Article de méthode

Identification des bactéries pathogènes rares par 16S ARNr Gene Séquençage et MALDI-TOF MS

DOI :

10.3791/53176

⸱

11 juillet 2016

 ,  ,  , 
1Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden, 2Institut für Virologie, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La spectrométrie de masse à temps de vol laser assistée par matrice (MALDI-TOF MS) et les techniques moléculaires (séquençage du gène de l’ARNr 16S) permettent d’identifier des pathogènes bactériens rares dans les diagnostics de routine. L’objectif de ce protocole réside dans la combinaison des deux techniques qui permet d’obtenir des données plus précises et plus fiables.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il y a un certain nombre d'agents pathogènes bactériens rares et, par conséquent, décrit insuffisamment qui sont signalés à causer des infections graves en particulier chez les patients immunodéprimés. Dans la plupart des cas, seules quelques données, pour la plupart publiées sous forme de rapports de cas, sont disponibles qui enquête sur le rôle de ces agents pathogènes comme un agent infectieux. Par conséquent, afin de clarifier le caractère pathogène de ces micro-organismes, il est nécessaire de mener des études épidémiologiques qui comprennent un grand nombre de ces bactéries. Les méthodes utilisées dans cette étude de surveillance doivent répondre aux critères suivants: l'identification des souches doit être précise selon la nomenclature en cours de validité, ils devraient être faciles à manipuler (robustesse), économique dans le diagnostic de routine et ils doivent générer comparables les résultats entre les différents laboratoires. En général, il existe trois stratégies pour identifier des souches bactériennes dans un cadre de routine: 1) l'identification phénotypique caractérisant le Biochemical et métaboliques propriétés des bactéries, 2) les techniques moléculaires telles que le séquençage du gène ARNr 16S et 3) la spectrométrie de masse comme une approche basée roman protéome. Etant donné que la spectrométrie de masse et les approches moléculaires sont les outils les plus prometteurs pour l'identification d'une grande variété d'espèces bactériennes, ces deux méthodes sont décrites. Les progrès, les limites et les problèmes potentiels lors de l'utilisation de ces techniques sont discutées.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identification sécurisée des agents pathogènes rares dans le diagnostic de routine est entravée par le fait que les méthodes culturales et biochimiques classiques sont encombrants et parfois discutable. En outre, un laboratoire de microbiologie diagnostique doit traiter un grand nombre d'agents pathogènes, allant de quelques centaines à plusieurs milliers par jour, ce qui nécessite l'utilisation de systèmes automatisés. En plus de la gestion d'un débit journalier élevé, l'identification précise des espèces bactériennes est nécessaire. Cela est justifié car ils diffèrent dans leur modèle de sensibilité aux antimicrobiens et l' identification correc....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Extraction de l'ADN bactérien

  1. Préparation de la solution PBS
    1. Peser 1,65 g de Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, 0,22 g de NaH 2 PO 4 x 2H 2 O et 8,80 g de NaCl dans un flacon et remplir avec de l' eau distillée jusqu'à un volume final de 1000 ml. Ajuster le pH à 7,4. Pour utilisation finale filtrer la solution à travers une bactérie résistant (0,22 um) filtre.
  2. Les bactéries d'extraction d'ADN de bactéries à Gram négatif
    1. Streak le matériel du patient sur ​​les milieux de culture approprié (par exemple, Columbia gélose au sang), d' id....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MALDI-TOF MS est une nouvelle méthode rapide et peu coûteuse pour le diagnostic de routine microbiologiques. Bactérienne identification des espèces par MALDI-TOF MS produit des spectres principalement composé de protéines ribosomiques , mais aussi d' autres "protéines très conservées avec des fonctions internes de maintien affectés dans une mesure minimale par les conditions environnementales" 17 base de données .La de cette MMIS contient un grand nombre de spectres de référen.......

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deux MALDI-TOF et le séquençage du gène de l'ARNr 16S offrent la possibilité d'identifier un grand nombre de bactéries différentes. MALDI-TOF MS est une méthode rapide et peu coûteuse, qui est facile à manipuler et de grandes bases de données de spectres de masse bactérienne sont disponibles. Pour cette raison, MALDI-TOF MS est un coût moyen rapide, efficace et fiable pour mener des études de dépistage axés sur les bactéries pathogènes rares 17,20,39,51. Dans une étude prospective comparant MALDI-TOF .......

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tiennent à remercier le professeur Enno Jacobs pour son soutien continu.

....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
CHROMASOLV, eau de qualité HPLC, 1 LSigma-Aldrich Chemie, Mü ; nchen, Allemagne270733
Lyser de tissus LTQiagen, Hilden, Allemagne85600Homogénéisateur oscillant
Billes de verre 1,0 mmVWR International, Darmstadt, Allemagne412-2917
Thermomixeur 5436Eppendorf, Hambourg, Allemagne2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250)Qiagen, Hilden, Allemagne51306
Taq PCR Core Kit (1,000 U)Qiagen, Hilden, Allemagne201225
Amorce Forward TPU1 (5´ ;-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')biomers.net, Ulm, Allemagne  ;-
Amorce inversée RTU4 (5´ ;-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´ ;)biomers.net, Ulm, Allemagne  ;-
Mastercycler  ;Eppendorf, Hambourg, Allemagne-  ;Thermocylcer
Tube à réaction 1,5 mlSARSTEDT, Nü ; mbrecht, Allemagne72,692
Tube à réaction 2 mlSARSTEDT, Nü ; mbrecht, Allemagne72,693,005
PCR 8er-CapStripsBiozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Allemagne711040X
PCR 8er-SoftStripsBiozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Allemagne711030X
Sharp R-ZV11  ;Sharp Electronics, Hambourg,Allemagne-Micro-ondes
Titriplex III (EDTA Na2-sel déshydraté ; 1 kg)Merck, Darmstadt, Allemagne1084211000
SeaKem LE AgaroseBiozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Allemagne849006
SmartLadder SF - 100 à 1 000 pbEurogentec, Lü ; ttich, BelgiqueMW-1800-04
Bleu de bromophénol (25 g)Sigma-Aldrich Chemie, Mü ; nchen, AllemagneB0126
Xylène cyanol FF (10 g)Sigma-Aldrich Chemie, Mü ; nchen, AllemagneX4126
ComPhor L Maxi  ;Biozym, Hessisch Oldendorf,Allemagne-Solution
de bromure d’éthidium 1 % (10 ml)Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne2218.1
Gel Doc 2000Bio-Rad Laboratories, Mü ; nchen,Allemagne-Gel-documentation system  ;
ExoSAP-IT (500 réactions)Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, Royaume-Uni78201
Buffer (10x) avec EDTA  ;Life Technologies, Darmstadt, Allemagne402824
BigDye Terminator Kit v1.1Life Technologies, Darmstadt, Allemagne4337450
Hi-Di formamide (25 ml)Life Technologies, Darmstadt, Allemagne4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250)Qiagen, Hilden, Allemagne63206
3130 Analyseur génétiqueLife Technologies, Darmstadt, Allemagne-Séquenceur
MicroAmp Plaque de réaction optique 96 puits avec code-barresLife Technologies, Darmstadt, Allemagne4306737
Analyseur génétique 3130, base de plaque 96 puitsLife Technologies, Darmstadt, Allemagne4317237
Analyseur génétique 3130, retenue de plaque 96 puitsLife Technologies, Darmstadt, Allemagne4317241
Analyseur génétique 3130, puits Septa à plaquesLife Technologies, Darmstadt, Allemagne4315933
Analyseur génétique 3130, polymère POP-7, 7 mlLife Technologies, Darmstadt, Allemagne4352759
3130 Analyseur génétique, réseau de 4 capillaires, 50 cmLife Technologies, Darmstadt, Allemagne4333466
Logiciel d’analyse de séquençage 5.4Life Technologies, Darmstadt, Allemagne-
microflexBruker Daltonik, Brême,Allemagne-NotremMIS
VITEK MSbioMé ; rieux, Nü ; rtingen, Allemagne  ;2nd mMIS
flexControl 3.4Bruker Daltonik, Brême,Allemagne-Logicielde contrôle de l’appareil
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC)Bruker Daltonik, Brême,Allemagne-Logicield’analyse
&alpha ;-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1  ; gBruker Daltonik, Brême, Allemagne201344
Étalon d’étalonnage des peptides IIBruker Daltonik, Brême, Allemagne222570
MSP 96 cible acier poliBruker Daltonik, Brême, Allemagne8224989
peqGREENpeqlab  ;37-5010
MALDI Biotyper Galaxy  ;Bruker Daltonik, Brême, AllemagneRéf. 1836007Système automatisé de préparation d’échantillons
Vitek 2  ;bioMé ; rieux, Nü ; rtingen, Allemagne  ;Notre
aMIS MicroScan  ;Beckman Coulter, Krefeld, Allemagne2nd aMIS
BD Phoenix&trade ; Système de microbiologie automatiséBD, Heidelberg, Allemagne3rd aMIS
i>Staphylococcus aureus  ;subsp.  ; aureus  ; Rosenbach (ATCC® ;   ; 25923&commerce ;)American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, FranceContrôle positif pour la PCR  ;
<

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. (2010).
  2. Ch. 5. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. 81-104 (2010).
  3. Adekambi, T., Drancourt, M., Raoul....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

S quen age du g ne de l ARNr 16Sidentification de pathog nes bact riensd tection de bact ries raresanalyse par spectrom trie de massetechniques mol culairesmicrobiologie diagnostiqueapproche bas e sur le prot omeprofilage biochimiques quen age de Sanger

Articles connexes