Utilisation de mitochondries isolées à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour microplaques à haut débit respiratoire mesurée

Résumé

Les méthodes présentées fournissent des instructions étape par étape pour la réalisation d’une collection de tests respiratoires basés sur des microplaques utilisant des mitochondries isolées à partir de quantités minimales de muscle squelettique de souris. Ces tests sont capables de mesurer les changements/adaptations mécanistes de la consommation d’oxygène mitochondrial dans un modèle animal couramment utilisé.

Résumé

Les mitochondries du muscle squelettique jouent un rôle spécifique dans de nombreuses pathologies pathologiques. En tant que tel, la mesure de la consommation d’oxygène en tant qu’indicateur de la fonction mitochondriale dans ce tissu est devenue plus répandue. Bien qu’il existe de nombreuses technologies et essais qui mesurent les voies respiratoires mitochondriales dans une variété de cellules, de tissus et d’espèces, il existe actuellement un vide dans la littérature en ce qui concerne la compilation de ces essais à l’aide de mitochondries isolées du muscle squelettique de souris pour une utilisation dans des technologies basées sur des microplaques. Il est important de noter que l’utilisation de tests respiratoires basés sur des microplaques est de plus en plus répandue parmi les biologistes mitochondriaux, car elle permet d’effectuer des mesures à haut débit en utilisant des quantités minimales de mitochondries isolées. Par conséquent, une collection de tests respiratoires sur microplaques a été mise au point pour évaluer les changements/adaptations mécanistes de la consommation d’oxygène dans un modèle animal couramment utilisé. Les méthodes présentées dans le présent document fournissent des instructions étape par étape pour effectuer ces tests avec une quantité optimale de protéines mitochondriales et de réactifs, et une grande précision, comme en témoigne la variance minimale sur toute la plage dynamique de chaque test.

Introduction

Le principal rôle physiologique des mitochondries du muscle squelettique est de produire de l'ATP à partir de la phosphorylation oxydative ^1. Surtout, les mitochondries des muscles squelettiques jouent un rôle spécifique dans l'exercice ^capacité de 2, ³ vieillissement diabète, maladie dégénérative ^{4 et 5} de type II. Comme une société vieillissante, et du diabète de type II étant la 7 ^ème cause de décès aux États-Unis ^6, le besoin de méthodes qui permettent d'évaluer la fonction mitochondriale est devenu de plus en plus répandue dans la recherche biomédicale ^7,8. Plus précisément, la mesure de la consommation d'oxygène a une utilité exceptionnelle pour l'évaluation de la fonction mitochondriale, car elle représente la fonction coordonnée entre les génomes mitochondriaux et nucléaires pour exprimer les composants fonctionnels de la phosphorylation oxydative ^9.

Plusieurs technologies existent qui permettent la mesure de la consommation d'oxygène dans les cellules intactes et isolentd mitochondries ^7-10. En outre, des essais ont été développés pour plusieurs types de cellules et de tissus, et dans une variété d'espèces qui permettent la mesure des voies respiratoires mitochondriaux et contrôle ^9,11,12. Toutefois, il existe actuellement un vide dans la littérature en ce qui concerne la compilation de tous ces tests utilisant des mitochondries isolées de muscle squelettique de souris pour une utilisation dans les technologies de la consommation d'oxygène de microplaques base. Surtout, l'utilisation de microplaques basé dosages respirométriques se développe parmi les biologistes mitochondriales et permet des mesures à haut débit en utilisant des quantités minimales de mitochondries isolées ^9. Par conséquent, une collection de microplaques basé dosages respirométriques ont été développés qui permettent de repérer où des anomalies et / ou adaptations peuvent se produire dans la chaîne de transport d'électrons (ETC). En outre, deux essais respirométriques sur microplaques supplémentaires ont été élaborés afin de permettre l'évaluation de la coordination between l'acide (TCA) le cycle tricarboxylique et l'ETC, et entre la ß-oxydation et la ETC. Surtout, les méthodes présentées fournissent une manière claire et concise pour mesurer les changements dans la fonction mitochondriale mécanistes dans un modèle animal couramment utilisé.

Protocole

NOTE: Ce protocole commence après on a isolé les mitochondries du muscle squelettique rouge. Les mitochondries ont été isolées comme décrit précédemment à partir de ~ 75 - 100 mg de muscle squelettique rouge ^13. Entre 5-10 pg / pl de protéine mitochondriale sera atteint de cette quantité de tissu en remettant en suspension le culot final dans mitochondriale ≤ 50 pl de tampon d'isolement pour les mitochondries (IBM) 2 (Voir Frisard et al ^13).

1. Configuration

1. Préparation des solutions mères de travail (tableau 1) et une solution de dosage mitochondrial (MAS) les mélanges (tableau 2) pour des analyses subséquentes.
   Note: La plupart de la préparation pour les essais peut être fait à l'avance que la plupart des stocks des solutions et MAS peuvent être stockés.
2. Hydratez une cartouche de dosage respirométrique dans 1 ml de solution d'étalonnage la nuit avant l'expérience dans un incubateur non-CO ₂ à 37 ° C.
3. Le jour de l'expérience, take hors stocks congelés (substrats et de modulateurs mitochondriales, MAS mix, MAS w / o BSA, tableau 1) et dégel dans les 37 ° C bain ou incubateur.
4. Préparer les solutions de substrat (Tableau 3) et les injections (tableau 5.4) et ajuster le pH si besoin (pH 7,4). Après le pH est ajusté, stocker sur de la glace.
5. Programme de la multi-puits machine de mesure de la consommation d'oxygène au mélange approprié, attendre, et les paramètres de mesure (voir tableau 6) et fond de l'étiquette et le groupe / état ​​puits en entrant d'abord le logiciel d'analyse, suivi par le mode "Standard".
   1. Entrez dans le forum "Invité" et cliquer sur "Test Wizard". Une fois dans le "dosage Wizard", cliquez sur "Protocole" pour changer mélange, attendre, et mesurer les paramètres. Identifier les puits de fond dans le cadre du "Retour. Correction "onglet et assurez-vous de mettre en évidence" Avez correction de fond ".
   2. Étiquette conditions en cliquant d'abord sur l'onglet "Groupes & étiquettes", puis l'onglet "Info Groupe". Après ces paramètres sont entrés, cliquez sur "Terminer", suivie par "Enregistrer le modèle".

2. La série de test

1. Chargez les solutions d'injection dans une cartouche de série de tests et de démarrer l'étalonnage en entrant d'abord le logiciel d'analyse, puis en entrant le mode "Standard". Entrez dans le forum "clients". Ouvrez le modèle enregistré dans l'étape 1.5 dans le lecteur "XF", sous l'onglet "Modèles". Une fois ouvert, cliquez sur "Démarrer" pour commencer l'étalonnage.
   Remarque: La cartouche de série de tests doit être entré dans la machine avec le coin entaillé en bas à gauche. Cela prend environ 30 min. Prenez soin d'injecter des solutions dans les ports appropriés. Injections dans le tableau 4-5 sont énumérés dans l'ordre de chargement.
2. Doucement, mais bien mélanger l'mitochondria de stock en agitant la solution avec une pipette de 200 pi, suivie par trituration doucement le bouillon avec une pointe de pipette 200 pi qui a eu son orifice creusé en coupant ~ 3 mm à l'extrémité de la pointe avec des ciseaux.
3. Effectuer un dosage de l'acide bicinchoninique (BCA) pour déterminer la concentration en protéine du stock mitochondrial.
4. En utilisant la concentration de titres acquis à partir de l'étape 2.3, remettre en suspension 10 ug de protéine mitochondriale / 200 pi du mélange de substrat succinate / de la roténone (tableau 3). Remettre en suspension 14 ug de protéine mitochondriale / 200 pi des mélanges de substrat restant (Cela doit être fait pour chaque mélange de substrat) (tableau 3). Placez tous mitochondrial protéines / substrat mélange sur de la glace.
   Remarque: La quantité optimale de protéines mitochondriales par puits pour chaque essai a été déterminée comme décrit précédemment ^neuf. Il a été déterminé que le pyruvate / malate, palmitoyl carnitine / malate, glutamate / malate und flux d'électrons dosages utilise 3,5 pg de protéine mitochondriale, tandis que le dosage succinate / roténone utilise 2,5 pg de protéine mitochondriale par puits. Par conséquent, le chercheur doit remettre en suspension assez protéine mitochondriale pour 4 répétitions dans cette étape car soit 2,5 pg ou 3,5 pg par 50 pi est chargé par puits (voir l'étape 2.6).
5. Mélanger les solutions mitochondries / substrat doucement, mais à fond en agitant la solution avec une pipette de 200 pi, suivie par trituration doucement le bouillon avec une pointe de pipette 200 pi qui a eu ~ 3 mm de son extrémité coupée.
6. Placer une plaque de culture de cellules sur de la glace et en triple exemplaire, la charge 50 ul / puits de chacun des mélanges mitochondries / substrat. Les développeurs de l'essai respirométrique de microplaques basé recommandons de laisser un minimum de deux (pas de mitochondries) puits à blanc, de préférence de chaque côté sur la plaque de culture cellulaire.
7. Faites tourner la plaque de culture cellulaire à 2000 g pendant 20 min à 4 ° C. Alors que la plaque est sépinglant, réchauffer les solutions de substrat dans un bain d'eau à 37 ° C.
8. Après l'essorage est terminé, charger soigneusement 450 ul de chaque solution de substrat au-dessus de ses puits respectifs (par exemple, charger le pyruvate / malate substrat dans les puits qui ont des mitochondries initialement remis en suspension dans cette solution de substrat). Veillez à charger la plaque à température ambiante. Remarque: puits vierges ne doivent être chargés avec 500 pi de substrat. Les puits à blanc désignés pour le dosage de flux d'électrons doivent être chargées avec le substrat de flux d'électrons (Pyruvate / Malate + FCCP), tandis que les puits à blanc couplé dosage peuvent être chargés avec un substrat de dosage de couplage.
   Remarque: Si vous effectuez les analyses de flux couplée et d'électrons sur la même plaque, le chercheur doit réaffecter puits de fond pour les dosages respectifs après la course de dosage est complète en utilisant la plate-forme "XF Reader" via l'onglet "Instrument". Une fois dans le paramètre "Instrument", cliquez sur le "Administration"onglet, suivi de "correction de fond". Hit "End Mode Configuration de l'instrument» lorsque vous avez terminé. En effet, la combinaison de l'ascorbate / TMPD peut consommer O _2, donc une correction de fond séparé est nécessaire pour chaque type d'essai.
9. Après la 450 pi de substrat sont ajoutés à chaque puits, voir la couche de mitochondries dans le puits afin d'assurer les mitochondries sont dispersées uniformément dans une seule monocouche (grossissement 20X [Voir Rogers ^9, Figure 4]). Wells qui ne semblent pas avoir une monocouche uniformément répartie peuvent être retirés post hoc.
10. Après avoir vérifié le respect mitochondrial, insérez la microplaque dans l'instrument de dosage respirométrique et commencer à exécuter le test en cliquant sur "OK".
    Remarque: Le calibrage de l'étape 2.1 doit être complète avant la course commence. Une fois que le chercheur clique sur "OK", la machine éjecte la plaque d'utilité qui a été utilisé pour l'étalonnage.
    1. Retirer la plaque d'utilité et placer la plaque de culture cellulaire qui contient les mitochondries sur le plateau. L'encoche bleu sur la plaque de culture cellulaire devrait être placé dans le coin inférieur gauche du plateau. Cliquez sur "continuer" pour lancer le cycle de dosage.
11. Après la course est terminée, éjectez la plaque de culture cellulaire et la cartouche en appuyant sur "Ejecter" sur l'écran.
    1. Une fois que la plaque est éjectée, retirez et jetez la plaque de culture cellulaire et la cartouche et cliquez sur «Continuer» sur l'écran. La course sera automatiquement enregistrée dans un fichier .xls dans le fichier "Data".
12. Ouvrez ce fichier et modifier l'affichage de "O2" à "OCR" en appuyant sur la flèche vers le bas sous le "Y1:« marqueur.
    1. Prochain changement "Middle Point" à "Point-to-Point Tarifs" dans le "Data Rate affiché comme:" option. Cliquez sur "OK" pour appliquer ces modifications.
13. Cliquez sur l'onglet "Mode groupe bien" en bas à gauche de l'écran pour puits de groupe de conditions similaires. Enfin, cliquez sur l'onglet "moyenne de l'échantillon / Standard Error" vers le milieu de l'écran, à gauche. Alternativement, ces commandes peuvent être configurés avant l'essai commence dans le réglage «Assistant Assay".
    Remarque: Chaque condition d'avoir une moyenne ± écart-type affiché pour chaque taux et chaque état. Il ya des mesures de débit prises par l'état (Etat 2 [Coupling] / State3u [Electron Débit] respiration suivie par quatre injections). Utilisez la moyenne de l'État 2 taux de la deuxième mesure, déterminer Etat 4o au point minimum après oligomycine injection, utiliser le point maximal de l'Etat 3 et 3U de l'Etat après l'ADP et l'injection FCCP, respectivement, et utiliser le point minimum pour antimycine A respiration induite pour les essais de couplage. Utilisez le point maximum pour pyruvate / malate induite État 3U respiration, utiliser le minimumpoint de départ pour la roténone induite respiration, utiliser le point maximum pour succinate induit 3U d'État respiration, et d'utiliser le point minimum pour antimycine Une respiration induite pour le dosage Electron Flow. Toutes les expériences ont été effectuées 3 fois et les données présentées sont les résultats d'un tracé représentant.

Résultats

Figure 1 représente les taux de consommation d'oxygène (OCR) pour la pyruvate / malate, succinate / roténone, palmitoyl carnitine / malate, et du glutamate / malate dosages (couplage dosages). Ces tracés d'analyse sont affichés sous forme de consommation d'oxygène Rate, ou OCR, en fonction du temps, sont correceted fond, et sont affichés sous forme de taux de point à point. Chaque panneau représente la consommation d'oxygène dans les différents Etats mitochondriales telles que décrites par Chance et Williams ^14. Le premier panneau représente la consommation de base d'oxygène, ou de l'État 2. Le deuxième panel, après l'injection de l'ADP, représente maximale couplée respiration, ou de l'État 3. Le troisième panel, après l'injection de oligomycine A (un inhibiteur du complexe V), représente la respiration due de fuite de protons, ou de l'État 4o. Le quatrième panneau, après l'injection de FCCP, représente maximale respiration découplé ou 3U de l'Etat. Enfin, le cinquième panneau, après injection de antimycine A, représente l'inhibition de la respiration oxydative. Notamment, all états mitochondriales ont écart minime. Cela est dû à un mélange complet du stock mitochondrial et les mélanges mitochondries / substrat, et la réalisation d'une monocouche de mitochondries après le spin de l'adhésion (étape 2.6). D'autre part, le chargement mitochondries inégales dans chaque puits et ne pas atteindre une monocouche des mitochondries dans le puits de la microplaque entraîne une augmentation de l'écart-type dans chaque Etat comme affiché dans la figure 2.

Les tracés de la figure 1 affichage plateaux pour chaque état ​​mitochondrial et pour chaque substrat. Le plateau atteint après deux cycles de mesure indique une bonne qualité mitochondrial et que les mitochondries restent collées à la même pendant toute la durée de l'essai. En outre, la réalisation des taux maximum plafonné peut être plus souhaitable car cela permet au chercheur de prendre l'OCR moyenne à ces états mitochondriales, réduisant ainsi biais qui peuvent se produireen sélectionnant arbitrairement un point.

La quantité de mitochondries par puits a été déterminée par des essais d'optimisation. La quantité optimale de mitochondries par puits devrait se traduire par État 2 taux entre 100-200 pmol / min / puits et l'état 3 taux <1,500 pmol / min / puits, puisque ces valeurs sont dans la gamme de détection d'oxygène dynamique de l'oxygène multi-puits machine de mesure de la consommation. Chargement trop de protéine mitochondriale par puits peut entraîner des OCR au-delà de la plage dynamique de l'instrument (figure 3A). La figure 3 illustre le chargement de 3,5 ug de protéine mitochondriale par puits (de traçage bleu) par rapport à une charge de 2,5 ug de protéine mitochondriale par puits (rouge le traçage) pour le dosage succinate / roténone. Chargement trop de protéine mitochondriale par puits peut aussi conduire à l'épuisement de l'oxygène dans le microchambre du puits, empêchant ainsi une mesure précise de l'OCR pour chaque mesure successive ⁹ (figure 3B </ strong>). Le point-à-point OCR est le taux de variation instantané de la reconnaissance optique de caractères. Si plat, l'OCR est stable / stable, mais si la baisse, alors il peut être un problème biologique ou technique. La forte baisse des OCR dans l'État de 3 et de l'État 3U respiration (figure 3A) est causée par les mitochondries épuiser les réserves d'oxygène avant la fin de la mesure (figure 3B).

La figure 4 représente en fonction du temps OCR pour le dosage de flux d'électrons. Le tracé est corrigée et affichée comme décrit pour la figure 1. Le premier panneau dans cet essai représente État 3U respiration sur pyruvate / malate via complexe I. Le deuxième panel, après l'injection de la roténone, représente l'inhibition du complexe I respiration médiation. Le troisième panel, après l'injection de succinate, représente substrat stimulé 3U de l'Etat avec des électrons entrant dans le ETC au Complexe II (complexe II de la respiration médiation). Le quatrième panneau, après l'injection de Antimycin A, représente l'inhibition de la respiration complexe III et donc totale. Enfin, le cinquième panneau, après l'injection de l'ascorbate / TMPD, représente Complexe IV respiration médiation. Comme pour les tracés de la figure 1, tous les États ont mitochondriales écart minime, et chaque taux a ou presque a atteint un plateau.

Figure 1. Accouplement dosages. (A) mM de pyruvate 10 / mM malate 5, (B) succinate 10 mM / 2 uM roténone, (C) 40 uM de palmitoyl carnitine / 1 mM malate, et (D) 10 mM de glutamate / 10 mM malate couplé mitochondriales tracés d'analyse de la respiration, comme déterminé par mesure de la consommation d'oxygène à puits multiples. Les valeurs sont exprimées sous forme de moyenne ± SD. Protéine mitochondriale chargé par puits était de 3,5 ng pour tous les essais, sauf succinate / roténone, qui utilise 2,5 pg de protéine mitochondriale par puits. Les données représentent n = 3 répétitions biologiques appariés. OCR = Taux de consommation d'oxygène; ADP = adénosine diphosphate; Oligo = oligomycine A; FCCP = carbonyle cyanure 4 - (trifluorométhoxy) phénylhydrazone; Anti-A = antimycine A; PYR = pyruvate; SUCC = succinate; ROT = roténone; PAL-C = palmitoyl carnitine; GLUT = glutamate. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. très variable pyruvate / Malate Assay. 10 mM pyruvate / 5 mM dosage malate Très variable causée par le mélange incomplètement mitochondries du stock mitochondrial dans le substrat / MAS mélange, conduisant ainsi à pro mitochondrial variablesprotéine chargement dans chaque puits. Protéine mitochondriale chargé par puits était de 3,5 pg. Les données représentent n = 3 répétitions biologiques appariés. OCR = Taux de consommation d'oxygène; ADP = adénosine diphosphate; Oligo = oligomycine A; FCCP = carbonyle cyanure 4 - (trifluorométhoxy) phénylhydrazone; Anti-A = antimycine A; PYR = pyruvate. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. La surcharge mitochondriale protéines pour le succinate / roténone Assay. (A) les taux de consommation d'oxygène en dehors de la plage dynamique de la machine de mesure de la consommation d'oxygène multi-puits causé par le chargement de 3,5 ug de protéine mitochondriale par puits (de traçage bleu) par rapport à une charge de 2,5 ug de protéine mitochondriale par puits (de traçage rouge). (B ) OxyGen tension proche de zéro et des injections suivantes ADP FCCP provoqué par un chargement excessif protéine mitochondriale (3,5 ug) par puits (tracé bleu), comparativement à charger une quantité optimale (2,5 ug) de la protéine mitochondriale par puits (de traçage rouge). Les données représentent n = 3 répétitions biologiques appariés par quantité de protéine mitochondriale. OCR = Taux de consommation d'oxygène; ADP = adénosine diphosphate; Oligo = oligomycine A; FCCP = carbonyle cyanure 4 - (trifluorométhoxy) phénylhydrazone; Anti-A = antimycine A; SUCC = succinate; ROT = roténone; ₂ O = oxygène; mm Hg = millimètres de mercure. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Essai de débit Electron. 5 mM de pyruvate / 1 mM + malate 4 uM FCCP, électrons ffaible dosage de respiration mitochondriale traçage tel que déterminé par la mesure de la consommation d'oxygène multi-puits. Les valeurs sont exprimées sous forme de moyenne ± SD. Protéine mitochondriale chargé par puits était de 3,5 pg. Les données représentent n = 3 répétitions biologiques appariés. OCR = Taux de consommation d'oxygène; Anti-A = antimycine A; Asc = ascorbate; TMPD = N, N, N ', N' tétraméthyl- p-phénylènediamine. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Réactif	Stock Concentration	MW	Volume final	Masse ajoutée	Commentaires / Description
	(M)	(g / mole)	(ml)	(g ou ml)
EGTA, pH 7,2	0,1	380,35	100 ml de 1M Tris base	3.801 g	Conserver à 4 ° C
HEPES	1	238,3	250 ml de Dih 2 O	59. 57 g	Conserver à 4 ° C
MgCl 2, hexahydrate	1	203,31	250 ml de Dih 2 O	50,82 g	Conserver à 4 ° C
Pyruvate pH 7,4	0,1	88.06 (Livré que 14.11 M solution)	40 ml de Dih 2 O	0.283 ml d'acide pyruvique	Assurez aliquotes de 1 ml et conserver à -20 ° C, effectuer frais toutes les deux semaines
Succinate pH 7,4	0,5	118.09	100 ml de Dih 2 O	9,4 g de sul'acide ccinic	Assurez aliquotes de 1 ml et conserver à -20 ° C
Malate, pH 7,4	0,5	134.09	100 ml d'éthanol à 95%	6,7 g d'acide malique	Assurez aliquotes de 200 pi et conserver à -20 ° C
TMPD	0,01	164.25	10 ml	0,0164 g	Faire 300 aliquotes et conserver à -20 ° C; Mélanger avec une quantité équimolaire d'ascorbate de garder TMPD réduite
Palmitoyl chlorure de L-carnitine	0,01	436,07	1,14 ml d'éthanol à 95%	0,005 g	Faire 40 aliquotes et conserver à -20 ° C
Un oligomycine	0,006	791,06	0,987 ml d'éthanol à 95%	0,005 g	Faire 20 aliquotes et conserver à -20 ° C
FCCP	0,01	254,17	3,9 ml d'éthanol à 95%	0,01 g	Faire 40 aliquotes et conserver à -20 ° C
Roténone	0,001	394,4	10 ml d'éthanol à 95%	0,0039 g	Conserver à -20 ° C
Antimycine A	0,005	548,63	9,12 ml d'éthanol à 95%	0,025 g	Conserver à -20 ° C
K + ADP	0,5	501,32	3,9 ml de Dih 2 O	1,0 g	Conserver à -20 ° C
L'acide malique, pH 7,4	0,5	134.09	40 ml	2,68 g	Assurez aliquotes de 200 pi et conserver à -20 ° C

1. Image Solutions

Réactif	Stock Concentration	Masse ajoutée	Molarité finale / Pourcentage
	(M)	(g ou ml)
Saccharose	-	11,98 g	70 mM
Mannitol	-	20.04 g	220 mm
Phosphate de potassium monobasique	-	0,34 g	5 mM
MgCl 2, hexahydrate	1	2,5 ml	5 mM
HEPES	1	1,0 ml	2 mM
EGTA	0,1	5,0 ml	1 mM
Essentiellement Fatty Acid Free-BSA	-	1,0 g	0,20%

. Tableau 2. MAS Mix pH 7,4, 500 ml: 25 ml aliquotes et conserver à -20 ºC * Note: Exclure BSA pour MAS mélange utilisé pour les injections de dosage.

Substrat moyen	Concentration finale	Montant de stock (ul)	Montant du MAS * (ml)
Pyruvate / Malate	10 mM / 5 mM	Pyruvate: 1000	9
		Malate: 100
Succicinate / roténone	10 mm / 2 pM	Succinate: 200	10
		Roténone 20
* Pyruvate / Malate + FCCP	5 mM / 1 mM / 4 pM	Pyruvate: 500	10
		FCCP: 4
		Malate: 20
Palmitoyl L-carnitine / Malate	40 uM / 1 mM	Palmitoylcarnitine: 40 Malate: 20	10
Glutamate / malate	10 mM / 10 mM	Glutamate: 400	10
		Malate: 200

Tableau 3. Solutions Substrat pH 7.4: Faire fraîches le jour de l'expérience. * Electron solution d'analyse de flux.

Injection moyen	Concentration	Montant de stock (ul)	Montant de la MAS (ml)	Montant injecté dans la cartouche	Concentration finale
					(Après injecté dans la plaque)
ADP	50 mM	300 ul	3	50 ul	5,0 mm
Un oligomycine	20 pM	10 ul	3	55 pi	2,0 pM
FCCP	40 pM	12 pi	3	60 ul	4,0 pm
Antimycine A	40 pM	24 pi	3	65 pi	4,0 pm

T4. capables injections pour les dosages couplés de pH 7,4:. Assurez frais le jour de l'expérience. * Des analyses de couplage comprennent (mais ne sont pas limités à) un pyruvate / malate, le succinate / roténone, palmitoyl carnitine / malate, glutamate et / malate.

Injection moyen	Concentration	Montant de stock (g ou ul)	Montant de la MAS (ml)	Montant injecté dans la cartouche	Concentration finale (après injecté dans la plaque)
Roténone	20 pM	60 ul	3	50 ul	2,0 pM
Succinate	50 mM	300 ul	3	55 pi	5,0 mm
Antimycine A	40 pM	24 μ; l	3	60 ul	4,0 pm
TMPD / Ascorabte	1 mM, 100 mM	TMPD: 300 ul	3	65 pi	100 uM, 10 mM
		Ascorbate: 0,059 g

Tableau 5. Les injections de flux d'électrons dosage de pH 7,4. Faire frais le jour de l'expérience

Commande	Temps (min)	Nombre de cycles
Étalonner
Attendez	10 min (pour permettre à la plaque pour réchauffer de l'étape de l'adhésion)
Mélanger	1 min	2
MoiAsure	2 min
Injecter A
Mélanger	1 min	2
Mesure	2 min
Injecter B
Mélanger	1 min	2
Mesure	2 min
Injecter C
Mélanger	1 min	2
Mesure	2 min
Injecter D
Mélanger	1 min	2
Mesure	2 min

Tableau 6. Instrument Protocole Exécuter.

Discussion

Les méthodes présentées dans cet article fournissent des instructions étape-par-étape pour la performance d'une collection de microplaques basé dosages respirométriques utilisant mitochondries isolées de 75 à 100 mg de muscle squelettique de souris. Ces analyses peuvent être effectuées avec une grande précision comme en témoigne l'écart type étanche entre des puits en triple. Surtout, ces tests permettent de repérer des respirométriques où des anomalies et / ou adaptations peuvent se produire dans l'ETC, cycle de Krebs, voie β-oxydation, les transporteurs de substrat, etc., dans un modèle animal couramment utilisé.

Il est important de souligner la justification de l'utilisation de divers carburants et les inhibiteurs utilisés dans ce protocole. Le pyruvate / malate et du glutamate / malate respirométriques dosages permettent l'évaluation du complexe I respiration médiation, ainsi que l'évaluation de leurs transporteurs respectifs, et dans le cas du glutamate, la désaminase ^15. En variante, la combinaison desuccinate / roténone permet l'évaluation des flux respiratoire mitochondriale travers Complexe II de l'ETC depuis roténone inhibe complexe I et succinate fournit des électrons au complexe II via la réduction de la flavine adénine dinucléotide (FADH ₂₎ ^15. Ces essais fournissent des informations spécifiques de substrat à l'efficacité de couplage et la respiration maximale. Le dosage de flux d'électrons est unique en ce que la combinaison des substrats et inhibiteurs permet d'évaluer de multiples complexes pendant flux respiratoire mitochondriale ^9. Le mélange de substrat de départ de pyruvate / malate + FCCP permet d'évaluer de respiration maximale entraîné par Complexe I, tandis que l'injection de la roténone suivie par succinate permet l'évaluation de respiration maximale entraîné par complexe II. L'injection d'antimycine A, un inhibiteur du complexe III, suivie de l'injection d'ascorbate / TMPD permettre à l'évaluation de la respiration entraînée par Complexe IV depuis la Ascorbate / TMPD est undonneur d'électrons à Cytochrome C / Complexe IV. Bien qu'aucune information sur l'efficacité de couplage est obtenu, la méthode est idéale pour les tailles d'échantillons très petits qui empêchent l'exécution de plusieurs substrats indépendamment. Enfin, l'utilisation de palmitoyl carnitine / malate permet l'évaluation de la coordination entre les β-oxydation et l'ETC depuis l'équivalent réduire produite à partir de l'oxydation de l'acide palmitique (β-oxydation) alimentation dans l'ETC par l'électron transfert flavoprotéine ^15. Il est à noter que les analyses de flux de couplage et d'électrons peuvent également être utilisés en tandem pour identifier des changements dans la fonction mitochondriale en raison d'une intervention (traitement de la toxicomanie, de la manipulation génétique).

La grande précision atteinte pour ces dosages est principalement due à un mélange intime de la mitochondrie, que ce soit avant la détermination des protéines, ou des solutions de substrat. Dans cette optique, une fois que les mitochondries est resuspendend dans le substrat de solutions, il est essentiel de mélanger cette solution soigneusement avant de charger la plaque de culture cellulaire comme décrit dans l'étape 2.2 avec un orifice de l'embout de pipette élargie. Le défaut de mélanger les mitochondries soigneusement mènera à une grande variation dans le dosage. En outre, à l'aide d'une pipette de orifice étroit permettra de créer des forces de cisaillement tout en mélangeant les mitochondries et augmente le potentiel d'endommager les membranes mitochondriales et la libération de cytochrome C. L'étape de l'adhésion (2.7) est également une étape critique dans ce protocole. Échec pour faire tourner la plaque de culture cellulaire chargée long / assez vite se traduira par l'adhésion incomplète de la mitochondrie au bien, entraînant ainsi une plus grande variabilité entre les puits et les mesures.

Le protocole décrit a été optimisé pour inclure: le chargement d'une quantité optimale de protéine mitochondriale par puits, en utilisant les concentrations / méthodes de préparation correcte de faire des actions et des solutions substrat, la modification de la série de tests pour assurer mitochondrial pla de l'Etatteaux, et le mélange approprié de les mitochondriales actions et mitochondrial / substrat mélanges. Avant ces efforts d'optimisation, les auteurs ont rencontré des pièges dans la série de tests. Ce qui suit décrit les méthodes / des modifications qui ont été utiles dans l'optimisation de ce protocole dépannage. En ce qui concerne le chargement optimal, chargement trop peu de mitochondries ne seront pas provoquer une réponse robuste, tout en chargeant trop de mitochondries va épuiser l'oxygène dans la microchambre et conduire à des mesures inexactes. Rogers et al ⁹ fournit des exemples de détermination des montants de chargement optimales de mitochondries par puits des microplaques basé dosages respirométriques. Plus souvent, trop de mitochondries est chargé par puits comme en témoignent les taux sur l'état 2 100-200 pmol / min / puits et l'état 3 taux> 1500 pmol / min / puits. Si au cours de chargement se produit, effectuer une expérience avec des concentrations variables de la protéine mitochondriale (par exemple, entre 1 -. 10 ug) de susciter OCR dans le r dynamiqueange de la machine de mesure de la consommation d'oxygène. Préparation et en utilisant les bonnes concentrations de substrats et des stocks est d'une importance capitale. Toujours utiliser la forme acide de substrats / injections et ajuster le pH avec de l'hydroxyde de potassium ou de HCl; tampons de sodium / solutions ne sont pas recommandés. En outre, des substrats remet en suspension / stocks dans le DMSO ou 100% d'éthanol se traduira par l'échec de mesure ou d'erreurs. Veillez à utiliser 95% d'éthanol où noté. Il est commun pour palmitoyl carnitine pour précipiter hors de l'éthanol à 95% après décongélation du stock congelé, provoquant ainsi une grande variabilité. Assurez-vous de réchauffer le palmitoyl carnitine stock et vortex bien avant de l'utiliser. En outre, un pyruvate / résultat d'analyse malate très variable peut être dû à la pyruvate de stock être> 2 semaines. Soyez sûr de refaire aliquotes congelées de pyruvate toutes les 2 semaines. La série de tests a été modifié à des mesures de 2 minutes pour assurer plateaux mitochondriales de l'Etat. Si l'observation de l'épuisement des ADP est souhaitée, le chercheur peutprolonger la durée de la mesure dans l'onglet "Protocole" dans le cadre du forum "Assistant Assay". Enfin, une grande variabilité se produit lorsque le stock et les mitochondries mitochondrial ainsi substrat solutions ne sont pas entièrement homogénéisés avant le chargement. Si la variabilité entre les puits est élevé après la série de tests, assurez-vous de mélanger complètement la solution de substrat avant l'expérience suivante. Jamais vortex les solutions mitochondries / substrat, plutôt remuer, purée, et triturer doucement avec un orifice de l'embout de pipette élargie.

Il ya quelques limites de cette technique qui sont à noter. Tout d'abord, le nombre de puits sur la plaque de culture cellulaire utilisé pour ces essais est relativement faible (par exemple., 24 puits et au moins deux désignée pour puits à blanc). Si l'on souhaite effectuer toutes 5 de ces essais sur une plaque, le chercheur est seulement capable d'examiner les réponses d'une souris à la fois. Toutefois, il convient de noter que 96 les instruments et sont disponibles pour higher débit. Deuxièmement, il ya des points forts et des faiblesses inhérentes à l'évaluation de la dysfonction mitochondriale dans les mitochondries isolées par rapport à ¹ dans des cellules intactes. Certaines faiblesses comprennent ayant moins pertinence physiologique par rapport à des cellules intactes et induisant des artefacts provenant du processus d'isolement. Enfin, le succès de cette méthode est tributaire de la qualité du processus d'isolement mitochondrial.

Bien que certains de ces essais ont été soit développé dans les différents systèmes ou ont été validées dans d'autres modèles animaux, les méthodes présentées ici sont le premier à synthétiser tous les tests mentionnés ci-dessus pour l'utilisation optimale dans un environnement multi-bien la machine de mesure de la consommation d'oxygène en utilisant la souris Muscle squelettique. Surtout, tous ces 5 analyses peuvent être effectuées avec la quantité de mitochondries isolées à partir de ~ 75 - 100 mg de muscle squelettique de souris, fournissant ainsi un débit élevé de matière minimale. D'une grande importance, la capacité de multi-puitstechnologies de consommation d'oxygène pour effectuer des essais avec des quantités minimales de mitochondries, combiné avec un procédé d'isolation optimisée, permet au chercheur d'effectuer une multitude d'autres expériences avec le reste du tissu de muscle squelettique (par exemple., des Western blots, RT-PCR, des essais enzymatiques, etc.), ce qui est souvent une lutte avec ce modèle animal.

En conclusion, les méthodes présentées ici fournissent des instructions étape-par-étape pour la performance d'une collection de microplaques basé dosages respirométriques utilisant des quantités minimales de muscle squelettique de souris. Surtout, les méthodes présentées nécessitent des quantités minimes de tissus et les mitochondries. Une fois maîtrisé, les techniques décrites ici permettront aux chercheurs de déterminer un mécanisme potentiel d'un produit composé ou d'un gène sur la consommation mitochondriale d'oxygène dans un modèle animal couramment utilisé.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Saccharose	Sigma Aldrich	S7903	Stocker chez RT
D-Mannitol	Sigma Aldrich	63559	Stocker chez RT
Phosphate de potassium monobasique, minimum 99,0	Sigma Aldrich	P5379	Stocker chez RT
Chlorure de magnésium hexahydraté, réactif ACS, 99,0-102,0	Sigma Aldrich	M9272	chez RT
HEPES titrage	minimum 99,5 %Magasin Sigma Aldrich	H3375	chez RT
EGTA	Magasin Sigma Aldrich	E4378	chez RT
Essentially Fatty  ;	Sigma Aldrich	A6003	Magasin à 4 ° ; Sans
acide C - Acide pyruvique BSA
, 98 %	Sigma Aldrich	107360	Magasin à 4 ° ; c
Acide succinique	Sigma Aldrich	S9512	Magasin chez RT
L(-) Acide malique, BioXtra, &ge ; 95 %	Sigma Aldrich	M6413	Stocker chez RT
Acide L-glutamique	Sigma Aldrich	G1251	Stocker chez RT
N,N,N&prime ;,N&prime ;-Tétraméthyl-p-phénylènediamine	Sigma Aldrich	T7394	Stocker chez RT
99 %, poudre [TMPD]
Palmitoyl L-carnitine chloride	Sigma Aldrich	P1645	Stocker à -20 ° ; C
Oligomycine A, &ge ; 95 % (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	Stocker à -20 ° ; C
Cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)	Sigma Aldrich	C2920	Stocker à 2 - 8 ° ; C
phénylhydrazone
&ge ; 98 % (TLC), poudre [FCCP]
Antimycine A de streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674	Magasin à -20 ° ; C
Adénosine 5&prime ;-diphosphate monopotassique déshydraté [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	Conserver à -20 ° ; C
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875	Magasin chez RT
Pierce&trade ; Kit de dosage des protéines BCA  ;	Thermo Scientific	23225	N/A