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Summary

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Abstract

Expériences pour mesurer les propriétés de perméabilité des microvaisseaux perfusés individuellement fournissent un pont entre l'enquête des mécanismes moléculaires et cellulaires régulant la perméabilité vasculaire dans des monocouches de cellules endothéliales en culture et les propriétés des lits microvasculaires entiers de change fonctionnels. Une méthode pour canuler et perfuser microvaisseaux des veinules de mésentère de rat et de mesurer la conductivité hydraulique de la paroi des microvaisseaux est décrite. L'équipement principal nécessaire comprend un microscope intravitale avec une grande scène modifiée qui prend en charge micromanipulateurs de positionner trois microtools différents: (1) une micro-pipette de verre biseauté à Cathétériser et perfuser l'microvaisseaux; (2) un verre de micro-obturateur pour bloquer temporairement la perfusion et permet la mesure de mouvement d'écoulement d'eau transvasculaire à une pression hydrostatique mesurée, et (3) une tige de verre émoussé pour stabiliser le tissu mésentérique au niveau du site de ponction. La Landis micro-occlusion techniq modifiéeue utilise les globules rouges en suspension dans le liquide de perfusion artificielle comme marqueurs de mouvement fluide transvasculaire, et permet également des mesures répétées de ces flux conditions expérimentales sont modifiées et de la différence de pression osmotique colloïde hydrostatique et à travers les microvaisseaux sont soigneusement contrôlées. Les mesures de conductivité hydraulique première aide d'un liquide de perfusion de commande, puis après une nouvelle ponction de même avec les microvaisseaux perfusats de test permettre des comparaisons de la réponse des microvaisseaux dans ces conditions bien contrôlées jumelés. Les tentatives visant à étendre la méthode de micro-vaisseaux dans le mésentère des souris avec des modifications génétiques prévus pour modifier la perméabilité vasculaire ont été sévèrement limitée à cause de l'absence de longs microvaisseaux droites et non ramifiées dans le mésentère des souris, mais la disponibilité récente des rats avec des modifications génétiques similaires en utilisant la technologie / cas9 CRISPR est prévu d'ouvrir de nouveaux domaines de recherche où les méthodes décrites ici peuvent être appliquées. </p>

Introduction

Microperfusion dans le système vasculaire consiste à établir un écoulement d'un liquide de perfusion de composition connue artificielle commandé par l'intermédiaire d'une micropipette dans un vaisseau sanguin généralement inférieure à 40 um de diamètre. Le récipient perfusé reste dans son environnement normal et de tissu est perfusé avec du sang de l'animal jusqu'à l'heure de canulation le. Lorsqu'il est utilisé en conjonction avec une gamme de l'imagerie vidéo ou techniques fluorométriques, microperfusion in situ permet de mesurer des débits d'eau et de solutés à travers les murs de microvaisseaux dans des conditions où les forces motrices de ces flux sont connus et les propriétés de perméabilité de la paroi vasculaire peuvent être directement évaluée. De plus, en contrôlant la composition du fluide entourant la microvaisseaux dans le tissu (perfusat et superfusat), la régulation de la perméabilité microvasculaire et l'échange peut être étudiée en activant les cellules endothéliales qui forment la paroi de microvaisseaux à être exposée à une variété de econditions Xperimental (agonistes, conditions de perfusion modifiés, les indicateurs fluorescents pour mesurer la composition et la signalisation intracellulaire) pour des périodes mesurées précisément de temps (sec) à h. En outre, les évaluations ultrastructurales ou cytochimiques de structures moléculaires cellulaires clés régissant la barrière peuvent être étudiés dans les mêmes microvaisseaux dans lequel la perméabilité est mesurée directement. L'approche forme ainsi un pont entre l'enquête des mécanismes cellulaires et moléculaires de modifier la fonction de barrière endothéliale chez les monocouches de cellules endothéliales en culture et enquête microvaisseaux intactes. Voir les commentaires suivants pour une évaluation plus approfondie ^1-6.

Une limitation de microperfusion est qu'il peut être utilisé que dans des lits microvasculaires qui sont minces, transparentes et ayant une intégrité structurelle suffisante pour permettre une canule avec une micropipette de verre. Alors que les premières enquêtes utilisées microvaisseaux de grenouilles dans mésentère et mince cutanée angine muscle ^7,8, de loin la préparation la plus couramment utilisée dans les modèles de mammifères est le mésentère de rat ^9-15. La plupart des enquêtes ont porté sur les changements aigus de la perméabilité vasculaire étudié sur des périodes de 1-4 heures, mais des études plus récentes ont été étendus à des mesures sur les navires individuels 24-72 h après une première perfusion ^12,16. La technologie CRISPR récemment mis au point, qui promet de faire des modèles de rats plus génétiquement modifiés disponibles pour l'étude de la régulation de la perméabilité vasculaire ¹⁷ devrait permettre aux méthodes décrites dans la présente communication à appliquer dans les microvaisseaux des veinules du mésentère dans ces nouveaux modèles importants de rat.

La méthode nécessite un microscope inversé équipé d'une platine de microscope construite sur mesure assez grand pour contenir à la fois la préparation des animaux et au moins trois micromanipulateurs utilisé pour positionner microtools à proximité de la cuve perfusé et d'aligner une micropipette de perfusion avec le navirelumen. Par exemple, une plate-forme de commande pour un étage xy de microscope (environ 90 × 60 cm) peut être fabriqué à partir d'une plaque d'acier 1 cm d'épaisseur avec un revêtement anti-rouille. La scène est attaché à une table d'index d'ingénierie ou deux diapositives en queue d'aronde montés à angle droit et reposant sur des piliers en téflon ou les transferts de billes pour le déplacement dans le plan horizontal. Une installation typique (voir la figure 2) a beaucoup en commun avec l'équipement de microscope et micropositionnement utilisée pour toute une gamme d'expériences de la microcirculation intravitale tels que ceux de mesurer seul flux sanguin du navire et de l'hématocrite, la livraison d'oxygène locale par le sang perfusé microvaisseaux, réglementation des lisses vasculaires le tonus musculaire, et l'accumulation de micro-vasculaire local des traceurs fluorescents injectés dans l'ensemble de la circulation. ^18-26

L'aspect fondamental de la technique est la mesure de débit volumique (J _v) sur une zone de surface définie (S) de la paroi de microvaisseaux. Accomplirce par la technique de Landis modifié décrit ici un microscope inversé simple, est adéquat. Une petite caméra vidéo est montée sur l'orifice de l'image et le signal vidéo, avec une base de temps supplémentaire, est affichée sur un moniteur vidéo et enregistrés soit sous forme numérique sur un ordinateur ou sous forme de signal numérique ou analogique sur un enregistreur vidéo. Une fois que la canule microvaisseaux est la partie de la microvaisseaux visible par la caméra peut être modifiée par déplacement de la platine et les manipulateurs en tant qu'unité sans perturber la canulation.

Mesure des flux de transvasculaires peut également être combiné avec des études plus détaillées à l'aide d'un microscope à fluorescence avec filtres appropriés sophistiqués tels que les plates utilisées pour les mesures de perméabilité soluté, la surveillance de la fluorescence du calcium cytoplasmique rapport ou d'autres mécanismes cellulaires, et l'imagerie confocale ^{6,12,13, 27.} Un avantage clé de toutes les approches de microperfusion est la capacité de faire des mesures répétées, sur le même navire, Sous changement contrôlé de la force motrice telles que des pressions hydrostatiques et oncotiques, ou changement induit dans les réponses des navires à des conditions inflammatoires. La conception la plus commune est une comparaison par paires de la conductivité hydraulique mesurée (L _p) sur le même navire avec le premier récipient perfusées via une micropipette remplie d'un liquide de perfusion de contrôle et la suspension de globules rouges à établir un état ​​de référence de perméabilité, puis avec un second pipette avec l'agent de test ajouté au perfusat. Canulations multiples sont possibles avec le cycle répété après reperfusion avec la pipette de commande.

Le présent protocole démontre la canule et microperfusion d'un navire veinulaire dans mésentère de rat pour enregistrer les flux d'eau à travers la paroi des microvaisseaux et mesurer la L _{p de la} paroi de la cuve, un indice utile de la perméabilité de la voie commune pour l'eau et de solutés à travers le intacte barrière endothéliale. La procédure est appelée la techniq modifié Landisue parce que le principe Landis originale d'utiliser le mouvement relatif des globules rouges comme une mesure de l'échange fluide transvasculaire après perfusion est bloqué est préservée ^28, mais l'éventail des conditions expérimentales (par exemple, les différences de pression oncotiques hydrostatiques et de l'albumine à travers la paroi des microvaisseaux) disponible après microperfusion est beaucoup plus grande que dans le sang perfusé microvaisseaux uncannulated ^8,29.

Protocol

Déclaration éthique: Toutes les procédures ont été examinés et approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle. 1. Fabrication préliminaire de Micropipettes, retardateurs, et bloqueurs Tirer plusieurs tubes capillaires en verre de borosilicate propres en utilisant un extracteur moitié électronique ajustée de sorte que, lorsqu'il est tiré, la partie étirée du tube est d'environ 1 cm de longueur et les deux moitiés sont quelque peu symétrique. Assurez-vous que le cône est compatible avec les dimensions à la figure 1. Utilisez les deux moitiés pour micropipettes, retardateurs et les bloqueurs. Bevel micropipettes utilisant un air entraîné meule 30 avec 0,5 um papier abrasif baigné avec de l'eau. Régler l'angle du support de micropipette de sorte qu'il est d'environ 30 degrés par rapport à l'horizontale. Bien laver et sécher les micropipettes en utilisant aspiration pour tirer l'acétone propre à travers la pointe et jusqu'à l'arbre. Inspectez les micropipettes (Figure 1A) à l'aide d'un petit microscope droit avec 4 × 40 × et objectifs équipés d'un support de micropipette pince crocodile et d'un réticule de l'oculaire. Sélectionnez micropipettes avec embout ouverture d'environ 50 um de long avec un biseau dont le rapport longueur / largeur est entre 3,1 et 3,5 et un point fortement conique qui aide à pénétrer les fibres de collagène difficiles dans le mésentère. Stockez 15-20 micropipettes de légèrement différentes tailles dans une boîte sans poussière. Assurez retardateurs utilisant des tubes capillaires tirés préparés à l'étape 1.1). Tenez un tube capillaire en verre tiré brièvement près d'un microflamme pour former une extrémité émoussée (figure 1B). Stocker plusieurs dans une boîte sans poussière. Assurez microoccluders utilisant des tubes capillaires tirés préparés à l'étape 1.1). Tenez un tube capillaire tiré sous un microflamme et doucement plier (en utilisant un adaptateur de tube, par exemple., 23G) de la pointe fine (environ 4 mm de la pointe) pour faire un angle de près de 120 degrés à l'arbre ( <strong> Figure 1C). Marque et stocker plusieurs. 2. Préparation des animaux et de chirurgie Anesthetize mâle (350-450 g) ou des rats femelles Sprague-Dawley (200-300 g) avec du pentobarbital sodique (80 à 100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) par injection sous-cutanée; protéger le mésentère par ne pas utiliser l'injection intrapéritonéale. Tout au long des procédures chirurgicales et des protocoles expérimentaux, de maintenir l'anesthésie par des injections supplémentaires (30 mg / kg) selon le besoin. Déterminer profondeur de l'anesthésie par pincement de l'orteil ou réflexe cornéen. Après achèvement de la procédure expérimentale, le rat euthanasie par surdose de pentobarbital ou injection intra-cardiaque de chlorure de potassium saturé sous anesthésie. 3. Préparer des solutions et des érythrocytes pour une utilisation comme Flow Markers Préparer la solution de Ringer mammifère pour superfusat et la solution de contrôle de perfusat (acide généralement le mammifère de solution de Ringer contenant 10 mg / ml grasalbumine libre de sérum bovin, BSA). Filtre de perfusion grâce à 0,2 um filtres seringue pour éliminer les particules minuscules qui pourraient bloquer la pointe de micropipette; filtrer dans un petit récipient propre. Préparer érythrocytes par étirage d'environ 0,2 ml de sang de la veine de la queue du rat anesthésié dans une aiguille de 20G sur une petite seringue contenant 0,05 ml d'héparine (1000 U / ml) et transférer dans un tube de 15 ml de centrifugeuse contenant environ 14 ml de mammifère solution une solution de Ringer . Centrifugeuse pour emballer en douceur les cellules rouges (environ max 200 g pendant 7 min). Dessinez le surnageant et remettre en suspension les globules rouges dans la solution de Ringer. Après centrifugation et retrait du surnageant trois fois laisser les globules rouges concentrés dans le fond du tube pour une utilisation ultérieure. Notez que cette procédure permet de réduire les plaquettes dans perfusats finale à moins de 0,1% des niveaux normaux 31. 4. Disposer les tissus de l'animalPlateau Raser l'abdomen du rat anesthésié par le dessous du nombril au processus xiphoïde. Assurez-vous que la zone rasée étend autour du côté droit (pour rat placé sur le côté droit) de sorte que les cheveux ne fait pas une mèche d'attirer l'superfusat hors du tissu ainsi. Enlever les poils coupés avec un tampon de gaze ou un tissu mouillé. Maintenez la peau avec un instrument contondant pince dentelées et faire une incision ligne médiane (2-3 cm de long) à travers la peau en utilisant une paire de ciseaux robustes. Utilisation d'une amende (IRIS) ciseaux font une incision similaire, par la ligne blanche, soulever la paroi abdominale avec des pinces dentelées pour éviter d'endommager l'intestin. Avec l'animal sur le côté sur le plateau de l'animal, tirez doucement l'intestin de la cavité abdominale à l'aide d'applicateurs coton-tige (bâton de bois) trempés dans une solution de Ringer et une pince dentelées contondants. Disposer l'intestin dans le tissu même de sorte que le mésentère est drapée sur le pilier pour la visualisation au microscope en prenant soin d'éviter de toucher le mésentère (poteendommager ntially microvaisseaux) soit avec des forceps ou de coton. Remarque: Le plateau des animaux (figure 2A) peut être construite à partir de plexiglas et nécessite un tissu bien (environ 3 mm de profondeur), un pilier optiquement clair (par exemple, le quartz poli environ 2 cm de diamètre et 5 mm de haut.), Et un coussin chauffant ajustée pour maintenir la température de l'animal. L'épaisseur de la colonne ne doit pas dépasser la distance de travail de l'objectif. Placez le bac animale sur la platine du microscope afin que le mésentère est visible à travers les oculaires. Placez une ligne de goutte à goutte par gravité à superfuse permanence le mésentère avec la solution de Ringer mammifère maintenue à 35-37 ° C. Utilisez des tampons de gaze pour maintenir l'intestin en place, pour conserver l'humidité, et la mèche de la solution de Ringer excès de la surface. Régler le débit de l'effluent et aspirer à maintenir une épaisseur de superfusat cohérente. Identifier les cibles microvaisseaux veinules, qui sontsegments linéaires en aval de l'écoulement convergente, une ou deux branches distales de vrais capillaires. Trouver un vaisseau non ramifié (idéalement, 600 à 1000 mm de longueur) ayant flux sanguin rapide et exempt de cellules blanches collées sur la paroi du vaisseau. Placez le microvaisseaux de test dans le centre du champ de microscope et déplacer le dispositif de retenue en position à proximité du site de ponction choisi. 5. Remplissez Micropipette et Mount Holder Juste avant cannulating, suspendre les globules rouges dans le perfusat. Ajouter 7 pi de globules rouges à 0,5 ml de perfusion dans un tube à essai de borosilicate propre. Remarque: les hématocrites de 1-3% peuvent être utilisés, mais hématocrite cohérente seront conduire à des concentrations de perfusat cohérentes de toutes les substances libérées par les globules rouges. Monter une seringue de 1 ml avec un adaptateur de tube de 23G et PE 50 tubes (5-15 cm de longueur). Dessinez le mélange de cellules de perfusion / rouge dans la seringue. Inversez la seringue de mélanger et d'expulser toutes les bulles à partir de tubes etadaptateur. Pour une efficacité accrue, des tubes en forme à plusieurs seringues avant l'expérience commence et les conserver dans une boîte sans poussière ou un sac plastique. Remplir la micropipette en faisant avancer le tube dans la grande extrémité de la micropipette jusqu'à venir en butée de la région conique. Appliquer une poussée rapide douce sur le piston de la seringue pour remplir la pointe de la micropipette. Remarque: Un petit ruisseau ou gouttelettes doivent être visibles à la pointe de mettre en évidence le remplissage complet. Retirer le tube tout en poussant doucement sur le piston pour remplir la partie la plus large de l'arbre de micropipette. Retirer petites bulles dans l'arbre de large en feuilletant attentivement l'arbre de micropipette. Remarque: Une procédure similaire a été illustrée 32. Placer la micropipette dans un support de pipette avec un orifice latéral qui permet une connexion de fluide continu à un manomètre à eau. Veiller à ce que le titulaire, qui est attaché à un entraînement hydraulique utilisé pour contrôler très fine avancement de la micropipette, est à un léger angle (15-25 °)à l'horizontale de sorte que le bord du cône de micropipette ne touche pas l'intestin ou d'un plateau. Monter l'entraînement hydraulique sur un micromanipulateur mobile, qui a x, y et z lecteurs pour permettre un alignement étroit de la cuve d'essai (figure 2). Régler la pression hydrostatique appliquée sur le fluide dans la seringue en utilisant une micropipette ou poire en caoutchouc rempli d'eau pour modifier la hauteur de liquide dans la colonne d'eau du manomètre à environ 40 cmH 2 O au-dessus du mésentère. Cathétériser l'microvaisseaux dès que possible après le remplissage de la pipette; globules rouges se déposent au fond de la pipette, de sorte que, après environ 40 min très peu de globules rouges seront versés dans le récipient. 6. Microcannulation et microvasculaire mesure de pression Avant de positionner la micropipette remplie sous le microscope, appuyez doucement sur le dispositif de retenue sur le tissu près de la microvaisseaux appliquer une force suffisante pour saisir le tissu. Dessinez lerestrainer à dos, légèrement en étirant le tissu conforme à l'microvaisseaux de sorte que les contraintes dans les fibres de collagène mésentériques sont alignés avec le récipient. Aligner la micropipette avec le navire et l'abaisser dans vue à travers les oculaires. Placez la pointe juste en amont du site de ponction choisi et l'abaisser sur le tissu afin qu'il obstrue partiellement l'écoulement dans le vaisseau, mais ne pas obstruer. Cathétériser la cuve par la conduite de la pointe de la pipette lentement dans la lumière du vaisseau à l'aide de la commande hydraulique. Veillez à ne pas pousser à travers la partie inférieure de la cuve. Remarque: Comme la micropipette entre dans le lumen, le perfusat lave rapidement le sang dans le récipient hors de la lumière et perfusat librement flux en circulation de l'distale de l'animal à la microvaisseaux d'essai, en déplaçant une partie de la perfusion sanguine normale dans les vaisseaux en aval. Abaisser la pression de perfusion en ajustant le manomètre jusqu'à ce que le sang (comme indiquépar les globules rouges de l'animal) est tiré en arrière dans le segment perfusé; ce qui détermine la pression d'équilibre où les globules rouges oscillent doucement dans la lumière du vaisseau et mesure la pression hydrostatique des microvaisseaux (P c) à l'extrémité distale du segment de microvaisseaux. Maintenir navire perfusion à toutes les pressions au-dessus de cette pression de l'équilibre. 7. Microocclusion et collecte de données Etape facultative: Avant d'utiliser le micro-dispositif d'occlusion pour bloquer le navire, l'enfoncer dans le tissu dans une zone non utilisée du mésentère loin de tout navire de telle sorte que la pointe accumule une amende pad de tissu qui protège le navire expérimental au cours micro répétée occlusions. Placer le dispositif de blocage au-dessus du récipient perfusé à proximité du bord inférieur du champ de microscope. Consigner les renseignements suivants avec la vidéo et l'audio. Enregistrer verbalement l'emplacement du site de bloc et le bord inférieur de l'écran comme on le voit sur le réticule d'oculaire. Avec la pointedu bloqueur placé juste au-dessus de la microvaisseaux, utilisez le z contrôle fin de l'micromanipulateur pour abaisser doucement le bloqueur jusqu'à ce que le flux dans la cuve est obstruée. Notez la pression du manomètre (P c) sur audio. Appliquer occlusion typiquement pour 3-10 secondes, puis relâchez, la restauration de la perfusion libre. Déplacez le site de bloc le navire vers la pointe de la pipette en 5-10 pm étapes en fonction du temps (> 5 min après le bloc initial à un site), le nombre d'occlusions (3-5), pour empêcher navire dommages murale sur le site de bloc . 8. Analyse des données et la mesure de L p (perméabilité à l'eau) Pendant la lecture vidéo, déterminer la distance initiale (ℓ 0) à partir d'un marqueur cellulaire rouge pour le site de l'occlusion par l'utilisation d'une image d'un micromètre et les positions connues sur les images. Déterminer la vitesse initiale (dl / dt) de la cellule de marqueur à partir de sa position en plusieurs trames au cours de la seconde 10.3 des images enregistrées. Dissuadermienne rayon de la cuve (r) à partir des images prises pendant l'occlusion (Figure 3). Calculer J v / S pour chaque occlusion (dl / dt) x (1 / ℓ 0) x (r / 2). Calculer L p à une pression constante (J V / S) divisée par la pression de conduite (pression des microvaisseaux – pression osmotique colloïde efficace; voir Discussion).

Representative Results

La figure 4 montre les résultats de la mesure de l'évolution dans le temps des changements de L p dans un rat veinulaire microvaisseaux canule successivement avec quatre perfusats. 33 L'amplitude de L p calculée à une pression constante a été utilisée comme mesure de l'évolution des microvaisseaux paroi perméabilité, d'une part dans l'état de commande avec un liquide de perfusion contenant 1% d'albumine de sérum bovin, puis lorsque le …

Discussion

Détails de L calculs _p. Bien que le mouvement du fluide transvasculaire se produit alors que le navire est librement perfusé, tel échange est trop petite pour être mesurée pendant la perfusion libre car elle est généralement moins de 0,01% du taux de perfusion de navire. Toutefois, lorsque la perfusion est temporairement arrêté par occlusion de la microvaisseaux, écoulement transvasculaire (par exemple, filtration) est mesurée à partir de la circulation des globules rouges de mar…

Materials

MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage–you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage–you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform–1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio–generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive 	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	 (or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray–needs cord and controller–240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope–see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
   with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back–can be purchased from Amazon