Éclaircir Entropic Taux accélération induite par Dynamics solvant dans Membrane Enzymes

Résumé

Chaînes pour le transport de molécules d'eau dans les enzymes influencent solvatation de site actif et de la catalyse. Nous présentons ici un protocole pour l'ingénierie de ces motifs catalytiques supplémentaires basés sur la modélisation et expériences de l'ordinateur silico. Cela permettra d'améliorer notre compréhension de l'influence de la dynamique de solvants sur la catalyse enzymatique.

Résumé

Catalyse enzymatique évoluée en milieu aqueux. L’influence de la dynamique des solvants sur la catalyse est cependant actuellement mal comprise et généralement négligée. L’étude de la dynamique de l’eau dans les enzymes et des conséquences thermodynamiques associées est très complexe et a impliqué des simulations informatiques, des expériences de résonance magnétique nucléaire (RMN) et de la calorimétrie. Les tunnels d’eau qui relient le site actif au solvant environnant sont essentiels au déplacement et à la dynamique du solvant. Le protocole ci-dessous permet l’ingénierie de ces motifs pour le transport de l’eau, ce qui affecte la spécificité, l’activité et la thermodynamique. En fournissant un cadre biophysique fondé sur la théorie et l’expérience, la méthode présentée ici peut être utilisée par des chercheurs sans expertise préalable en modélisation informatique ou en chimie biophysique. La méthode fera progresser notre compréhension de la catalyse enzymatique au niveau moléculaire en mesurant les changements enthalpiques et entropiques associés à la catalyse par des variants enzymatiques avec des tunnels d’eau obstrués. Le protocole peut être utilisé pour l’étude des enzymes liées à la membrane et d’autres systèmes complexes. Cela améliorera notre compréhension de l’importance de la réorganisation des solvants dans la catalyse et fournira de nouvelles stratégies catalytiques dans la conception et l’ingénierie des protéines.

Introduction

L'eau constitue une pierre angulaire pour la chimie de la vie ^1. Modèles d'eau et solvatation des sites actifs des enzymes affectent à la fois l'enthalpie et l'entropie de la liaison ^1,2 et ³ catalyse d'une manière très complexe allant au-delà de l'effet hydrophobe ^2,3 ligand. RMN ^4, calorimétrie ² et la modélisation moléculaire des protéines solvatées ont été utilisées pour faire la lumière sur le rôle des molécules d'eau explicites à fournir une force motrice pour l'association de ligand ^5-8, la spécificité et l'activité ^2,9,10. Ici, nous présentons une méthodologie unique pour l'évaluation expérimentale de l'effet thermodynamique de déplacement du solvant sur ​​la catalyse enzymatique (Figure 1). Notre stratégie combinée est basé sur des simulations informatiques de concert avec génie enzymatique et l'analyse thermodynamique (Figure 1). Cela permet de faire la lumière supplémentaires sur l'impact de la dynamique de solvants sur catalyse, qui est actuellement mal comprise.

Stabiliser interactions enthalpiques, fournies par des liaisons hydrogène médiation à l'eau dans l'enzyme solvaté sites actifs, peuvent être compensés par des sanctions entropiques ^1. Ces coûts entropiques sont associées à la diminution des degrés de liberté affichée par les molécules d'eau confinés à l'intérieur des cavités de protéine, par rapport à l'eau ⁵ en vrac. La libération de molécules d'eau commandés peut donc fournir une force motrice entropique pour l'association de ligand ^{1 et 3} catalyse. Un aspect essentiel de la dynamique de solvant est le déplacement des molécules d'eau entre l'intérieur de protéines et le solvant extérieur ^4. Les changements d'accompagnement dans l'énergie d'activation, enthalpie et entropie ¹¹ ne sont pas complètement compris au niveau moléculaire. En obstruant tunnels individuels responsables pour le transport de l'eau dans les enzymes, l'importance de la dynamique de solvant et de sa contribution à l'activationénergie peut être évaluée (Figure 1). En outre, en effectuant un seul récipient expériences cinétiques à différentes températures, les paramètres d'activation thermodynamiques relatives de plusieurs substrats peuvent être extraites à partir d'un nombre réduit d'expériences (figure 1, à droite). Notre méthode interdisciplinaire est validé pour les enzymes triterpène cyclase membranaires complexes qui génèrent des terpènes polycycliques de grande importance pour la vie ^12. Le protocole permet la récupération de quantités élevées de protéine de membrane (10-20 mg / L) à l'aide d'une centrifugeuse standard.

Bien que les enzymes ont évolué dans l'eau, le rôle de solvant dans la promotion de la catalyse est généralement négligée. En plus de la dynamique des protéines ^13,14 cette forme pré-organisés sites actifs avec complémentarité électrostatique à l'état de transition ^15, la dynamique de l'eau pourraient être d'une grande importance pour la catalyse enzymatique efficace. En forgeant plusieurs techniques interdisciplinaires, notreobjectif est de faciliter l'étude très complexe de dynamique de l'eau et de la thermodynamique. Faire ces outils plus accessibles à la communauté scientifique va conduire au développement de nouvelles stratégies en génie enzymatique et la conception de protéines pour les activités et les spécificités modifiées.

Protocole

La modélisation in silico 1. Ordinateur

1. Télécharger une structure APB de la protéine d'intérêt à partir de la banque de données de protéines (PDB). Préparer la structure en enlevant des sous-unités en excès, puis en ajoutant manquantes atomes d'hydrogène et le solvant à l'aide explicite "Neutralization cellulaire et _une prédiction p K" expérience dans YASARA ^16. Pour membranaires cyclases triterpéniques, dimensions appropriées de la boîte à eau sont 91x67x77 Å. Ajuster manuellement l'état des acides aminés à activité catalytique de protonation.
   Remarque: Si nécessaire, un analogue de substrat dans le fichier APB peut être modifié à un substrat réel en utilisant le «Modifier | Échange | Atom" commande.
2. Minimiser la structure par la commande "minimisation d'énergie" en utilisant le champ suite vigueur AMBER ^17. Utiliser l'approche Ewald de maille de particules (PME) ¹⁸ pour tenir compte des interactions électrostatiques à longue portée. Réglez la coupure de van der Waals selonparamètres standard.
   Remarque: La commande "minimisation d'énergie" enlève le stress de conformation par une minimisation de courte descente plus raide, puis un recuit simulé (timestep 2 fsec, les vitesses des atomes revus à la baisse de 0,9 tous les ¹⁰ e étape) est effectuée jusqu'à ce que la convergence est atteinte (c., l'amélioration de l'énergie de moins de 0.012 kcal / mol par atome cours de 200 marches).

2. Modèle de site actif Solvation et Accès à l'eau

1. Après le recuit simulé, exécutez une dynamique moléculaire 20 nsec (MD) trajectoire et générer au moins 10 images par le menu "Fichier | Simulation Snapshot | Enregistrer sous" commande suivie par "Simulation On". Exécutez les simulations sur un ordinateur standard avec des conditions aux limites périodiques au titre de l'ensemble canonique. Maintenir la température à 298 K en utilisant un thermostat Berendsen.
2. Préparer les clichés obtenus à partir de 2,1 par substitution des molécules d'eau et les éventuels ligands / substrats en utilisant la4; Modifier | Supprimer | résidus "commande Superposer chaque instantané individuellement sur l'APB-structure originale par la." Superposer | commande objet "d'assurer que toutes les structures partagent la même position spatiale Sauvegarder chaque instantané préparé de cette manière comme un nouveau APB. -file (en utilisant le menu "Fichier | Enregistrer sous | APB" commande).
   Remarque: Pour les modélisateurs expérimentés: écrire un script pour automatiser ce processus selon le modèle donné dans le fichier 1 de code supplémentaire.
3. Utilisez les instantanés préparés (APB) de 2,2 qui ont été alignés dans l'espace 3D comme intrants dans le logiciel spéléologue 3.0 ^19. Pour l'analyse d'un nombre limité de clichés, exécutez spéléologue sur un ordinateur standard. Utiliser un rayon de sonde de 0,7 Â ¹⁹ pour assurer la détection des tunnels qui sont spécifiques pour le transport de molécules d'eau.
4. Visualisez les tunnels générés par spéléologue 3.0 dans un logiciel graphique moléculaire. Pour faciliter la visualisation des tunnels, utilisez la macro complémentaire indiqué dans le code File 2.

3. In Silico Enzyme Engineering pour modifier les schémas de l'eau et la dynamique de l'eau

1. Identifier les tunnels les mieux classés en fonction de l'en-tête "ID" répertorié dans le fichier de sortie "summary.txt" généré par le logiciel spéléologue 3.0.
2. Identifier les acides aminés le long des tunnels mieux classées (3.1) et que l'affichage d'une petite chaîne latérale pointant vers l'intérieur du canal par inspection visuelle (en utilisant le modèle obtenu à partir de 2,4). Identifier les substitutions d'acides aminés simples qui vont bloquer le tunnel par une augmentation de l'encombrement stérique en utilisant la commande "Swap de résidus". Vérifiez que le tunnel est obstruée par inspection visuelle, et ensuite répéter les étapes 1.2 à 3.1 par du protocole.

4. Expression des gènes mutés

1. Introduire des mutations dans le gène de type sauvage par mutagenèse par PCR en utilisant des amorces qui ne se chevauchent ^20.
2. Ajouter ADN plasmidique contenant le gène d'intérêt dans le tubes avec des cellules compétentes d'une souche de clonage approprié et incuber sur de la glace pendant 30 min. Effectuer une transformation de choc thermique pendant 45 secondes dans un bain d'eau avec la température réglée à 42 ° C. Ajouter 500 ul d'un milieu riche fraîche (2YT, 16 g / L de tryptone, 10 g / L d'extrait de levure, 5 g / L de NaCl) et incuber à 37 ° C, 200 tours par minute pendant 45 min. Effectuez une sélection en étalant les cellules transformées sur des plaques agar supplémenté avec des antibiotiques appropriés.
3. Après vérification de la séquence d'ADN du gène muté, transformer l'ADN de plasmide dans une souche d'expression en utilisant un choc thermique comme décrit ci-dessus. Pour l'expression de membranaires cyclases triterpéniques, utiliser BL21 (DE3).
4. Démarrer une 5 ml O / N de la culture à 37 ° C de la souche d'expression dans 2YT-milieux supplémentés avec les antibiotiques appropriés.
5. Inoculer une secoueuse à chicanes de 2 litres ballon, contenant 300 ml 2YT-milieu supplémenté avec des antibiotiques appropriés, à une DO finale de 0,05-0,09 (mesurée à 600 nm). Après induction à une DO de 0,6 à 0.8 et l'expression des protéines, de geler le culot cellulaire et conserver à -80 ° C.
   1. Pour cyclases triterpéniques membranaires dans un vecteur pD861, induire avec 0,5 à 2 mm rhamnose et 4 h d'expression à 37 ° C pour obtenir des rendements élevés de la protéine ^21.

5. Membrane Extraction aide d'une centrifugeuse normale et Protein Purification

1. Préparer les tampons suivants: tampon de remise en suspension (mM de phosphate de potassium 100, pH 7,5 supplémenté avec inhibiteur de protéase comprimés), un tampon détergent (1% (v / v) de Triton X-100, le phosphate de potassium 50 mM, pH 7,5) et du tampon de réaction (0,2 % de Triton X-100, 50 mM de phosphate de potassium, pH 7,5).
   1. Pour squalène-cyclase hopene ou d'autres enzymes liées à la membrane avec un optimum de pH inférieur, remplacer le phosphate de potassium dans le tampon de remise en suspension avec du citrate. Pour utiliser de telles enzymes les tampons suivants: tampon de détergent (1% de Triton X-100, Citrate 60 mM, pH 6,0) et du tampon de réaction (0,2% de citrate de Triton-X 100, 60 mM, pH 6,0).
      Remarque: si une étiquette His est utilisée pour la purification, compléter le tampon de remise en suspension avec de l'imidazole 20 mM (concentration finale).
2. Peser un culot de cellules congelées dans un bêcher en verre. Remettre en suspension les cellules dans un tampon de remise en suspension en utilisant un homogénéiseur à une concentration finale de 0,3 g de cellules / ml. Lyser les cellules remises en suspension par traitement aux ultrasons avec une amplitude de 80% et une impulsion de 1 seconde à 1 seconde et hors tension. Utilisez trois cycles répétés de 50 secondes chaque.
3. Ajouter tampon détergent à une concentration finale de 0,2% (v / v) de détergent. Equilibrer la fin-sur-end de mélange à 4 ° C pendant 1 heure. Récupérer la fraction de protéine de membrane en enregistrant le surnageant après une étape de centrifugation à 39 000 xg seul pendant 50 min à 4 ° C.
   Remarque: Si l'étiquette His purification est utilisé, ajouter environ 1,5 ml Ni-NTA agarose cellules / g et incuber pendant 1 heure.
4. Effectuer une première purificationétape soit par échange d'ions ou la purification ²¹ His-tag. Compléter les équilibrage et d'élution avec 0,2% de Triton X-100. Concentrez la protéine purifiée cinq fois en utilisant centrifuges Unités de filtration avec une teneur de coupure de 10 kDa.
   Remarque: La taille des micelles résultats de Triton X-100 à une concentration de détergent à une concentration finale d'environ 1%.
5. Mettre au point une purification par une étape de polissage de filtration sur gel en utilisant le concentré de protéines et une matrice compatible avec une gamme de fractionnement de protéines globulaires de 2 × 10 ⁴ × 10 -8 ^6. Utiliser le tampon de réaction en tant que tampon de migration. Mesurer la quantité de protéine purifiée en utilisant le kit Ultra Bradford selon le protocole du fabricant.

6. Cinétique

1. Prenez un nouveau mM solution 5 de substrat dans un tampon de réaction. Obtenir une émulsion homogène par ultrasons à 30% d'amplitude pendant 2-5 min.
2. Equilibrer un thermomixerà la température de réaction désirée. Vérifier la température à l'intérieur d'un contenant de l'eau de flacon de verre par un thermomètre externe.
3. Pour cinétique unique substrat, le substrat diluer émulsifié dans au moins cinq flacons de verre à la même concentration finale en substrat.
   1. Pour cinétiques relatives un pot avec de multiples substrats, préparer au moins cinq flacons de verre identiques en mélangeant tous les substrats dans chaque flacon. Pour triterpènes hydrophobes, utiliser des concentrations de substrat final dans la gamme de 10-200 pM.
4. Pré-incuber les flacons de verre dans le Thermomixer pendant 10 min. Démarrer la réaction en ajoutant l'enzyme. Un volume de réaction total de 1 ml est appropriée. Utilisez une vitesse d'agitation d'au moins 1200 tours par minute.
5. Arrêtez les réactions à différents points de temps en ajoutant 500 pi d'acétate d'éthyle dopé avec 100 uM décanol comme une norme d'intégration.

7. Extraction et analyse thermodynamique

1. L'extraction des mélanges réactionnels par:vortex et en secouant manuellement les flacons de verre vigoureusement pendant 1 min. Centrifuger les flacons de verre à 9600 xg dans une centrifugeuse de table pour 10 min à température ambiante. Transférer la couche supérieure (phase organique) à un tube vide. Ajouter un 500 ul supplémentaires de solvant d'extraction pour les tubes de réaction et répéter la procédure d'extraction.
2. Sécher les mélanges réactionnels extrait avec Na _{2 SO 4.} Vortex pendant 5 secondes et laisser les tubes reposer pendant 10 min. Effectuer une étape de centrifugation finale à 9600 g pendant 1 min à température ambiante à l'aide d'une centrifugeuse de dessus de table. Transférer les échantillons extraits de chromatographie en phase gazeuse (GC) flacons.
3. Répéter les étapes 6.1 à 7.2 de moins pour chaque variant d'enzyme d'intérêt, en utilisant au moins quatre concentrations différentes du substrat initial (pour une cinétique de substrat simples) et quatre températures différentes (à la fois pour le substrat seul et de la cinétique de compétition).
4. Effectuer l'analyse ^GC-3 comme décrit précédemment. Utiliser une colonne non polaire pour l'analyse de hydrophobic produits pentacycliques. Régler la température initiale du four à 120 ° C et en utilisant un gradient de température de 5 ° C / min, en fonction des produits et de la colonne.
5. Intégrer les aires des pics du produit (s) et transformer les aires des pics du produit dans les concentrations du produit correspondant en utilisant la zone de la norme d'intégration (correspondant à 100 uM). Tracer la concentration de chaque produit ([P]) en fonction du temps de réaction (t). Effectuer une régression linéaire des points de données correspondant à une conversion inférieure à 10%. La vitesse de réaction initiale (V ₀₎ est donnée par la pente de la droite ajustée en fonction de:
   
   Remarque: Pour cinétiques relatives un pot avec de multiples substrats, V ₀ est le taux initial d'un substrat particulier sous l'influence d'autres substrats.
6. Pour cinétique de substrat unique, terrain V ₀ / [E] contre les concentrations de substrat correspondant. L'apparente k _{cat /} K _M valeur est donnée par la pente de la partie linéaire de la courbe en fonction de:
   
   [S] est la concentration du substrat et [E] la concentration d'enzyme utilisée dans la transformation. _Kcat / _M correspond à la constante catalytique sur la constante de Michaelis. Répétez l'analyse pour chaque température et chaque variante de l'enzyme.
7. Pour cinétique de substrat unique, effectuer une analyse thermodynamique selon la théorie de l'état de transition ²²
   
   _b k est la constante de Boltzmann, h constante, de Planck T la température en Kelvin, et R la constante des gaz. Effectuer une analyse de régression linéaire de l'intrigue de ln ((k _{cat / K M) / ((k b * T) / h))) par rapport à 1 / T. L'enthalpie d'activation (Δ H ^‡) est donnée par (-slope) R * et l'entropie d'activation (S Δ ^‡) est donnée par (interception) * R.
   Remarque: De même, une analyse au titre de saturer la concentration du substrat peut être effectuée en utilisant comme constante k cat 3 dans l'équation taux.}
8. Pour cinétiques relatives un pot avec des substrats multiples, obtenir le rapport apparent
   k _{cat /} K _{m de} valeurs ^23:
   (K _{cat /} K _{M) A /} (k _{cat /} K _{M) B} = _{0 V, A /} V _{0, B} * [B] / [A] (4)
   pour lesquels V _{0, A désigne le} taux initial de substrat A en compétition avec le substrat B.
9. Pour un pot ki rapportnétique avec de multiples substrats, obtenir les paramètres thermodynamiques relatives d'activation B, par rapport à une référence comme, par régression non linéaire:
   
10. Calculer les paramètres d'activation absolus de substrat B à partir de l'enthalpie et l'entropie d'activation de référence composé A:
    

Résultats

L'importance de la dynamique de l'eau dans la catalyse enzymatique polycyclization est impliquée par l'analyse in silico et la visualisation ultérieure de tunnels détectées (en utilisant le script dans le code supplémentaire Fiche de 2). Suite à l'article 3 du protocole, S168 se trouve être un résidu d'acide aminé "hot spot" alignant un des tunnels dans le triterpène cyclase enzyme de Alicyclobacillus acidocaldarius (Figure 1, au milieu à gauche). En introduisant la mutation S168F in silico, le tunnel est obstruée comme on le voit par inspection visuelle (figure 1, en ​​bas à gauche).

La vitesse de réaction pour la formation de produits polycycliques affichées par l'enzyme adénylate triterpénique est très sensible à la température (figure 2A). En suivant le protocole (section 7.4), on constate que le ressort _kcat / _{M affiché par enzyme de type sauvage pour la formation de produits pentacycliques cinquante fois augmente lorsque la température est élevée de 25 ° C (Figure 2A). Blocage des tunnels individuels en introduisant une mutation ponctuelle unique a un effet significatif sur les absolue k apparente cat / K M valeurs déterminées expérimentalement, ainsi que sur leur dépendance de la température (figure 2A).}

A partir des paramètres cinétiques déterminées expérimentalement, parcelles thermodynamiques linéaires sont générés par l'équation 3 et en suivant la section 6-7 du protocole de cinétique de substrat unique (figure 2B). Les très grands changements dans l'entropie d'activation et l'enthalpie observés pour les variantes hébergeant tunnels bloqués implique un rôle clé pour la dynamique de l'eau dans la promotion de la cascade de polycyclization (figure 2C, calculs basés sur la figure 2B). de plus, Des variantes avec des tunnels d'eau modifiés affichent une énergie libre de Gibbs changé d'activation ^(‡ Δ G = Δ H ^‡ - T * S Δ ^‡, figure 2B-C). Par exemple, à 303 K la variante de tunnel S168F affiche gratuitement une énergie d'activation de Gibbs 14 kcal / mol par rapport à 16 kcal / mol pour l'enzyme de type sauvage.

En suivant le protocole à l'article 7, l'équation 4 permet le calcul de k apparente _{cat /} valeurs K _M pour les substrats supplémentaires provenant d'un pot expériences de cinétique (figure 3A). De plus, un terrain thermodynamique linéaire (figure 3B) peut être construit par l'exécution de l'essai de la concurrence à des températures différentes (équation 5). Par analogie avec la cinétique de substrat simples, l'enthalpie d'activation et d'entropie par rapport à des substrats supplémentaires par rapport à un composé de référence sont readily accessible à partir de l'intersection de la pente et linéaire correspond à des données expérimentales. Les valeurs absolues des paramètres thermodynamiques de l'activation peut être évaluée à partir addition arithmétique en utilisant des données thermodynamiques associées avec le composé de référence (équation 6). En utilisant le protocole ici, générés résultats montrent clairement que l'enzyme de la membrane variants avec des tunnels d'eau bloqués présentent fondamentalement différents paramètres thermodynamiques de l'activation de substrats de différentes tailles (Figure 3C).

Figure 1. Résumé du Protocole:. Dans la modélisation informatique de silico de concert avec la conception des protéines expérimentale et analyse thermodynamique permet une meilleure compréhension de l'influence de la dynamique de solvants sur la catalyse enzymatique S'il vous plaît cliquer surici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. paramètres thermodynamiques d'activation des variantes de la cinétique de substrat unique de type sauvage et de tunnel. (A) k apparente _{cat /} valeurs K _M obtenus à partir de données expérimentales et en utilisant des équations 1 et 2. (B) l'analyse thermodynamique utilisant la théorie de l'Etat de transition et l'ajustement linéaire des données expérimentales à l'équation 3. (C) des paramètres thermodynamiques de l'activation calculées à partir des emplacements dans (B). Le substrat de squalène préplié est représenté avec liaisons formées / cassé en pointillés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. paramètres thermodynamiques d'activation des variantes de type sauvage et des tunnels pour différents substrats. (A) k relative _{cat /} K _M valeurs obtenues à partir de la cinétique d'un pot en utilisant l'équation 4. (B) parcelles thermodynamiques des données cinétiques à différents Les températures à l'aide de l'équation 5. (C) des paramètres thermodynamiques de l'activation absolues calculées par l'équation 6 et en utilisant le squalène de substrat de la figure 2 en tant que référence. Obligations formé / cassées dans les substrats sont présentés sous forme de pointillés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Les étapes les plus critiques dans la réalisation de données thermodynamiques expérimentales de haute qualité pour les variantes de l'enzyme de la membrane et des tunnels de type sauvage sont: 1) la génération du modèle d'ordinateur; 2) les protéines purifiées de manière homogène; 3) les stocks de substrat émulsionnées; 4) le contrôle de la température pendant la cinétique; 5) l'extraction de mélanges de réaction en utilisant la norme interne.

La génération du modèle informatique est grandement facilitée par l'utilisation d'un logiciel avec une interface facile à utiliser qui prend en charge une grande variété de plates-formes. Par conséquent, ce protocole est fondée sur la YASARA Modeling Suite ¹⁶ pour rendre notre stratégie accessible même à la modélisation des non-spécialistes. Un modèle informatique pour l'identification de tunnel de l'eau devrait idéalement être basé sur une structure cristalline de l'enzyme d'intérêt ^24. A cet effet, la richesse des structures cristallines disponibles dans la banque de données de protéines est très bénéfique. Dans notre expérience, un aspect clé dans la préparation réussie de systèmeplaques d'identification du tunnel est de garder les eaux cristallographiques. Il est d'une importance égale à utiliser une boîte d'enzyme solvaté lors de l'exécution simulations de dynamique moléculaire, qui peuvent être exécutés sur un ordinateur normal. Le cyclase triterpénique de Alicyclobacillus acidocaldarius est stable dans l'eau pendant ³ MD simulations. Cependant, le maintien cristallographiques détergents et / ou en utilisant des mimétiques de la membrane cellulaire peut-être pas nécessaire aurait pour enzymes potentiellement instables pour permettre des simulations de MD prolongées. Il est envisagé que la structure cristalline de cibles fortement minimisé difficiles importante pourrait fournir un aperçu mécaniste en utilisant le protocole, bien que cela ne serait pas capturer aspects dynamiques d'organisation du tunnel.

Spéléologue ¹⁹ dans le mode de base, avec un seul ou un nombre limité d'instantanés en entrée, peut être utilisée par des non-experts sur un ordinateur portable standard. Basé sur notre expérience ^3, tunnels avec un rayon de goulot d'étranglement (par exemple, le rayonau point le plus étroit) inférieur à 1 A peut être très pertinent pour l'eau, surtout si les molécules d'eau cristallographiques résident dans le tunnel prédit (Figure 1, au milieu à gauche). D'autre part, un rayon de goulot d'étranglement plus grande pourrait impliquer un tunnel pour le transport du substrat dans et hors du site actif ^10. Le script dans le Code complémentaire fichier 2 peuvent être utilisés par des non-experts pour la visualisation des tunnels prévus. De futures expériences révèlent si les modèles d'homologie seront d'une résolution suffisamment élevée pour permettre l'étude atomistique des réseaux d'eau et de la dynamique. Faire la lumière sur la façon d'effectuer des simulations de dynamique moléculaire, avec et sans ligand présent dans le site actif, influence le processus d'identification du tunnel serait également d'importance.

Cinétique de protéines membranaires peuvent constituer un formidable défi ^25. Le protocole ici sont basées sur un protocole d'extraction de simple membranepour obtenir l'enzyme de la membrane sans l'utilisation d'un matériel coûteux, comme une ultracentrifugeuse. L'utilisation de la filtration sur gel comme une étape de polissage finale élimine les particules résiduelles potentiels de membrane et permet de définir un environnement de détergent approprié ^25.

Un aspect clé dans la réalisation des résultats reproductibles cinétiques du protocole est pour émulsionner la solution stock de substrat par ultrasons. Tourbillonnement simple de substrats hydrophobes dilué dans le tampon de réaction donne des mélanges non homogènes substrat détergentes. Le pipetage des solutions de substrat non émulsionnées conduit à des concentrations non reproductibles (confirmés par GC quantitative), ce qui empêche une détermination précise du taux initiaux. En revanche, le pipetage des solutions mères convenablement émulsionnés devrait se traduire par une analyse de régression linéaire des taux initiaux avec R ² dans la plage de 0,98 à 0,99 de. Un autre aspect important de substrats hydrophobes est la solubilité apparente du substratet de la disponibilité dans les mélanges substrat détergentes. En fait, il n'a pas été possible de saturer la cyclase triterpénique avec le squalène de substrat de référence. Pour cette raison apparente k _{cat /} K _M valeurs sont présentées ici, qui pourraient contenir des contributions à la fois contraignant et de la chimie. Cependant, il a été montré que la chimie est la limitation du débit pour _k cat / K _M pour la cascade de polycyclization réalisée par cyclases triterpéniques ^3.

Il est très important de vérifier la température réelle à l'intérieur d'un flacon en verre de réaction avec un thermomètre externe. Pourtant, crises linéaires peuvent être plus pauvres pour les variantes avec k apparente _{cat /} valeurs constantes essentielle K _M à des températures différentes. Ce point est souligné pour la variante S168F ici (figure 2A) avec une enthalpie d'activation proche de zéro (figure 2B et 2C). Très Small changements dépendant de la température dans apparente k _{cat /} K _M, pourraient induire une incertitude dans l'entropie d'activation observée Δ S ^‡ (ie, l'interception dans les parcelles linéaires dans la figure 2B). En principe, l'entropie d'activation observé peut également être affectée par une abondance de différentes enzymes actifs pour différentes variantes, qui ne seraient pas détectées par la mesure de la concentration en protéines. Il est prévu que les erreurs expérimentales sont réduits lors du mélange de plusieurs substrats dans un pot. En effet, tous les différents substrats interagissent avec la même quantité d'enzyme dans ces circonstances (équation 4). L'utilisation d'un solvant d'extraction enrichi avec un étalon interne est important de tenir compte des différences au cours de l'extraction et / ou GC-injection.

Théorie de l'état de transition a été utilisé avec succès en enzymologie ^26. Ce cadre théorique important a été dépour déve- réactions unimoléculaires dans la phase gazeuse. Cependant, il a été démontré que les enzymes fonctionnent principalement en abaissant la barrière d'énergie d'activation classique ^26. Le coefficient de transmission supposé être ici une pourrait affecter l'enthalpie et / ou entropie d'activation mesuré. La contribution de l'effet tunnel, et d'autres effets non classiques tels que repassant de l'état de transition, peuvent contribuer à peu près 1000 fois à la catalyse ²⁶ correspondant à environ 4 kcal / mol dans l'énergie. On peut voir que l'entropie d'activation affichée par l'enzyme de type sauvage (16 kcal / mole à 328 K, la figure 2C) est beaucoup plus important que de tels effets non classiques provoquées par un coefficient de transmission non uniforme. L'impact du coefficient de transmission devrait diminuer lorsque l'on compare les paramètres thermodynamiques d'activation pour les variantes de type tunnel et sauvages utilisant le protocole.

L'énergie libre d'activation (Δ G ^‡) est composed la fois d'une enthalpie (Δ H ^‡) et une entropique (- T * S Δ ^‡) terme. Réorganisation solvant enzymes pendant la catalyse peut influencer les deux paramètres. Le présent protocole est prévu pour faciliter l'étude de ces phénomènes par l'assemblage d'une boîte à outils des outils informatiques pertinents et convivial in silico avec le cadre expérimental biophysique nécessaire. Le procédé est prévu pour être utile pour étudier une pléthore de processus enzymatiques, y compris la catalyse par des enzymes liées à la membrane.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
YASARA	YASARA Biosciences	http://www.yasara.org/	Programme de modélisation et simulation moléculaires  ;
CAVER  ;	CaverSoft	http://caver.cz/	Outil pour l’analyse des tunnels dans les protéines, licence gratuite à usage académique
Bradford Ultra	Expedeon	BFU1L, BFU05L	Quantification des protéines dans des solutions contenant jusqu’à 1
Homogénéisateur Potter-Elvehjem	VWR	432-0205, 432-0217	Homogénéisation de granulés de cellules congelées
Inhibiteur de protéase Cocktail	Tablets Roche	4693159001	Inhibiteur de protéase
Unités de filtration centrifuge	Millipore	UFC901008	Unités de filtration centrifuges pour la concentration de protéines, MWCO 10 kDa
Thermomixeur  ;	Thermomélangeur Eppendorf	5382000015	pour l’incubation d’échantillons

 % de détergent