Perturbation Anti-virulente de biofilms pathogènes en utilisant Engineered Quorum-trempe Lactonases

Résumé

Les enzymes d’extinction du quorum sont des options anti-virulentes et antibactériennes qui peuvent atténuer la pathogenèse sans risque d’encourir une résistance, en empêchant l’expression de facteurs de virulence et de gènes associés à la résistance aux antibiotiques et à la formation de biofilms. Dans cette étude, nous rapportons une méthode qui démontre l’efficacité des enzymes d’extinction du quorum dans la perturbation du biofilm bactérien.

Résumé

L’émergence rapide de bactéries multirésistantes a accéléré le besoin de nouvelles approches thérapeutiques pour contrer les infections potentiellement mortelles. La persistance d’une infection bactérienne est souvent associée à la formation d’un biofilm médié par la détection du quorum. Ainsi, la perturbation de ce circuit de signalisation présente une stratégie anti-virulence intéressante. Il a été rapporté que les lactonases d’extinction du quorum sont des perturbateurs efficaces des circuits de détection du quorum. Cependant, il y a eu très peu de rapports sur l’utilisation efficace de ces enzymes pour perturber la formation du biofilm bactérien. Ce protocole décrit une méthode pour perturber la formation de biofilm dans une souche S1 d’A. baumannii cliniquement pertinente grâce à l’utilisation d’une lactonase artificielle qui éteint le quorum. Acinetobacter baumannii est un agent pathogène humain majeur impliqué dans de graves infections nosocomiales à l’échelle mondiale, et sa virulence est attribuée principalement à la ténacité de son biofilm. Le traitement à la lactonase a permis de réduire considérablement le biofilm S1 d’A. baumannii. Cette étude a également montré la possibilité d’utiliser des enzymes modifiées d’extinction du quorum dans le traitement futur des maladies bactériennes induites par le biofilm. Enfin, la méthode peut être utilisée pour évaluer la compétence d’enzymes prometteuses d’extinction du quorum.

Introduction

Les options de traitement pour les maladies infectieuses ont été compliquées par l'augmentation rapide des bactéries multi-résistantes qui sont immunisées à une large gamme de médicaments antibiotiques ^1. Avec une morbidité élevée et taux de mortalité par bactéries médiation infections résistantes, il est nécessaire d'intensifier les processus de développement de médicaments et / ou explorer de meilleures solutions anti-bactériennes pour améliorer les options thérapeutiques. Dernièrement, l'approche anti-virulence suscite de l'intérêt étant donné son potentiel dans la prévention de la virulence par des méthodes non-bactéricides, donc d'atténuer les risques de mécanismes de résistance ^2.

Quorum-sensing est un «interrupteur principal» dans la virulence bactérienne et la perturbation de ce phénomène de signalisation est une méthode anti-virulence prometteur contre la pathogenèse ^3. Le début de la virulence nécessite l'accumulation de molécules de quorum dans le milieu extracellulaire après une densité de population bactérienne critique est atteinte. Comme quomolécules diffusent de rhum de nouveau dans la matrice intracellulaire, la liaison avec leurs récepteurs apparentés conduit à l'activation de facteurs de virulence ainsi que des gènes associés à la résistance aux antibiotiques et la formation de biofilm ^4. En général, la perturbation quorum-sensing implique l'inhibition de la molécule quorum et interaction avec le récepteur sans affecter les principales voies métaboliques. Par conséquent, il n'a pas de conséquence directe sur la croissance cellulaire. Depuis remise en forme ne soit pas compromise, il ya une pression de sélection minimale pour les bactéries d'évoluer et d'acquérir une résistance contre ces traitements ^5. En outre, la perturbation quorum-sensing peut interférer avec les mécanismes de protection bactériennes intrinsèques, comme dans le cas de la formation de biofilm, qui offre une protection contre les agents anti-bactériens et des ordinateurs des réponses immunitaires.

On estime que 99% des microbes sur Terre existe dans les matrices de biofilm comme complexes, conférant des avantages cruciaux de survie pour les micro-organismes vivant dans les estructures ESE ^6. Plus important encore, la formation de ces domaines sessiles est la cause de la plupart des infections persistantes et chroniques nosocomiales ^7. Acinetobacter baumannii est l'un des principaux agents pathogènes humains qui est associée à des infections mondiales nosocomiales et sa virulence est largement attribuable à quorum-sensing médiée par la formation de biofilm ^8. Trempe de quorum-enzymes ont été utilisés avec succès dans quorum perturber la transduction du signal à médiation par le ciblage d'un groupe de composés connus comme les homosérine lactones de N (AHL) qui sont produites par des bactéries Gram-négatives ^9. Plusieurs études ont également étendu à l'utilisation de ces enzymes pour bloquer la pathogenèse bactérienne à travers la réduction du nombre d'expression de facteur de virulence et cellulaires dans les biofilms ^10,11. Malheureusement, il existe toujours un manque de démonstration palpable de l'utilisation effective des enzymes de quorum extinction contre la formation de biofilm par des pathogènes bactériens. lere ont eu des tentatives d'utiliser des inhibiteurs de quorum (analogues AHL), au lieu des enzymes quorum-trempe, de perturber A. baumannii ¹² la formation de biofilm. Bien que cette méthode d'utilisation des inhibiteurs de petites molécules est une approche valable, le maintien de sa biodisponibilité dans les utilisations traductionnelles peut être un défi. Au contraire, l'utilisation d'enzymes de quorum-trempe catalytiques pourrait contourner la question de la biodisponibilité des enzymes se prêtent davantage à l'immobilisation sur des surfaces de dispositifs biomédicaux pour les effets thérapeutiques.

Ici, nous décrivons une évaluation des effets de l'ingénierie lactonases de quorum-trempe de Geobacillus kaustophilus (GKL) ¹³ sur la formation d'un biofilm bactérien, en utilisant une coloration au cristal violet et de microscopie confocale à balayage laser (CLSM). Cette étude est la première démonstration réussie de perturbation du biofilm dans un A. cliniquement pertinente baumannii souche S1 utilisant des enzymes quorum-trempe. Les procédés décritsdans cette étude sont utiles pour évaluer l'efficacité d'autres enzymes de quorum-trempe dans les efforts de développement thérapeutique ultérieurs contre les bactéries à Gram négatif pathogènes.

Protocole

1. Cristal Violet quantification de formation d'un biofilm dans A. baumannii S1

1. Développer une culture de 5 ml de A. baumannii S1 dans un bouillon Lysogénie (LB) (tryptone 10 g / L, extrait de levure 5 g / L) à 30 ° C dans un incubateur sous agitation (220 rpm) pendant 16 heures.
2. Ajustez la culture de A. baumannii S1 à une DO ₆₀₀ de 0,8 souhaitée. Utilisation d'une plaque de 96 puits, inoculer la culture bactérienne (dilution 1: 100) dans LB frais contenant 10 ul d'enzyme purifiée GKL (40 mg / ml); volume final de la nouvelle culture est de 100 pi.
3. Préparer une culture de contrôle ainsi; ce ne sera pas contenir toute enzyme. Répétez les mêmes conditions pour obtenir le nombre désiré de répétitions.
4. Recouvrir la plaque avec un couvercle et le placer dans un récipient de 10 litres en plastique scellé. Incuber la plaque à 30 ° C pendant 3 heures avant de retirer délicatement les médias.
5. Ajouter un autre 100 pi de milieu LB frais pour le bien et incuber la plaque pendant 21 heures à 30 ° C.
6. Après la deuxième période d'incubation, retirer délicatement tous les médias. Laver la cellule des bactéries planctoniques avec 200 pi d'eau stérile. Assurez-vous qu'il n'y a qu'une perturbation minimale aux cellules pendant le lavage.
7. Ajouter 100 ul de solution de cristal violet à 1% dans chaque puits et incuber pendant 15 min à température ambiante. Retirer la solution de cristal violet par lavage du puits avec 200 ul d'eau stérile. Répétez le lavage pour deux fois plus.
8. Ajouter 100 pi d'acide acétique à 33% à chaque puits et incuber pendant 15 min en agitant doucement; cela va dissoudre le colorant.
9. Quantifier la quantité de biofilm formé par mesure de l'absorbance de cristal violet à 600 nm. La quantité de violet cristallisé est proportionnelle à la quantité de biofilm formé.

2. confocale à balayage laser de A. baumannii S1 biofilm

1. Développer une culture de 5 ml de A. baumannii S1 dans du LB à 30 ° C dans un incubateur à agitation (220 rpm) pendant 16 heures.
2. Un dseulement la culture de A. baumannii S1 à une DO ₆₀₀ de 0,8 souhaitée. L'utilisation d'un 35 mm à fond de verre μ-Dish, inoculer la culture bactérienne (dilution 1: 100) dans LB frais contenant 30 ul d'enzyme purifiée GKL (40 mg / ml); volume final de la nouvelle culture est de 1 ml.
3. Couvrir le μ-Dish avec un couvercle et le placer dans un récipient de 10 litres en plastique scellé. Incuber le μ-Dish à 30 ° C pendant 3 heures avant de retirer délicatement les médias. Ajouter 30 ul d'enzyme GKL purifiée et du milieu frais, le ramenant à un volume total de 1 ml. Incuber pendant un autre 21 heures à 30 ° C.
4. Répétez l'étape 2.3 et incuber le μ-Dish pour un autre 24 heures à 30 ° C. Puis, retirez délicatement les médias.
5. Ajouter 500 pl de 5 pg / ml Alex Fluo 488 conjugué à l'agglutinine de germe de blé (WGA) dissous dans de la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) pour la μ-vaisselle et incuber à 37 ° C pendant 30 min; cela va tacher le biofilm formé. Retirer la solution de coloration et laver til u-vaisselle avec 2 ml de HBSS. Répétez l'étape de lavage une fois de plus.
6. Ajouter 500 ul de 3,7% de formaldéhyde dissoute dans du HBSS et incuber à 37 ° C pendant 30 min; cela va résoudre le biofilm sur le μ-Dish. Laver le μ-Dish fois avec 2 ml de HBSS puis retirez complètement la solution. Le μ-Dish fixe avec biofilm peut être stocké dans l'obscurité à 4 ° C avant l'imagerie de CLSM.
7. Pour l'imagerie et l'analyse CLSM, utiliser 63 fois grossissement pour générer 97 piles par image avec un intervalle de 0,21 um par pile.

Résultats

Dans l'expérience de quantification de cristal violet, deux enzymes quorum-trempe ont été utilisés pour démontrer la faisabilité à perturber la formation de biofilm: type sauvage GKL et une amélioration de double mutant GKL (E101G / de R230C). Les deux enzymes se sont révélées manifester une activité lactonase contre-hydroxy-3-décanoyle L-homosérine lactone (3-OH-C -HSL _10), la principale molécule quorum utilisée par A. baumannii S1 ^14. Pour évaluation vala...

Discussion

Dans les deux séries d'expériences, A. baumannii S1 a été cultivée dans du milieu LB sans NaCl comme une concentration élevée de sel peut réduire la quantité de biofilm formé par les bactéries ^15. La présence d'un tel artefact pourrait sous-estimer la quantité de biofilm formé, ainsi que les effets des enzymes de quorum-trempe à travers différentes conditions de traitement. L'utilisation d'une enzyme catalytiquement inactif est important en tant que témoin négatif pour élimin...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tryptone  ;	BD	211705
Extrait de levure	BD	212750
Plaque à 96 puits	Costar	3596
Cristal Violet	Sigma-Aldrich	C6158
Acide acétique	Lab-Scan	PLA00654X	Attention : Inflammable
&mu ;-Dish	Ibidi	80136
Alex Fluo 488-conjugué WGA	Invitrogen	W11261
Hank' solution saline équilibrée	Invitrogen	141475095
Formaldéhyde	Sigma-Aldrich	F8775	Attention : Corrosif  ;
Synergy HT Lecteur de microplaques	BioTek
1X-81 Microscope à fluorescence inversée	Olympus