Article de méthode

Rapid

DOI :

10.3791/53165

⸱

23 septembre 2015

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1Ross University School of Veterinary Medicine, 2Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole décrit une méthode d’hybridation in situ rapide et simplifiée idéale pour les cerveaux préfixés au paraformaldéhyde, réduisant ainsi le besoin d’étapes complexes prolongées lors de l’utilisation de tissus frais congelés. La méthode est validée par l’identification du gène htr2a du récepteur de la sérotonine 5-HT2A chez le rat.

Résumé

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< toxicité de la classe p = 'jove_content'>3,4-méthylènedioxyméthamphétamine (MDMA ; ecstasy) peut provoquer des modifications spécifiques à la région de l’expression de l’ARNm sérotoninergique en raison du syndrome aigu de sérotonine (5-hydroxytryptamine ; 5-HT). Cette hypothèse peut être testée en utilisant l’hybridation in situ pour détecter le gène htr2a du récepteur de la sérotonine 5-HT2A. Dans le passé, de telles procédures, utilisant du ribopobbe radioactif, étaient difficiles en raison du flux de travail compliqué qui nécessitait plusieurs jours et de la difficulté supplémentaire que la technique nécessitait l’utilisation de tissus frais congelés conservés dans un environnement exempt de RNase. Récemment, le développement de courtes sondes oligonucléotidiques a simplifié les procédures d’hybridation in situ et a permis l’utilisation de coupes cérébrales préfixées par le paraformaldéhyde, qui sont plus largement disponibles en laboratoire. Ici, nous décrivons un protocole détaillé utilisant des sondes oligonucléotidiques non radioactives sur les tissus cérébraux préfixés. Les sondes d’hybridation utilisées pour cette étude comprennent dapB (un gène bactérien codant pour la dihydrodipicolinate réductase), ppiB (un gène d’entretien codant pour la peptidylprolyl isomérase B) et htr2a (un gène de la sérotonine codant pour les récepteurs 5-HT2A). Cette méthode est relativement simple, bon marché, reproductible et nécessite moins de deux jours.

Introduction

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syndrome de sérotonine (5-hydroxytryptamine ; 5-HT) est un trouble neurologique aigu causé par des drogues favorisant la 5-HT telles que les antidépresseurs1, tout en survenant également dans des situations d’utilisation de MDMA à des fins récréatives2. Les mécanismes moléculaires responsables des sautes d’humeur, des déficits d’apprentissage et de mémoire qui se produisent en association avec le syndrome aigu ne sont pas bien compris3,4. L’hybridation in situ est un outil de recherche puissant permettant la détection et la quantification d’ARNm spécifiques exprimés potentiellement à l’échelle d’une cellule unique. La méthode conventionnelle d’hybridation in situ consiste à utiliser un riboprobe marqué radioactif qui hybride spécifiquement le gène d’intérêt. Cependant, un inconvénient majeur est que la méthode nécessite des étapes de préparation et d’hybridation de sonde compliquées et longues, ainsi que l’accès à des tissus frais congelés conservés dans un environnement exempt deRNase 5,6.

'ARN plus courts que ceux requis pour les ribopsondes7. De plus, les sondes produisent un signal de fond faible sans sacrifier la spécificité8. Cette nouvelle technologie de sonde peut être utilisée pour l’hybridation in situ sur des tissus cérébraux préfixés au paraformaldéhyde couramment disponibles dans les laboratoires d’immunocytochimie.

Ici, nous décrivons un protocole d’hybridation in situ à l’aide de sondes oligonucléotidiques sur le cerveau de rat préfixé au paraformaldéhyde et comparons les résultats avec ceux observés dans un cerveau fraîchement congelé5,6. Ce protocole est utilisé pour tester l’hypothèse selon laquelle l’abus de substances MDMA provoque des modifications de l’ARNm htr2a du gène du récepteur 5-HT2A dans le cerveau. Nous avons commencé la procédure par un traitement à la MDMA suivi d’une perfusion tissulaire de paraformaldéhyde de l’animal, d’une hybridation in situ de la sonde thr2a et d’une analyse des données. Notez que dapB (le gène bactérien codant pour la dihydrodipicolinate réductase) est utilisé comme contrôle négatif, et ppiB (gène d’entretien codant pour la peptidylprolyl isomérase B) comme contrôle positif.

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Protocole

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Les procédures d'utilisation des animaux décrits ci-dessous ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'école de médecine vétérinaire de l'Université de Ross et Florida Atlantic University. Bien que les techniques stériles et des gants sont nécessaires, l'environnement RNase-free est pas nécessaire lors de l'utilisation de ce protocole.

1. Préparation

  1. Préparation des tissus et de sectionnement
    1. Attribuer des rats au hasard en trois groupes: les frais / solution saline (SAL; NaCl 0,9%), le préfixe / SAL et préfixés / 3,4-méthylènedioxyméthamphétamine (MDMA; voir détails dans le tableau 1).
    2. Administrer trois doses de 1 ml / kg SAL et 10 mg / kg par voie intrapéritonéale MDMA, respectivement, pour les groupes SAL et MDMA à intervalle de 2 h. Permettre aux animaux de survivre le traitement pendant 6 jours.
    3. Au jour 7, administrer 100 mg / kg de kétamine en combinaison de 5 mg / kg par voie intrapéritonéale xylazine aux rats pour une anesthésie profonde (ie, la perte de clignotement de la cornée et tail pincer réflexes).
    4. Pour le groupe frais / SAL, décapiter rapidement rats et enlever le cerveau pour le test de cerveau frais (voir les détails dans la référence 5).
    5. Pour les groupes / MDMA préfixés / SAL et préfixés, faire une coupe le long du sternum environ 10 -12 cm et ensuite exposer l'extrémité du sternum.
    6. Maintenez l'extrémité du sternum avec une pince hémostatique et couper la membrane latéralement des deux côtés avec des ciseaux pointus et ensuite coupé vers le haut à travers les côtes et en parallèle vers les poumons.
    7. Avec une main, tenir la pointe ventrale du cœur avec une petite pince. Avec l'autre main, percer le ventricule gauche avec une aiguille de calibre 18 de la seringue (noter le côté de l'adaptateur de l'aiguille est reliée à un tuyau de silicium en forme de Y Sal et paraformaldéhyde conteneurs glacées et les pompes péristaltiques, voir la référence 9).
    8. Tournez sur la pompe de SAL au niveau moyen de la vitesse d'écoulement (~ 5 ml / min) et à la perforation de l'oreillette droite avec la pince pour permettre l'évasion de retour circulation. Maintenir SAL perfusion pendant 30 min.
    9. Tournez sur la pompe de paraformaldéhyde au niveau moyen et laissez la glace-paraformaldéhyde 4% froid pour perfuser l'animal pendant 30 min.
    10. Retirer l'instrument de perfusion et de décapiter l'animal. Faire un postéro couper à travers la ligne médiane du crâne, puis battre le crâne pour exposer la cavité du crâne 10.
    11. Retirer le cerveau avec une spatule à partir de la cavité du crâne et du cerveau placer dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant 25 ml de paraformaldehyde à 4%. Gardez le cerveau dans le tube contenant paraformaldéhyde à 4 ºC réfrigérateur pendant 24 h.
    12. Déplacer le cerveau dans un tube centrifuge de 50 ml contenant 25 ml de solution de saccharose à 30% à 4 ° C pendant 3 jours. Enfin, stocker le cerveau dans les sacs en plastique à -80 ° C jusqu'à utilisation.
    13. Montez le cerveau sur un mandrin avec intégration des médias et de geler les médias enrobage contenant cerveau dans un cryostat à une température de -26 ºC. Couper le gelé fraisn cerveau cerveau en 20 sections um et le paraformaldéhyde-préfixés en sections de 10 um. Transférer la section à une lame de microscope RT en touchant la diapositive à la section.
    14. Air sec à température ambiante pendant 4 h. Conserver les diapositives de section dans un sac étanche scellée à -80 ° C jusqu'à utilisation.
  2. Déshydration
    1. Prenez diapositives de la -80 ° C congélateur et attribuer des sections dans une des trois tests: HT2A, PPIB (contrôle positif) ou dapB (contrôle négatif); marque et sections de l'étiquette avec un stylo à bille (ne pas utiliser un crayon). Plonger les lames dans 100% d'alcool à la température ambiante pendant 5 min. Sécher les lames pendant 5 min dans une hotte.
  3. Prétraitement
    1. Pipette 20 pl du réactif de prétraitement-1 (inactivation de la phosphatase alcaline) aux coupes sur des lames. Placer les lames sur un rail de support d'une plaque à l'humidité (à noter que le plateau est recouvert d'un couvercle afin de maintenir une humidité élevée pour empêcher l'évaporation à partir de la réaction de solution).
    2. Secouer doucement le plateau de l'humidité sur un agitateur horizontal à basse vitesse pendant 10 min. Laver les lames à deux reprises avec de l'eau distillée deux fois (ddH 2 O) pendant 2 min. Immerger la lame dans un bécher de 200 ml contenant 150 ml du réactif de prétraitement-2 (rupture des liaisons transversales induites par paraformaldéhyde fixation). Faire bouillir les diapositives pour un total de 5 min à 100 ° C (de restauration induite par la chaleur de la structure de l'ARN 11).
    3. Laver les lames à deux reprises avec le trou DDH 2 O pendant 2 min. Placer les lames dans alcool à 100% pendant 5 min. Sécher les lames pendant 5 min dans la hotte. Utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner un cercle autour de la zone sélectionnée dans la section de tissu (par exemple, des structures non-corticales, y compris le thalamus et l'hypothalamus comme indiqué dans la figure 2).
    4. Pipette 10 ul du prétraitement-3 réactif (augmentation du taux de pénétration de la sonde) à chaque zone sélectionnée, et couvrent le plateau de l'humidité avec le couvercle. Placer le plateau dans le four à hybridationéquipé du agitateur horizontal et régler la température du four à 40 ºC; secouer doucement le plateau pendant 30 min. Laver les lames à deux reprises avec le trou DDH 2 O pendant 2 min.

2. L'hybridation et d'amplification

  1. Pipette 10 ul de TR2A, PPIB et dapB réactifs de sonde, respectivement, sur les zones sélectionnées. Couvrir le bac d'humidité avec le couvercle pour empêcher l'évaporation du réactif. Secouer doucement sur l'agitateur horizontal réglé à une vitesse faible. Incuber les lames à 40 ° C dans le four pendant 2 heures.
  2. Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif d'amplification-1 sur chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à 40 ° C pendant 30 min.
  3. Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif Amplification-2 sur chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à 40 ° C pendant 15 min.
  4. Laver les lames à deux reprises wvec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif Amplification-3 sur chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à 40 ° C pendant 30 min.
  5. Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif Amplification-4 de chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à 40 ° C pendant 15 min.
  6. Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif Amplification-5 sur chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à température ambiante pendant 30 min.
  7. Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif Amplification-6 sur chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à température ambiante pendant 15 min. Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes.

3. Signal Detection

  1. Introduire à la pipette 10 ul du réactif rouge à chaque région sélectionnée (A noter que le réactif est un mélange de rouge et rouge-B-A dans un rapport 1:60 et doit être utilisé immédiatement). Placer la lame dans le bac d'humidité sur le agitateur horizontal à température ambiante et agiter doucement à basse vitesse pendant 10 min.
  2. Laver les lames deux fois avec (ddH 2 O) pendant 10 min. Sécher les lames à 60 ° C dans le four pendant 15 min. Placer les lames dans le xylène sous la hotte pendant 5 min. Pipette 20 ul de milieu de montage à base de xylène sur chaque zone sélectionnée et couvrir avec une lamelle.

4. Capture d'image

  1. Prenez microphotographies numériques des zones sélectionnées (par exemple, l'hypothalamus, les figures 1 et 3) avec un grossissement de 4 × 20 × et des lentilles d'objectif. Enregistrez le fichier d'image.

5. Analyse des particules de l'image

  1. Glissez et déposez le fichier de l'image dans la fenêtre principale de ImageJ. Allez à la barre de menu et sélectionnez 'Image', suivant, sélectionnez "Type" dans le menu déroulant, puis sélectionnez '8-bit'.
  2. Sélectionnez «Réglage», puis sélectionnez «Threshold 'pour ouvrir la boîte de dialogue. Réglez la valeur de barre inférieure dans la boîte de dialogue afin que le fond indésirable est retiré. Allez à la barre de menu et sélectionnez «Analyser», puis sélectionnez «analyser des particules 'pour ouvrir une deuxième boîte de dialogue.
  3. Régler la taille des particules à 10, sélectionner la prochaine 'Show présente »et sélectionnez« Afficher les résultats »et« boîtes Résumer'. Enfin, cliquez sur «OK» pour afficher les données de particules dans les boîtes de dialogue.

6. Calcul Spreadsheet

  1. Saisissez les données dans la feuille Excel et en moyenne le nombre de particules dans le groupe SAL comme base de référence. Calculer le niveau de pourcentage de chaque section et faire un graphique en conséquence (Figure 4).

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Résultats

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En utilisant les sondes d'ARN oligonucléotidique (<25 nt), l'hybridation peut être détectée sous forme de points rouges dans les cellules de l'hypothalamus préparés à partir de cerveaux congelés paraformaldehyde préfixée et frais. Les molécules d'ARNm HTR2A sont présents dans certaines cellules (indiquées par les flèches solides), mais pas d'autres (flèches ouvertes). Nous avons observé qu'il n'y a pas de différence entre le paraformaldehyde préfixée et les tissus congelés frais <...

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Discussion

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L’une des principales préoccupations des essais d’hybridation in situ est de choisir les techniques appropriées utilisées pour la conservation de l’ARN en raison des enzymes RNase. Il est bien connu que ces enzymes sont largement présentes dans les cellules et l’environnement, ce qui peut affecter les résultats. Cependant, l’activité enzymatique peut être rapidement distinguée en plaçant le tissu dans la solution de glace carbonique/alcool5,12. Bien que la conservation rapide soit essentielle pour l’h...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

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Cette étude a été soutenue par la subvention du NIH (R15DA029863), la subvention Florida Atlantic University de recherche de premier cycle (M30014) et de l'École de médecine vétérinaire de subvention de recherche Ross University. Nous tenons à remercier l'Institut national sur l'abus des drogues (Rockville, MD) pour fournir (±) 3,4-méthylènedioxyméthamphétamine (MDMA ±) pour ce travail.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
RNAscope Negative Control Probe-DapBAdvanced cell diagnostic, INC310098
RNAscope Pretreat 4Advanced cell diagnostic, INC320046
RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - RedAdvanced cell diagnostic, INC310036
RNAscope Probe - Rn-PpibAdvanced cell diagnostic, INC313921
Rat Htr2aDiagnostic cellulaire avancé, INC300031
CryostatLeicaCM 1850
Agitateur horizontalVWR88032-088
Four d’hybridationThermo Fisher Scientific222000
Superfrost Plus lame de microscopeFisher Scientific12-550-15
Stylo hydrophobeVectorH-4000
MicroscopeOlympusProvis AX70

Références

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Mots-clés

Cerveau fix au paraformald hydeexpression du g ne HTR2Ar actifs de pr traitementtapes d amplificationd tection au rouge rapideanalyse via Image Jquantification de l ARN

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