 min.
   3. Choc thermique le mélange de l'ADN des cellules pendant 45 secondes dans un C wa 42 °bain de ter, placer sur la glace pendant 2 min, puis ajouter 900 pi de bouillon LB préchauffée à température ambiante.
   4. Incuber les cellules à un choc thermique à 35 ° C pendant 1 heure, en agitant à 225-250 rpm.
   5. Étaler 50 à 200 ul de parties aliquotes de cellules cultivées sur des plaques de gélose LB contenant 10 ug / ml de chloramphenicol (LMC). Gardez les plaques à température ambiante, du côté droit, jusqu'à ce qu'elles soient sèches.
   6. Tournez les plaques à l'envers et incuber à 35 ° C pendant 15 heures.
5. Récupérer l'ADN clone BAC à partir des cellules hôtes par un procédé de purification sur la base de colonne (Figure 1C).
   1. Choix de six à huit colonies bactériennes à partir des plaques de gélose LB-de LMC et les inoculer dans 3 ml de bouillon 2xYT contenant 10 pg / ml de la LMC. Incuber les cultures à 35 ° C pendant 10 h avec une agitation vigoureuse (225 à 250 rpm).
   2. Isoler recombinant BAC ADN de 1 à 1,5 ml des cultures bactériennes en utilisant des colonnes de centrifugation, comme indiqué par le fabricant. ⁷⁰ Elute l'ADN extrait (Typiquement 100-200 ng) dans 20 ul de tampon TE.
   3. Effectuer deux analytiques digestions d'enzyme de restriction des BAC isolés pour ~ 6 h dans un volume total de 10 ul, d'identifier la présence du vecteur avec un insert correct en utilisant les mêmes enzymes utilisées pour le clonage (voir Protocole 3.1), et l'autre pour tester l'intégrité des clones BACs avec une enzyme appropriée (par exemple, Bgl II, Nco I, ou Pst I), générer un motif unique de fragment de restriction.
   4. Propager les BAC correctement clonés par inoculation de 500 pi des cultures bactériennes positives (de protocole 3.5.1) dans 500 ml de milieu 2xYT-LMC et cultiver l'inoculum pendant 6 heures à 35 ° C tout en agitant à 225-250 rpm. Purifier l'ADN BAC (généralement 10-20 du ug) de la culture de 500 ml en utilisant des colonnes de filtration, tel que recommandé par le fabricant. ⁷¹
      Remarque: Les quatre sous-clones BAC initiales, chacun contenant un fragment d'ADNc de l'ARN génomique JEV, peut se révéler avoir sure ou plus mutation indésirable (s) par rapport à la séquence consensus du génome viral ⁴² (qui sert de séquence de référence). Une telle mutation doit être corrigée par mutagenèse dirigée par PCR avant l'assemblage d'une pleine longueur d'ADNc ²⁷ JEV.

4. Créer une pleine longueur JEV ADNc avec 5 'SP6 promoteur et le 3' run-off du site

1. Faire trois modifications génétiques (voir ci-dessous Protocoles 4.1.1-4.1.3) dans les ADNc clones pour permettre la transcription d'ARN de longueur génomique in vitro de ruissellement avec l'authentique 5 'et 3' extrémités du génome viral.
   1. Introduire un promoteur SP6 immédiatement en amont de l'extrémité 5 'du génome viral par PCR de chevauchement extension (figure 1D, pBAC / F1 ^SP6).
      1. Amplifier deux fragments d'ADN qui se chevauchent par la première PCR standard de pBAC / F1 avec les deux paires d'amorces SP6F + SP6R (taille du produit, 173 pb) et F1F + F1R (produitIzé, 676 pb), chacun dans une réaction de 50 ul contenant 1 ul ADN matrice (~ 200 pg / ul), tampon de 10 pi 5 × PCR, 2 pi 10 mM dNTP, 2,5 pi de chacune 10 uM amorces sens et antisens, 0,5 2 ul U / pl d'ADN polymerase, ⁶⁸ et 31,5 ul dH ₂ O. Effectuer la PCR en utilisant le profil de cyclage suivantes: 98 ° C pendant 30 sec, et 25 cycles de 98 ° C pendant 10 sec, 60 ° C pendant 30 sec, et 72 ° C pendant 20 s.
      2. Gel-purifier les deux fragments d'ADN amplifiés par PCR après l'exécution de chacun des deux produits de PCR sur un gel à 1,5% d'agarose à point de fusion bas, tel que décrit dans le protocole 3.2.
      3. Fusionner les deux fragments d'ADN purifiés sur gel via la seconde fusion PCR en utilisant les amorces plus à l'extérieur SP6F + F1R (taille du produit, 821 pb) dans une réaction de 100 pi comprenant 1 pi de chacun des deux fragments d'ADN purifiés (~ 100 pg / pl), 20 ul de 5 x tampon de PCR, 4 ul de dNTP 10 mM, 5 ul de chacun des 10 uM des amorces sens et antisens, 1 pi2 U ADN / ul polymérase, ^{68 et} 63 pi dH ₂ O. Utiliser le profil suivant de cyclage thermique: 98 ° C pendant 30 sec, et 25 cycles de 98 ° C pendant 10 sec, 60 ° C pendant 30 sec, et 72 ° C pendant 30 sec.
      4. Gel-purifier l'amplicon PCR fusionné à partir d'un gel à 1% agarose à bas point de fusion, comme décrit dans le protocole 3.2.
      5. Effectuez la procédure de clonage en cinq étapes décrites dans les protocoles 3.1-3.5 pour ligaturer le fragment Pac I Bsi WI 760 pb de l'amplicon PCR purifié sur gel fusionné avec le fragment Pac I Bsi WI-9532 pb de pBAC / F1 pour générer pBAC / F1 ^SP6.
   2. Retirez le, site interne préexistante Xba I au nucléotide 9131 en introduisant une mutation ponctuelle silencieuse (A ⁹¹³⁴ → T) via l'extension de chevauchement PCR (figure 1D, pBAC / F3 ^KO).
      1. Amplifier deux fragments d'ADN se chevauchant par la première PCR standard de pBAC / F3 avec les deux paires d'amorces X1F + X1R(la taille du produit, 746 pb) et X2F + X2R (taille du produit, 316 pb) dans une réaction de 50 ul dans les conditions expérimentales décrites dans le protocole 4.1.1.1.
      2. Gel-purifier les deux fragments d'ADN amplifiés par PCR après la séparation électrophorétique sur 1,5% gels bas point de fusion d'agarose, comme indiqué dans le protocole 3.2.
      3. Fusionner les deux fragments d'ADN purifiés sur gel via la seconde fusion PCR en utilisant les amorces les plus externes X1F + X2R (taille du produit, 1 033 pb) dans une réaction de 100 ul dans les conditions expérimentales décrites dans le protocole 4.1.1.3.
      4. Gel-purifier l'amplicon PCR fusionné à partir d'un gel à 1% agarose à bas point de fusion, comme indiqué dans le protocole 3.2.
      5. Effectuez la procédure de clonage en cinq étapes décrites dans les protocoles 3.1-3.5 pour ligaturer l'AVR II- Non fragment 949 pb de l'amplicon PCR purifié sur gel fusionné avec le 16245 pb Non I- Bsi WI et 2141-pb Bsi W I - fragments Avr II de pBAC / F3 pour produire pBAC / F3 ^KO.
   3. Ingénieur une nouvelle Xba artificielle Je ruissellement sur ​​le site juste en aval de l'extrémité 3 'du génome viral par mutagenèse dirigée par PCR (figure 1D, pBAC / F4 ^RO).
      1. Générer un fragment d'ADN par PCR de pBAC / F4 avec des amorces ROF + ROR (taille du produit, 324 pb) dans une réaction de 100 ul contenant de l'ADN de matrice 1 ul (~ 200 pg / ul), du tampon 20 ul de 5 x PCR, 4 pi 10 dNTP mm, 5 pi chacun de 10 uM amorces sens et antisens, 1 pi 2 U / ul ADN polymérase, ^{68 et} 64 pi dH ₂ O. Effectuer la PCR en utilisant le profil de cyclage suivantes: 98 ° C pendant 30 sec, et 25 cycles de 98 ° C pendant 10 sec, 60 ° C pendant 30 sec, et 72 ° C pendant 15 s.
      2. Gel-purifier le fragment d'ADN amplifié par PCR à partir d'un gel à 1% agarose à bas point de fusion, comme indiqué dans le protocole 3.2.
      3. Effectuez la procédure de clonage en cinq étapes décrites dans les protocoles 3.1-3.5 pour ligaturer les 283 pb Sfi I NOT fragment de l'amplicon PCR purifié sur gel avec Sfi I Non fragment 16933 pb de pBAC / F4 pour créer pBAC / F4 ^RO.
2. Assembler un ensemble de quatre modifiée, qui se chevauchent en un seul ADNc pleine longueur SA ₁₄ -14 à 2 BAC (pBAC / SA ₁₄ -14 à 2) en se joignant à trois sites de restriction naturelle (BSR GI, Bam HI, et Ava I ) d'une manière séquentielle en utilisant les cinq étapes de clonage dans les protocoles procédures détaillées de 3,1 à 3,5 (Figure 1E): F1 F1 ^{SP6 SP6} → F2 (en remplaçant le fragment Bsr G I- Not I de pBAC / F1 ^SP6 avec celle de pBAC / F2) → F1 ^SP6 F2F3 ^{KO (en} remplaçant le fragment Bam H I-Not I de pBAC / F1 F2 ^SP6 avec celle de pBAC / F3 ^KO) → F1 F4 ^SP6 F2F3 ^{KO RO (en} remplaçant le fragment Ava I-Not I de pBAC / F1 F2 ^SP6F3 ^KO avec celle de pBAC / F4 ^RO).

5. Préparer une haute pureté Maxi-prep de la pleine longueur SA ₁₄ -14 à 2 BAC

1. Cultiver une seule colonie de E. coli DH10B portant pBAC / SA ₁₄ -14 à 2 à 3 ml de bouillon 2xYT contenant 10 pg / ml Cml pendant 10 heures à 35 ° C sous agitation à 225-250 rpm, puis intensifier par inoculation de 500 pi de 10 h culture bactérienne dans 500 ml de milieu 2 x YT-LMC et la culture de l'inoculum pendant 6 heures à 35 ° C avec agitation vigoureuse.
2. Centrifuger la culture bactérienne dans les deux bouteilles de 250 ml à 3107 xg pendant 15 min à 4 ° C. Remettre en suspension chaque culot dans 30 ml de solution GTE (mM de glucose 50, 25 mM de Tris-Cl, et 10 mM d'EDTA [pH 8,0]), puis ajouter 500 ul de 60 mg / ml de lysozyme. Incuber les deux suspensions de cellules sur de la glace pendant 10 min.
3. Ajouter 60 ml de solution de lyse fraîchement préparé (NaOH 0,2 et 1% de SDS) pour chaque suspension cellulaire, bien mélanger jusqu'à ce qu'il dégage, et de garder les lysatsà température ambiante pendant 10 min.
4. Ajouter 45 ml de solution de neutralisation (100 ml, constitué de 60 ml 5 M d'acétate de potassium, 11,5 ml d'acide acétique glacial, et 28,5 ml dH ₂ O) pour chaque bouteille, bien mélanger en inversant les bouteilles, et incuber les lysats neutralisés sur la glace pendant 10 min.
5. Centrifugeuse les lysats neutralisés à 18 566 g pendant 20 min à 4 ° C. Transférer le surnageant des deux bouteilles dans deux nouvelles bouteilles de 250 ml; ajouter 0,6 volume d'isopropanol à 100% à chaque, et de les garder sur la glace pendant 20 min.
6. Isoler les précipités à 18 566 g pendant 20 min à 4 ° C. Dissoudre chaque pastille dans 5 ml de tampon TE, de les combiner dans un tube de 50 ml (10 ml au total), et précipiter l'ARN par addition d'un volume égal de 5 M de chlorure de lithium. Incuber le mélange sur de la glace pendant 10 min.
7. Centrifugeuse le précipité d'ARN à 14 636 g pendant 20 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 250 ml et précipiter l'ADN par addition de 2 volumes d'isopropanol à 100%.Incuber le mélange sur de la glace pendant 20 min.
8. Isoler le précipité d'ADN à 18 566 g pendant 20 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant, remettre en suspension la pastille d'ADN dans 9,5 ml de tampon TE (pH 7,6), et ajouter 10 g de chlorure de césium (CsCl) et 390 ul de 10 mg / ml EtBr.
9. Charger la solution ADN-CsCl-EtBr dans un tube de polypropylene de 16 x 76 mm pouvant être scellé en utilisant une seringue équipée d'une aiguille G 18. Spin le gradient CsCl scellé dans une ultracentrifugeuse à 401 ​​700 × g pendant 16 heures à 20 ° C (Figure 3).
10. Recueillir une bande d'ADN de BAC plasmide à partir du gradient de CsCl à l'aide d'une aiguille 18 G pour créer un évent à la partie supérieure du gradient et un G seringue 20 sans aiguille équipé pour récupérer l'ADN de BAC du côté de la pente.
11. Ajouter 2,5 volumes de dH ₂ O-butanol saturé à l'échantillon d'ADN BAC coloré à l'EtBr et mélanger au vortex. Centrifugeuse le mélange à 13 400 g pendant 1 min et le transfert de la phase aqueuse inférieure à un nouveau 1,7 ml microtube. Répétez cette procédure à six reprises.
12. Précipiter l'ADN de BAC-EtBr libre en ajoutant 1/10 de volume de 3M acétate de sodium et 2,5 volumes d'éthanol à 100% à l'ADN BAC-butanol et extrait à l'incubation pendant 10 min sur de la glace. Centrifugeuse le précipité à 13 400 x g pendant 10 min, laver le culot d'ADN avec 1 ml d'éthanol à 70%, et re-sédimenter par centrifugation.
13. Sécher à l'air le culot d'ADN pendant 10 min et on dissout dans 200 pl de tampon TE (pH 7,6).
    Remarque: La figure 4 montre un aperçu du système de génétique inverse pour le JEV SA ₁₄ -14 à 2.

6. Transcrire ARNs de synthèse in vitro à partir d'une pleine longueur d'ADN JEV BAC Linéarisé

1. Effectuez une digestion d'enzyme de restriction à grande échelle de pBAC / SA ₁₄ -14 à 2 avec Xba I dans un volume total de 100 pi (contenant 3 pg d'ADN, 60 U enzyme, 1 × tampon de digestion, et 1 × BSA) à 37 ° C pendant 12-15 h. Examiner une aliquote de 3 pi de la dréaction de igestion sur un gel d'agarose à 0,8% contenant 0,5 pg / ml EtBr.
2. Incuber la réaction de digestion supplémentaire avec 25 U de nuclease de haricot mungo (MBN) à 30 ° C pendant 2 heures (Figure 4A).
3. Amener le volume de l'échantillon traité MBN-Xbal digéré jusqu'à 300 ul avec dH ₂ O. Ajouter un volume égal de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (25: 24: 1) à l'échantillon dilué, vortex vigoureusement pendant 1 min, rotation à 13 400 g pendant 10 min, puis transférer la phase aqueuse supérieure à un nouveau 1,7 ml microtube. Ajouter un volume égal de chloroforme et de répéter la procédure d'extraction.
4. Récupérer le phénol / chloroforme et extrait, BAC linéarisé par précipitation à l'éthanol: Ajouter un dixième de volume de 3 M d'acétate de sodium et 2,5 volumes d'éthanol à 100%, et on incube sur de la glace pendant 20 min. Centrifugeuse le précipité à 13 400 x g pendant 10 min, laver le culot d'ADN avec 1 ml d'éthanol à 70%, et ensuite tourner vers le bas par une nouvelle centrifugation.
5. Air-sécher l'ADN pellet pendant 10 min et le dissoudre dans 30 pi de dH ₂ O. Examiner une partie aliquote de 1 ul de la BAC récupéré sur un gel d'agarose à 0,8% avec 0,5 pg / ml de EtBr (figure 5A).
6. Effectuer une transcription de ruissellement de l'ADN BAC linéarisé dans un volume total de 25 ul (contenant ~ 200 ng ADN matrice, 0,8 mM bouchon analogique [m ⁷ G (5 ') ppp (5') A], 1 mM rNTPs, 40 inhibiteur de RNase U, 20 U SP6 ARN polymérase, le tampon ⁷² et 1 × transcription) à 37 ° C pendant 1 heure (Figure 4B). Inclure 0,5 uM ^de [3H] UTP pour la quantification de l'ARN sur la base de ^[3H] UTP incorporation, comme contrôlé par adsorption sur du papier filtre 81 ^DE-69.
7. Exécutez une aliquote de 1-2 pi de la réaction de transcription run-off sur un gel agarose à 0,6% contenant 0,5 pg / ml EtBr (figure 5B).

7. Déterminer l'ARN et l'infectiosité du virus Rendement

1. Cultiver cellules BHK-21 à 150 mm culture plats à une densité de 3 x 10 ⁶ cellules / boîte pendant 24 heures à 37 ° C avec 5% de CO _2.
   Remarque: maintenir les cellules BHK-21 dans du milieu essentiel minimal alpha supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 2 mM de glutamine, les vitamines, et de la pénicilline / streptomycine.
2. Rincer la monocouche de cellules avec 10 ml de solution froide A (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 8,1 mM de Na ₂ HPO _4, et 1,5 mM de _KH 2 _PO 4). Détacher les cellules de la vaisselle par traitement avec 4 ml de trypsine-EDTA (0,25%), et à leur rassemblement par centrifugation à 270 x g dans une centrifugeuse de bureau pendant 2 min.
3. Remettre en suspension le culot de cellules avec 50 ml de solution A froid dans un tube conique de 50 ml et centrifuger la suspension de cellules à 270 g pendant 2 min. Répétez cette procédure de lavage à trois reprises; après le dernier lavage, remettre le culot cellulaire à une densité de 2 × 10 ⁷ cellules / ml dans Sol A.
4. Mélanger une partie aliquote de 400 ul de suspension cellulaire avec 2 μg d'ARN synthétique dans un espace cuvette 2 mm, et l'électroporation rapidement le mélange avec un électroporateur dans des conditions optimales d'électroporation longueur: 980 V, 99 microsecondes et 5 impulsion des impulsions (figure 4C).
   Remarque: Utilisez l'ARN H marqué ³ synthétisé dans le protocole 6.5 directement pour l'électroporation sans autre purification.
5. Laisser les cellules électroporées à température ambiante pendant 10 min et le transférer dans un microtube de 1,7 ml contenant 600 ul de milieu de culture complet.
6. Préparer une dilution en série de 10 fois des cellules électroporées dans 1 ml de milieu de culture complet et la plaque une partie aliquote de 100 ul de chaque dilution sur des monocouches de unelectroporated cellules BHK-21 (5 x 10 ⁵⁾ dans une plaque à 6 puits.
7. Après 4-6 heures d'incubation, les cellules superposer avec 0,5% d'agarose dans du milieu essentiel minimum contenant 10% de sérum bovin fœtal. Incuber les plaques pendant 4 jours à 37 ° C avec 5% de CO _2.
8. Visualisez le centre infectieuses (plaques) par fixation avec 7% de formaldehyde et une coloration au cristal violet à 1% dans l'éthanol ^27% 5 (figure 6A).
   1. Facultatif: Examiner les cellules d'ARN-électroporation à 18-20 heures post-transfection pour le JEV expression de la protéine par immunofluorescence dosages ^27,73 (figure 6B), et de récolter les surnageants des cellules d'ARN-électroporation à 22 et 40 heures après la transfection pour le virus titrage par la plaque dosages ^27,63 (Figure 6C).

Résultats

Pour tous les virus à ARN à brin positif, la fiabilité et l'efficacité d'un système de génétique inverse dépendent de la stabilité génétique d'un ADNc de pleine longueur clone, dont la séquence est équivalent à la séquence consensus de l'ARN génomique viral. ²⁷ La figure 1 représente un cycle à cinq stratégie d'étape pour la construction d'un ADNc infectieux de pleine longueur comme un taux d'alcoolémie pour JEV SA ₁₄ -14 à 2 ^28: Etape 1, la purification de l'ARN viral à partir du surnageant de culture de cellules de JEV infectés cellules BHK-21 (figure 1A); Etape 2, la synthèse de quatre amplicons d'ADNc se chevauchant (F1 à F4) couvrant l'ensemble du génome viral (figure 1B); Étape 3, le sous-clonage de chacun des quatre fragments d'ADNc contiguës dans un vecteur BAC, créant pBAC / F1 à pBAC / F4 (figure 1C); Étape 4, la modification des ADNc clonés pour la transcription de l'ARN polymerase SP6, soit in vitro ruissellement, plaçant une SP6séquence de promoteur immédiatement en amont de l'viral extrémité 5 '(pBAC / F1 ^SP6), ce qui élimine une préexistant site Xba I interne au niveau du nucleotide 9131 en introduisant une mutation ponctuelle silencieuse, A ⁹¹³⁴ → T (pBAC / F3 ^KO), et l'insertion, un site run-off nouvelle Xba I artificielle immédiatement en aval de l'extrémité 3 'virale (pBAC / F4 ^RO) (figure 1D); et l'étape 5, l'assemblage d'une pleine longueur SA ₁₄ -14 à 2 ADNc BAC, pBAC / SA ₁₄ -14 à 2 (figure 1E). Le tableau 1 énumère les oligonucléotides utilisés dans cette procédure de clonage. ²⁸

Pour la construction d'une fonction JEV de l'ADNc, la première étape importante est la synthèse de quatre fragments d'ADNc se chevauchant en utilisant l'ARN viral purifié comme matrice pour la RT-PCR. La figure 2 donne un résultat représentatif pour les quatre produits de RT-PCR qui étaient une électrophorèse sur un 0,8%gel d'agarose. Ce gel démontre clairement que une pleine longueur JEV ADNc est amplifié en quatre fragments d'ADNc se chevauchant. Occasionnellement, les réactions de RT-PCR peuvent produire un ou plusieurs produits spécifiques du virus ou non spécifiques qui sont la plupart du temps inférieure à celle du produit attendu, à cause du recuit des amorces non spécifiques de l'ADNc au cours de la synthèse / amplification. D'autre part, peu ou pas de produit attendu RT-PCR serait amplifié à cause de la contamination accidentelle RNase pendant l'isolement de l'ARN viral ou mauvaise exécution RT-PCR.

La prochaine étape clé est le clonage et la modification d'un partial- ou pleine longueur JEV ADNc dans BAC, qui est une procédure relativement simple qui utilise des techniques d'ADN recombinant. ⁶⁹ La figure 3 présente un résultat représentatif de la purification du clone BAC contenant un ADNc pleine longueur de JEV SA ₁₄ -14 à 2 par bandes dans un gradient de CsCl-EtBr.Dans cette expérience, après centrifugation pendant 16 heures à 401 ​​700 × g, deux bandes distinctes, à savoir, le E. coli ADN chromosomique ci-dessus et le plasmide ADN BAC superenroulée ci-dessous, sont visibles dans le milieu du tube sous la lumière ultraviolette à ondes longues. Un volume minimal (~ 400 ul) de la bande d'ADN de BAC a été soigneusement inférieur recueilli par piquer un trou avec une seringue sur le côté du tube. Par la suite, l'EtBr a été extrait à partir de l'ADN par extraction au BAC butanol, et l'ADN libre de BAC-EtBr a été concentré par précipitation à l'éthanol.

La dernière étape est la détermination de l'infectivité spécifique des ARN transcrits in vitro de synthèse de la pleine longueur SA ₁₄ -14 à 2 BAC (pBAC / SA ₁₄ -14 à 2) après transfection d'ARN dans les cellules permissives (Figure 4). Cette étape comporte trois étapes successives: Etape 1, linéarisation de la pleine longueur SA ₁₄ -14 à 2 ADNc à la 3 '-fin du génome viral (figure 4A); Étape 2, la production d'ARN de synthèse de l'ADNc linéarisé par ruissellement transcription (figure 4B); et l'étape 3, le sauvetage des virus recombinants dans les cellules BHK-21 transfectées avec les ARN de synthèse (Figure 4C). Expérimentalement, deux clones indépendants de pBAC / SA ₁₄ -14 à 2 ont été linéarisés avec Xba I digestion et traités avec MBN pour enlever le débord 5 'de quatre de base généré par la digestion Xbal. Les BAC ont été linéarisés nettoyés par extraction au phénol-chloroforme, suivie d'une précipitation à l'éthanol. La linéarisation des deux BACs a été démontrée purifiés sur un gel d'agarose à 0,8% (figure 5A). L'extraction phénol-chloroforme doit être effectuée avec soin pour veiller à ce que les taux d'alcoolémie linéarisées sont RNase-free. Chacun de ces deux limites linéarisées a servi de matrice d'ADNc pour la transcription de ruissellement en utilisant l'ARN polymerase SP6 dans la présence de la m ⁷ G (5 ') ppp (5') Un analogue de la PAC. L'intégrité des ARNs synthétiques a été montré en exécutant des parties aliquotes des deux mélanges de réaction de transcription sur un gel d'agarose à 0,6%, avec une référence 1 kb DNA ladder (figure 5B). Dans cet essai simple, la bande majeure d'ARN proéminent toujours migré juste ci-dessous les 3 kb référencer bande d'ADN et semblait être forte. Cependant, l'ARN dégradé aurait un aspect maculé sur le même gel.

Un dosage infectieuse de centre est l'étalon-or pour déterminer l'infectivité spécifique des ARN synthétiques. Cette analyse a été effectuée par électroporation cellules BHK-21 avec des échantillons d'ARN, l'ensemencement des aliquotes égales des 10 armoires cellules diluées en série électroporées dans des plaques à 6 puits contenant naïfs cellules BHK-21 (3 x 10 ⁵ cellules / puits), et la superposition d'agarose sur les monocouches de cellules. Après une incubation de 4 jours, les cellules survivantes ont été fixées avec du formaldehyde et colorées avec du cristal violet une solution de quantifier le nombre de centres infectieux (plaques), ce qui correspond au nombre de molécules d'ARN infectieux fournis dans les cellules (Figure 6A). Etant donné que la matrice d'ADNc utilisée pour la transcription in vitro a été démontrée pour être non-infectieux, ²⁷ une portion aliquote du mélange de réaction de transcription a été directement utilisée pour l'électroporation. L'électroporation est la méthode préférée pour la transfection d'ARN; en variante, les ARN peuvent être transfectées par d'autres méthodes utilisant des liposomes DEAE-dextrane et cationiques. L'électroporation d'ARN est très efficace, mais "arc" de l'impulsion électrique se produit rarement, sinon les sels sont présents dans la réaction d'électroporation ou si la cuvette d'électroporation est réutilisé. L'expression des protéines virales dans les cellules transfectées par l'ARN a été examinée par immunofluorescence en utilisant un antisérum de lapin anti-NS1 (figure 6B). La production de particules virales dans les surnageants accumulées de cellules transfectées par l'ARN étaitalyzed par des dosages de plaques (Figure 6C). Les résultats de ces expériences montrent clairement que les ARN synthétiques sont dérivés d'ADNc infectieux dans permissives cellules BHK-21, la génération d'un titre élevé de virus recombinants.

Oligonucléotide	Séquence bis (5 'à 3')	Position b	Polarité
1RT	TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT	2578-2603	Antisens
1F	aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT	1-22	Sens
1R	attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT	2532-2553	Antisens
2RT	TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA	5975-6000	Fourmije sens
2F	aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT	1800-1821	Sens
2R	attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC	5929-5950	Antisens
3RT	ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT	9426-9451	Antisens
3F	aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT	5500-5521	Sens
3R	attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT	9380-9401	Antisens
4RT	AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA	10952-10977	Antisens
4F	aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA	9200-9221	Sens
4R	attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC	De 10956 à 10977	Antisens
SP6F	cataccccgcgtattcccac TA		Sens
SP6R	ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa	1-14	Antisens
F1F	aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG	1-17	Sens
F1R	TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA	638-662	Antisens
X1F	CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG	8403-8427	Sens
X1R	AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC	9120-9148	Antisens
X2F	GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT	9120-9148	Sens
X2R	cacgtggacgagggcatgcc tgcag		Antisens
ROF	CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC	10670-10694	Sens
ROR	agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC	10954-10977	Antisens
une des séquences de JEV sont affichés en majuscules, et des séquences BAC sont indiqués en lettres minuscules. position b de nucléotides se réfère à la séquence complète du génome de JEV SA 14 -14 à 2 (numéro d'accession Genbank JN604986).

Tableau 1: Oligonucleotides utilisés pour la synthèse d'ADNc, l'amplification par PCR et la mutagenèse BAC.

Figure 1.0; Stratégie pour la construction d'un ADNc de pleine longueur de JEV SA ₁₄ -14 à 2 comme un taux d'alcoolémie (A) Isolement de l'ARN viral à partir de particules JEV.. Il est représenté un diagramme schématique de l'ARN génomique de JEV SA ₁₄ -14 à 2. (B) Synthèse de quatre fragments d'ADNc se chevauchant (F1 à F4) couvrant l'ensemble du génome viral. (C) Sous-clonage de quatre fragments d'ADNc se chevauchant dans un vecteur BAC, créant pBAC / F1 à pBAC / F4. (D) la modification des ADNc clonés pour la transcription en run-off in vitro. pBAC / F1 ^SP6 est un dérivé de pBAC / F1 qui contient la séquence du promoteur SP6 en amont de l'extrémité 5 'virale. pBAC / F3 ^KO est un dérivé de pBAC / F3 qui contient une mutation silencieuse de point (A ⁹¹³⁴ → T, astérisque). pBAC / F4 ^RO est un dérivé de pBAC / F4 qui contient un artificielle site Xba I run-off en aval de l'extrémité 3 'virale. (E strong>) Assemblée d'une pleine longueur SA ₁₄ -14 à 2 BAC (pBAC / SA ₁₄ -14 à 2). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Synthèse des quatre fragments d'ADNc se chevauchant (F1 à F4) couvrant l'ARN génomique pleine longueur de JEV SA ₁₄ -14 à 2. Les quatre produits de RT-PCR sont évalués par électrophorèse dans un gel d'agarose à 0,8%. M, 1 ko échelle d'ADN. Les tailles attendues des quatre fragments d'ADNc sont indiqués au bas de l'image du gel. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3. Purification de la BAC contenant un ADNc de pleine longueur de JEV SA ₁₄ -14 à 2. Le plasmide d'alcoolémie est isolé de E. coli DH10B par la méthode de la lyse alcaline et SDS-purifié davantage par bandes dans un gradient de CsCl-EtBr. Présenté est un exemple de gradient de CsCl-EtBr l'aide d'un tube en polypropylène refermable 16 × 76 mm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Vue d'ensemble de la récupération de virus infectieux d'une pleine longueur JEV SA ₁₄ -14 à 2 ADNc assemblé en un taux d'alcoolémie. (A) de linéarisation de la matrice d'ADNc. La pleine longueur JEV BAC est coupé avecXba I et traité avec MBN. (B) Synthèse des transcrits d'ARN. L'ADNc linéarisé est transcrit par l'ARN polymerase SP6 en présence de la m G ⁷ (5 ') ppp (5') Un analogue de coiffe. (C) de récupération de l'JEVs synthétique. Les tests in vitro des ARN transcrits sont transfectées dans des cellules BHK-21 par électroporation, qui génère un titre élevé du virus synthétique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. Synthèse des ARN par transcription in vitro en utilisant un taux d'alcoolémie JEV pleine longueur comme un modèle d'ADNc. (A) Génération du linéarisé pleine longueur JEV BAC, pBAC / SA ₁₄ -14 à 2. Deux clones indépendants de pBAC/ SA ₁₄ -14 à 2 (Cl.1 et CL.2) sont linéarisés par digestion avec Xba I et le traitement ultérieur avec MBN. Les BAC linéarisées sont examinés par électrophorèse dans un gel d'agarose à 0,8%. (B) la production des ARNs de synthèse par transcription de ruissellement. Chacun de ces deux limites brute est utilisé comme un modèle pour l'ARN polymerase SP6 transcription de ruissellement. Des parties aliquotes des deux réactions de transcription sont passés sur un gel d'agarose à 0,6%. M, 1 kb échelle d'ADN. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6. infectivité spécifique des ARN transcrits à partir d'une synthèse JEV BAC pleine longueur et la récupération de virus synthétique. Cellules BHK-21 sont maquette électroporation (Mock) ou électroporation avec les transcrits d'ARN dérivés from chacun des deux clones indépendants de la pleine longueur JEV BAC (Cl.1 et CL.2). (A) ARN infectieux. Les cellules sont recouvertes avec de l'agarose et colorés avec du cristal violet à 4 jours après la transfection. ARN infectieux est déterminée par des essais infectieuses du centre d'estimer la quantité d'ARN infectieuse électroporation dans les cellules (panneau de gauche). En outre, des images représentatives de centres infectieuses sont présentés (panneau de droite). (B) L'expression de protéine. Les cellules sont cultivées dans des glissières de la chambre 4 puits. L'expression des protéines virales dans les cellules de l'ARN par électroporation à 20 h post-transfection (HPT) est analysée par des dosages d'immunofluorescence en utilisant un antisérum de lapin anti-NS1 primaire et un anti-IgG de lapin de chèvre conjugué à Cy3 secondaire (rouge). Les noyaux sont contre-colorées avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (bleu). Les images d'immunofluorescence sont superposées sur leurs différentiel correspondant des images à contraste d'interférence. (C) Le rendement viral. Les cellules sont cultivées dans uneDes boîtes de culture de 50 mm. La production de virions infectieux accumulés dans les surnageants de culture de cellules d'ARN-électroporation à 22 et 40 hpt est examiné par des dosages de la plaque. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Le protocole actuel a été utilisée avec succès pour générer de pleine longueur infectieux de clones d'ADNc de deux souches différentes (CNU / LP2 et ²⁷ SA ₁₄ -14 à 2 ²⁸⁾ de JEV, un flavivirus dont ADNc fonctionnel est révélée être par nature difficiles à construire et propager en raison de la toxicité de la cellule hôte et de l'instabilité génétique de l'ADNc clone ^8,74-76 Ce protocole comporte trois composantes majeures:. premières, en maximisant la synthèse / amplification d'une copie d'ADNc fidèles de l'ARN viral en utilisant inverse haute fidélité transcriptase / ADN polymérase; Deuxièmement, le clonage de la région virale prM-E de codage contenant des séquences toxiques (données non publiées) ^74,77,78 dans un très faible nombre de copies vecteur BAC de l'ADNc initial sous-clonage aux pleine longueur étapes finales d'assemblage d'ADNc; et la troisième, en utilisant un taux d'alcoolémie de vecteur de clonage qui peut accueillir un ADN étranger avec une taille moyenne de 120 à 350 kb, ^19-21 qui tolère apparemment plus grande ADN Inserts que les autres vecteurs de clonage. Cette approche de clonage sera généralement applicable à de nombreux autres virus à ARN à brin positif, en particulier ceux avec un grand génome ARN de ~ 10 à 32 kb. Génération d'un clone d'ADNc infectieux est une étape clé dans le développement d'un système de génétique inverse pour les virus à ARN, en particulier pour les virus à ARN à brin positif, parce que son génome agit ARNm viral qui est traduit en protéines par les ribosomes de la cellule hôte. Ainsi, la replication virale peut être initiée par l'introduction d'un génome de longueur molécule d'ARN dérivé de l'ADNc dans une cellule hôte sensible. La disponibilité d'un clone infectieux JEV ADNc, lorsqu'il est combiné avec la technologie de l'ADN recombinant, a permis de mieux comprendre les divers aspects du cycle de vie viral au niveau moléculaire, tel que l'expression du gène ^73,79 et la replication du génome. ^63,64 De plus, un pleine longueur JEV clone d'ADNc a prouvé être un outil précieux pour le développement de vaccins antiviraux ^{28 et} des vecteurs de transfert de gènes. ^80,81

Comme avec tous les virus à ARN à brin positif, il ya plusieurs étapes critiques dans la construction d'un ADNc fonctionnelle fiable pour JEV dont ARN hautement infectieux peuvent être synthétisés in vitro. Dans l'idéal, la séquence des ARN transcrits synthétiques partir d'un clone de l'ADNc pleine longueur doit être identique à celle de l'ARN génomique viral, en particulier les 5 'et 3'-terminales des séquences qui sont nécessaires pour l'initiation de la replication de l'ARN viral . ^60-62 Dans le protocole courant, la 5 'et authentique extrémités 3' ont été assurées en plaçant la séquence promoteur SP6 en amont du premier nucléotide d'adénine du génome viral et le positionnement d'un site unique artificiel de restriction Xba I en aval du dernier thymine nucléotidique du génome viral, respectivement. Plafonné ARNs de synthèse avec l'authentique 5 'et 3' ont été produites par la transcription en run-off d'un ADNc te Xba I-linéarisé et MBN-traitémplate en utilisant l'ARN polymerase SP6 amorcée avec le G ⁷ m (5 ') ppp (5') un analogue de la coiffe. Ce protocole peut être modifié de plusieurs façons. Pour la transcription in vitro, un autre ARN bactériophage polymérase (par exemple, T3 ou T7) peut être utilisé en conjonction avec sa séquence de promoteur bien défini. ²⁷ Comme un site run-off, un site de restriction différente peut être utilisée si elle ne figure pas dans le génome viral et l'ARN synthétique, si de l'ADNc avec les extrémités linéarisé authentique extrémité 3 '. L'importance de la séquence nucléotidique de l'extrémité 3 'a été mise en évidence par une diminution de ~ 10 fois de l'ARN infectieux quand un ARN synthétique contient trois ou quatre nucleotides des virus non lié à son extrémité 3'. ²⁷ Dans un vitro réaction de transcription, à la fois la m ⁷ G (5 ') ppp (5') A et m ⁷ G (5 ') ppp (5') G bouchon analogique peut être utilisé aussi bien, bien que les derniers endroits d'un nucléotide G supplémentaire sans rapport amont de l'virale 5 "-end, mais queaddition ne modifie pas le pouvoir infectant ou de la réplication de l'ARN de synthèse. ²⁷ En outre, l'enlèvement de la matrice d'ADNc à partir des transcrits d'ARN par la DNase I digestion est pas nécessaire pour les tests ARN infectieux, parce que la matrice d'ADNc lui-même ne sont pas infectieux. ²⁷

La technologie d'alcoolémie a été appliquée à la construction de clones infectieux d'ADNc pour une poignée de virus à ARN brin positif, à savoir, deux JEVs, CNU / LP2 ^{27 et} SA ₁₄ -14 à 2 ²⁸ (taille du génome, ~ 11 ko); deux virus de la dengue, BR / 90 ²⁶ et NGC ²⁹ (~ 11 ko); le virus de la diarrhée virale bovine, SD1 (~ 12 kb); ²⁵ deux classiques virus de la peste porcine, C et Paderborn (~ 12 kb); ²⁴ le virus de la maladie de la frontière, Gifhorn (~ 12 kb); ²⁴ le virus du syndrome dysgénésique et respiratoire , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb), ³⁰ le virus de la gastroentérite transmissible, PUR46-MAD (~ 29 kb), ¹⁶ le virus de la péritonite infectieuse féline,DF-2 (~ 29 kb); ³² le coronavirus respiratoire aigu sévère de syndrome, Urbani (~ 30 kb); ⁹ du syndrome respiratoire coronavirus Moyen-Orient, EMC / 2012 (~ 30 kb); ^{17 et le} coronavirus humain, OC43 (~ 31 kb) ³¹ Le principal avantage de l'utilisation des taux d'alcoolémie pour la construction d'ADNc est la grande stabilité génétique des grands, 1- ou 2-copie plasmides BAC.; Cependant, la nature intrinsèque de son nombre extrêmement faible copie est également un grand désavantage, en raison des très faibles rendements d'ADN BAC et la réduction conséquente de la pureté de l'ADN BAC à l'égard de l'ADN chromosomique hôte. Dans le protocole actuel, le rendement de l'ADN de BAC est maximisée par la croissance E. coli DH10B transformée avec le pBAC infectieuse BAC / SA ₁₄ -14 à 2 dans un milieu riche en nutriments, 2xYT. Malgré cet effort, le rendement moyen est de seulement ~ 15 ug d'ADN BAC à partir de 500 ml de bouillon 2xYT. En outre, la pureté de l'ADN de BAC est mieux réalisée à l'aide de CsCl-EtBr centrifugation en gradient de densité de purification, Plutôt que le plasmide d'isolement utilisée en colonnes. Cependant, il est important de garder à l'esprit que le E. de BAC-transformé coli ne devrait pas proliférer parce que cela pourrait mettre en péril la stabilité génétique de l'ADNc clone, et la croissance plus élevé ne conduit pas nécessairement à des rendements plus élevés ou de l'ADN de BAC plus pureté.

Le protocole décrit ici est un optimisé, efficace et méthode simplifiée pour la construction et la propagation d'une pleine longueur d'ADNc clone infectieux génétiquement stable comme un taux d'alcoolémie pour le JEV, une procédure que l'on croyait pratiquement impossible. Cette même stratégie de clonage peut également être appliqué à de nombreux autres virus à ARN à brin positif. En général, les clones infectieux d'ADNc permettent d'introduire une variété de mutations (par exemple, des deletions, insertions et mutations ponctuelles) dans un génome d'ARN viral à l'étude de leurs fonctions biologiques dans la réplication virale et la pathogenèse. Ce système de génétique inverse à base d'ADNc permet de développer et de TESt vaccin et candidats thérapeutiques ciblant un facteur (s) de virulence d'un virus à ARN brin positif d'intérêt particulier. En outre, cette technologie infectieux d'ADNc peut également être utilisé comme un vecteur viral, capable d'exprimer un gène étranger (s) d'intérêt pour de nombreuses applications dans la recherche biomédicale.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1. Clonage moléculaire
2xYT Bouillon	Sigma-Aldrich	Y2377
[3H]UTP	PerkinElmer	NET380250UC
Radioactive Tube 50 ml	Thermo Scientific (Nalgene)	3114-0050
Bouteille 250 ml	Beckman Coulter	356011
Agarose	Lonza	50004
Agarose (point de fusion bas)	Life Technologies (Invitrogen)	16520-100
AvaI	New England BioLabs	R0152S
AvrII	New England BioLabs	R0174S
BamHI	New England BioLabs	R0136S
BsiWI	New England BioLabs	R0553S
BsrGI	Nouveau Angleterre BioLabs	R0575S
Butanol	Fisher Scientific	A399-1  ;
Chlorure de césium	Fisher Scientific	BP1595-1
Chloramphénicol	Sigma-Aldrich	C0378
Chloroforme	Sigma-Aldrich	C2432	Cancérigène
DE-81 Papier filtre	GE Healthcare Life Sciences	3658-023
dNTP mix	Life Technologies (Invitrogen)	18427-088
E. coli DH10B  ;	Life Technologies (Invitrogen)	18297-010
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Éthanol  ;	Sigma-Aldrich	E7023
Bromure d’éthidium	Sigma-Aldrich	E7637	toxique et hautement mutagène
(kit Plasmid Maxiprep)	Life Technologies (Invitrogen)	K2100-26
Acide acétique glacial	Sigma-Aldrich	A6283	Glucose irritant
Glycogène	Sigma-Aldrich	G5400
nbsp ;	Roche	10901393001
ADN polymérase haute fidélité	New England BioLabs	M0491S
Alcool isoamylique	Sigma-Aldrich	I9392	Inflammable
Isopropanol  ;	Amresco	0918	Inflammable
LB Broth	Life Technologies (Invitrogen)	12795-027
Chlorure	de lithium Sigma-Aldrich	L9650
Lysozyme	Amresco	0663
Chlorure de magnésium	Sigma-Aldrich	M8266
M-MLV Reverse Transcriptase	Life Technologies (Invitrogen)	18080-044
Nucléase de haricot mungo	New England BioLabs	M0250S
Aiguille (18G, 20G)	BD	305196, 305175	Matières biologiques dangereuses (déchets tranchants)
NotI	New England BioLabs	R0189S
Oligonucléotide	Technologies d’ADN intégrées		d’oligonucléotides personnalisée
PacI	New England BioLabs	R0547S
pBeloBAC11	New England BioLabs	ER2420S (E4154S)
Phénol (saturé en tampon)	Life Technologies (Invitrogen)	15513-039	Toxique et hautement corrosif
Phénol :Chloroforme :Isoamyl Alcohol Life	Technologies (Invitrogen)	15593-031	Toxique et hautement corrosif
Phénol :Guanidine Isothiocyanate	Life Technologies (Ambion)	10296-010	Toxique, corrosif et irritant
Pme I	New England BioLabs	R0560S
Acétate de potassium	Amresco	0698
Inhibiteur de la RNase	Technologies (Invitrogen)	10777-019
rNTP Set	GE Healthcare Life Sciences	27-2025-01
Tube en polypropylène scellable (16 × ; 76 mm)& nbsp ;	Beckman Coulter	342413
SfiI	New England BioLabs	R0123S
Sma I	New England BioLabs	R0141S
Acétate de sodium	Sigma-Aldrich	S2889
Dodécylsulfate de sodium	Amresco	0227
Hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	S5881
SP6 ARN polymérase	New England BioLabs	M0207S
Colonne de centrifugation (Plasmidide Miniprep Kit)	Life Technologies (Invitrogen)	K2100-11
Seringue	HSW NORM-JECT	4200.000V0
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202S
Tris	Amresco	0826
ARNt (levure)	Life Technologies (Invitrogen)	15401-011
XbaI  ;	New England BioLabs	R0145S
Nom	Company	Numéro de catalogue	Comments
>2. Culture cellulaire
Alpha Minimal Essential Medium	Life Technologies (Gibco)	12561-049
Tube conique (50 mL)	VWR	21008-242
Crystal Violet  ;	Sigma-Aldrich	C0775
Boîte de culture (150 mm)  ;	TPP	93150²nbsp ;
Cuvette (2 mm d’écart)	Appareil Harvard	450125
Sérum de Bovin Fœtal  ;	Life Technologies (Gibco)	16000-044
Formaldéhyde	Sigma-Aldrich	F1635	Toxique et cancérigène
Glutamine	Life Technologies (Gibco)	25030-081
Minimal Essential Medium	Life Technologies (Gibco)	61100-061
Pénicilline/Streptomycine	Life Technologies (Gibco)	15070-063
Chlorure	de potassium Sigma-Aldrich	P3911
Phosphate de potassium monobasique	Sigma-Aldrich	P9791
Plaque à six puits	TPP	92006
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	S3014
Phosphate de sodium dibasique	Sigma-Aldrich	S3264
Trypsine-EDTA (0,25 %)	Life Technologies ( Gibco)	25200-056
Vitamines	Sigma-Aldrich	M6895
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
3. Equipement
Agarose Gel Electrophorèse	Mupid	MPDEXU-01
CO2 Incubateur	Thermo Scientific	Heracell 150i
Centrifugeuse de bureau  ;	Thermo Scientific	ST16R
Électroporateur	Appareil Harvard	ECM 830
Lampes ultraviolettes à ondes longues (portables)	Centrifugeuse de	UVP UVGL-58
	Beckman Coulter	368826
Thermocycler	Life Technologies (Applied Biosystems)	GeneAmp PCR System 9700
Vortexer	Scientific Industries	G-560
Bain-marie	Jeio Tech	WB-10E