Article de méthode

De Constructs à cristaux - Vers Structure Détermination de β-cylindre externe protéines membranaires

DOI :

10.3791/53245

⸱

4 juillet 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Markey Center for Structural Biology, Purdue University, 2National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), National Institutes of Health, 3National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
β protéines de membrane externe (OMP) remplissent de nombreuses fonctions au sein des membranes externes des bactéries à Gram négatif, des mitochondries et des chloroplastes. Ici, nous espérons pallier un goulot d’étranglement connu dans les études structurales en présentant des protocoles pour la production d’OMP à β-baril en quantités suffisantes pour la détermination de la structure par cristallographie aux rayons X ou spectroscopie RMN.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les protéines membranaires remplissent des fonctions importantes dans les cellules telles que le transport des nutriments, la motilité, la signalisation, la survie et la virulence, mais ne constituent que ~1 % des structures connues. Il existe deux types de protéines membranaires, α-hélicoïdale et β-baril. Alors que les protéines membranaires α-hélicoïdales peuvent être trouvées dans presque toutes les membranes cellulaires, les protéines membranaires à β-baril ne peuvent être trouvées que dans les membranes externes des mitochondries, des chloroplastes et des bactéries à Gram négatif. Un goulot d’étranglement courant dans les études structurelles des protéines membranaires en général est d’obtenir suffisamment d’échantillon pur pour l’analyse. Dans l’espoir d’aider ceux qui s’intéressent à résoudre la structure de leur protéine de membrane externe (OMP) à β-baril préférée, des protocoles généraux sont présentés pour la production d’OMP cibles à β-baril à des niveaux utiles pour la détermination de la structure par cristallographie aux rayons X et/ou spectroscopie RMN. Ici, nous décrivons la conception de constructions pour l’expression native et pour l’expression dans les corps d’inclusion, la purification à l’aide d’un marqueur d’affinité et la cristallisation à l’aide de techniques de criblage au détergent, de bicelle et de phase cubique lipidique. Ces protocoles ont été testés et se sont avérés efficaces pour la plupart des OMP à partir de bactéries à Gram négatif ; Cependant, il existe certaines cibles, en particulier pour les mitochondries et les chloroplastes, qui peuvent nécessiter d’autres méthodes d’expression et de purification. En tant que telles, les méthodes ici devraient être applicables à la plupart des projets qui impliquent des OMP à partir de bactéries à Gram négatif, mais les niveaux d’expression et la quantité d’échantillon purifié varieront en fonction de l’OMP cible.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

β-baril OMP ne peuvent être trouvés dans la membrane externe des mitochondries, des chloroplastes, et des bactéries Gram-négatives 1-3. Bien qu'elles remplissent des fonctions similaires comme les protéines alpha-hélicoïdale, ils ont un pli très différent consistant en un domaine β-baril membrane-embedded centrale allant de 8-26 brins ß antiparallèles avec chaque brin étant relié intimement aux deux brins voisins (figures 1 et 2). Les premiers et derniers brins du domaine β-baril puis interagissent les uns avec les autres, presque exclusivement d'une manière anti-parallèle (à l'exception des VDAC mitochondrial), pour fermer et sceller le domaine β-canon de la membrane entourant. Tous les OMP β-baril ont des boucles extracellulaires de faire varier la séquence et la longueur, qui jouent un rôle important dans les interactions ligand et / ou des contacts protéine-protéine, avec ces boucles étant parfois aussi grande que 75 résidus, tels que trouvés dans la liaison de Neisseria transferrine proUne protéine (TbpA) 4. β-baril OMP peuvent également avoir des extensions périplasmiques N-terminales ou C-terminales qui servent de domaines supplémentaire pour but fonctionnel de la protéine (par exemple BamA 5-7, FimD 8,9, FADL 10). Alors que de nombreux types de OMP β-baril existent 11, deux des types les plus courants sont décrits ci - dessous à titre d' exemples pour ceux qui sont moins familiers avec le terrain, (1) transporteurs TonB-dépendants et (2) autotransporters.

Transporteurs TonB-dépendants (par exemple, FEPA, TbpA, BTub, Cir, etc.) sont essentiels pour l' importation d'éléments nutritifs et contiennent un domaine de prise N-terminal constitué de ~ 150 résidus qui se trouve replié à l' intérieur d' un 22 brin β- C-terminal baril domaine incorporé dans la membrane externe 12 (figure 3). Bien que ce bouchon empêche domaine substrat de passer librement à travers le domaine du canon, la liaison au substrat induit un changement conformationnel dans le domaine du bouchon thà conduit à la formation de pores (soit par prise réarrangement ou partielle complète d'éjection / de la fiche) qui peut alors faciliter le transport du substrat à travers la membrane externe dans le périplasme. Les transporteurs TonB-dépendants sont particulièrement importantes pour la survie de certaines souches pathogènes de bactéries Gram-négatives telles que Neisseria meningitidis qui ont évolué à des transporteurs spécialisés qui détournent des nutriments tels que le fer directement à partir de protéines de l' hôte humain 4,13,14.

Autotransporteurs appartiennent au système de sécrétion de type V de bactéries Gram-négatives et sont OMP tonneau ß qui se composent d'un domaine β-canon (typiquement 12 brins comme avec ESTA et ESPP) et un domaine passager qui est soit sécrétées ou présentés à la surface de la cellule 15,16 (figure 3). Ces OMP β-baril servent souvent un rôle important dans la survie des cellules et la virulence avec le domaine passager servant soit comme une protéase, une adhésine, et / ou d'autres effecteur qui médie la pathogenèse.

méthodes structurelles telles que la cristallographie aux rayons X, spectroscopie RMN, et la microscopie électronique (EM) nous permettent de déterminer des modèles pour les OMP à résolution atomique qui peut à son tour être utilisés pour déchiffrer exactement comment ils fonctionnent dans la membrane externe. Cette information précieuse peut alors être utilisé pour le développement de vaccins et de médicaments le cas échéant. Par exemple, la liaison de la transferrine protéine A (TbpA) se trouve sur la surface de Neisseria et est nécessaire pour la pathogenèse , car il se lie directement la transferrine humaine, puis extrait et importe le fer pour sa propre survie. Sans TbpA, Neisseria ne peut pas récupérer le fer de l'hôte humain et sont rendus non pathogènes. Après que la structure cristalline de la transferrine humaine lié à TbpA 4 a été résolu, il est devenu beaucoup plus clair comment les deux protéines associées, quelles régions de TbpA médiés l'interaction, ce que les résidus étaient importants pour l' extraction de fer par TbpA etcomment on peut développer des thérapeutiques contre Neisseria ciblant TbpA. Par conséquent, étant donné l'importance des OMP β-baril dans les bactéries Gram-négatives pour la survie et la pathogenèse, ainsi que dans les mitochondries et la fonction chloroplaste, et la nécessité d'informations structurelles supplémentaires sur cette classe unique de protéines membranaires et les systèmes dans lesquels ils fonctionnent , les protocoles généraux sont présentés dans le but général d'exprimer et de purifier les OMP cibles à des niveaux élevés pour la caractérisation par des méthodes structurelles.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Clonage et expression

Remarque: Pour permettre des études structurales, des quantités suffisantes de protéine hautement purifiée doivent être préparés, et cela commence généralement avec le clonage et la surexpression de la protéine cible β-baril membrane externe (OMP) dans E. coli (figure 4). À ce jour, toutes les structures OMP β-baril, y compris les structures de VDAC mitochondrial, ont été dérivées de la protéine exprimée par des bactéries 11. Ici, les protocoles généraux sont présentés pour le clonage et l' expression OMP β-baril pour (1) expression native directement dans les membranes bactériennes et (2) l' expression en inclusions organismes pour in vitro repliement 17.

  1. Concevoir une construction d'expression
    1. Obtenir ou acheter le gène cible de OMP de codon optimisé.
    2. Achat ou d'obtenir un vecteur d'expression de T7 (i) contenant une séquence signal de localisation périplasmique, un 6x-histidine tag N-terminal,et un site de protease TEV 4,18,19 pour l' expression in vivo à la membrane ou (ii) sans séquence de signal de localisation périplasmique pour l' expression de corps d'inclusion pour le repliement in vitro.
      Remarque: Une protéase N-terminal clivable tag 6x ou 10x-histidine fournirait une méthode simple pour la purification. Comme avec les protéines solubles, modifier le choix de marqueur d'affinité (histidine, Strep, TPS, etc.), la position de l'étiquette d'affinité, et l'inclusion d'un site de protease (TEV, entérokinase, la thrombine, etc.) pour la balise élimination ultérieure .
    3. Amplifier par PCR la séquence cible avec des amorces appropriées et sous-clone dans le vecteur d'expression. Utilisez la ligature clonage indépendante (LIC) 20,21 ou conventionnelles des techniques de clonage (restriction des enzymes / de ligature) pour le sous - clonage. Cependant, LIC peut faciliter un débit élevé, ce qui permet un grand nombre de différentes constructions (troncatures, variété d'étiquettes, choix des promoteurs) à cloner en parallèle plusfacilement.
  2. Dans Expression Vivo Membrane ciblée
    1. Utiliser une analyse de séquençage pour vérifier la cible β-baril OMP est cloné en aval et dans le cadre avec une séquence signal ( par exemple, pelB, OmpA) dans la construction d'expression.
      Remarque: La séquence signal dirige la chaîne naissante au translocon sec pour la sécrétion dans le périplasme et le montage ultérieur dans la membrane externe.
    2. Transformer la construction dans une souche d'expression de bactéries pour l'expression par pipetage 1,0 ul de plasmide dans 50 pl de BL21 (DE3) cellules chimiquement compétentes et mélanger doucement par pipetage de haut en bas. Incuber sur la glace pendant 30 min.
    3. impulsion de chaleur à 42 ° C pendant 30 secondes en utilisant un bain d'eau, puis placer en arrière sur la glace pendant 1 min.
    4. Ajouter 1 ml de milieu pré-chauffé SOC et agiter à 37 ° C pendant 1 h à 1000 rpm en utilisant un incubateur de paillasse shaker.
    5. Plaque 100 ul de cellules sur des plaques d'agar LB contenant une Antibiot appropriéeic et incuber une nuit à 37 ° C inversé.
    6. Effectuer des tests d'expression à petite échelle en inoculant 5 ml LB + culture antibiotique avec une seule colonie. Répétez l'opération pour 5-10 colonies.
      Remarque: En raison de la toxicité potentielle d'une OMP β-canon et le recours à des niveaux d'expression de base, la variabilité des colonies à la colonie est parfois observée. Par conséquent, le dépistage de multiples colonies est recommandé pour chaque construction en cours de test. Pour les essais à petite échelle expression, plutôt que classiques cultures de 5 ml, en croissance de 25 ml de cultures dans 125 ml des flacons Erlenmeyer à chicanes est suggéré. Ces conditions souvent mieux refléter ce qui se passera dans une croissance à grande échelle. En outre, il est une bonne idée de l' écran également divers types de milieux de culture (TB, LB, 2xYT, M9, etc.), étant donné que différents niveaux de succès ont été rapportés en fonction de la protéine cible.
      1. Cultivez à 37 ° C avec agitation jusqu'à une DO 600 de ~ 0,6.
      2. Provoquer expression de la OMP cible par l'annonceurding 5 pi de 1 M isopropylique β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à chaque tube de culture et permet de cultiver un 1-2 heures supplémentaires.
      3. Comparer les niveaux d'expression pour toutes les colonies par centrifugation de 1 ml de chaque culture (DO 600 de ~ 0,6) pendant 1 min à 15 000 x g en utilisant une microcentrifugeuse.
      4. Eliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 200 ul de tampon de charge SDS-PAGE à 1x. Chauffer à 100 ° C pendant 5 min, puis centrifuger à nouveau à 15.000 xg pendant 5 min.
      5. Analyser les échantillons en utilisant une SDS-PAGE en pipetant 20 pi dans chaque puits d'un gel à 10%. Exécutez le gel pendant 35 min à 200 V. constante
        Remarque: Il serait utile à ce stade pour être en mesure de déterminer si la protéine cible est correctement pliée ou non. Cela peut souvent être accompli en faisant purifications à petite échelle ou en dosant modifiabilité de chaleur.
    7. Sélectionnez la colonie montrant la meilleure expression et d'effectuer l'expression à grande échelle en utilisant 12-24 L de milieu.
      Remarque: Les méthodes classiques poussent généralement les cultures à 37 ° C avec agitation jusqu'à une DO 600 de ~ 0,6 et induisent alors avec un inducteur approprié (c. -à- 0,1-1 mM pour IPTG ou ~ 0,2% pour arabinose) pour un 2-4 heures supplémentaires . Si on le désire, avant l'induction, de réduire la température aussi basse que 20 ° C et à prolonger la période d'induction.
      1. Pour la méthode d'expression qui fuit, se développent à 25 ml inoculer la culture à 37 ° C dans un milieu LB contenant l'antibiotique approprié (s) jusqu'à ce que la DO 600 atteigne ~ 0,6. Ensuite, ajoutez 1 ml d'inoculer à douze 1 L flacons de milieu TB ainsi que des antibiotiques (s) et de grandir à 20 ° C à saturation (~ 3 jours).
    8. Récolter les cellules par centrifugation à 6000 xg pendant 10 min.
    9. Passez à l'étape de purification Section 2.1 ou congeler le culot cellulaire dans de l'azote liquide pour le stockage à long terme à -80 ºC.
  3. Expression à corps d'inclusion pour In Vitro Refolding
    1. Utiliser une analyse de séquençage pour vérifier la construction d'expression ne contient pas une séquence signal. L'absence d'une séquence signal va diriger la protéine cible à accumuler dans le cytosol sous forme de corps d'inclusion.
    2. Transformer la construction d'expression dans une souche d'expression de bactéries pour l'expression. Pour l' expression dans des corps d'inclusion, il est préférable de contrôler l' expression par induction ( par exemple, de l' IPTG, de l' arabinose, etc.) afin de minimiser les éventuels effets de toxicité.
    3. Plaque 100 pi de cellules transformées sur des plaques d'agar LB contenant un antibiotique approprié et incuber une nuit à 37 ° C inversé.
    4. Effectuer des tests d'expression à petite échelle en inoculant 5 ml LB + culture antibiotique avec une seule colonie.
    5. Répétez 1.3.4 étape pour 2-4 colonies supplémentaires.
    6. Cultivez à 37 ° C avec agitation jusqu'à une DO 600 de ~ 0,6.
    7. Provoquer avec un inducteur approprié pendant 1-2 heures.
    8. Comparer les niveaux d'expression pour tous les til colonies par une analyse par SDS-PAGE (voir l'étape 1.2.6). Sélectionnez la colonie montrant la meilleure expression et d'effectuer l'expression à grande échelle en utilisant 12-24 L de milieu.
      1. Faire croître les cellules à 37 ° C jusqu'à une DO 600 de 0,6 au 0,8 et induisent à 37 ° C pendant 3-5 heures. Tandis que l'expression de corps d'inclusion est plus robuste que d'autres types d'expression, comme dans toutes les expériences d'expression de protéine, l'expression peut être améliorée en modifiant le milieu de croissance, le temps d'induction, la température de l'induction et de la concentration de l'agent inducteur.
    9. Récolter les cellules par centrifugation à 6000 xg pendant 10 min.
    10. Passez à l'étape de purification Section 2.2 ou congeler le culot cellulaire dans de l'azote liquide pour le stockage à long terme à -80 ºC.

2. Purification

  1. Isolement à partir de fractions membranaires
    Remarque: Contrairement aux protéines solubles, des protéines membranaires intégrales sont incorporés dans la bicouche lipidique et doncexiger que les détergents pour les extraire pour une purification et d' analyse (figure 5). Après l'expression, la première étape dans la purification d'une OMP β-canon est extraction à partir de la fraction membranaire.
    1. Resuspendre les cellules dans le tampon de lyse (50 mM de Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 200 mM, MgCl2 10 mM, 50 ug / AEBSF ml, 5 ug / ml de désoxyribonucléase I) dans un rapport de 5 ml / g de pâte cellulaire.
    2. Lyse des cellules en utilisant une presse française ou homogénéisateur de cellules. Faites tourner les cellules lysées à 15.000 xg pendant 30 min à 4 ° C pour éliminer les cellules non lysées et les débris cellulaires.
    3. Transférer le surnageant dans un tube propre et centrifuger à nouveau à grande vitesse (200 000 xg) pendant 1 h à 4 ° C. Le culot résultant est la fraction de membrane contenant la protéine d'intérêt.
    4. En utilisant un homogénéisateur Dounce, remettre en suspension la fraction de membrane, en transférant tout d' abord les membranes, puis en ajoutant un tampon de solubilisation (50 mM de KH 2 PO 4 à pH 7,5, 200 mM de NaCl, 20 mM d' imidazole, PH 8,0) (50 ml par 20 g de cellules) à une concentration 2x, sans détergent.
    5. Verser les membranes remises en suspension dans un petit bêcher et on ajoute un détergent ( par exemple, le n-dodécyl-β-D-maltoside (DDM), le lauryl-N-oxyde (LDAO), le n-octyl-β-D-glucopyranoside (OG), le Triton X-100, etc.) lentement à une concentration finale de ~ 10 fois la concentration micellaire critique (CMC).
    6. Remplir d'eau jusqu'à une concentration finale de tampon 1x solubilisation. On agite pendant 0,5 à 16 heures à 4 ° C, en fonction de la facilité avec laquelle la protéine cible est extraite des membranes.
      Remarque: Le détergent est utilisé pour solubiliser les membranes lentement pour extraire la protéine cible. Il existe 3 types de détergents qui peuvent être utilisés ici: ionique (SDS, acide désoxycholique), non-ionique (Elugent, Tween, Triton X-100, OG, DDM), et zwitterioniques (AOTA, CHAPS). Un complexe protéine-détergent qui est stable et monodisperse au cours de l'étape de purification sera grandement à la réussite de la protéine membranaire crystallization. Plus d'informations sur les détergents, leurs propriétés, informations CMC, et leur utilisation dans la purification des protéines membranaires et d'autres applications peuvent être trouvées sur les sites Web des fournisseurs commerciaux.
    7. Centrifuger l'échantillon solubilisé à 300.000 xg pendant 1 heure à 4 ° C. Le surnageant contient maintenant la cible β-baril OMP détergent solubilisé.
    8. Procéder à la section 2.3, comme indiqué ci-dessous.
  2. Repliement des corps d'inclusion
    Remarque: Pour le repliement in vitro, la cible β-baril OMP est exprimé directement dans des corps d'inclusion. L'avantage ici est que ces protéines peuvent être produites à des niveaux élevés. Cependant l'inconvénient est que le repliage est souvent inefficace et varie d'une expérience de repliement à l'autre. Pourtant, il existe de nombreux exemples de protéines qui ont été repliées avec succès pour des études structurales. Après expression dans des corps d'inclusion, il faut maintenant isoler les corps d'inclusion pour le repliement expériences.
    1. Resuspendre les cellules dans le tampon de lyse (50 mM de Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 200 mM, MgCl2 10 mM, 50 ug / AEBSF ml, 5 ug / ml de désoxyribonucléase I, 4 mM de 2-mercaptoéthanol (BME)) (5 ml par g de pâte cellulaire). Lyse utilisant une presse, sonication ou homogénéisateur cellulaire français.
    2. Pellet les corps d'inclusion par une rotation à faible vitesse à 6000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
    3. Laver les corps d'inclusion par remise en suspension dans 25 ml de 1,0 M d'urée en utilisant un homogénéisateur Dounce. Pellet à nouveau par une rotation à faible vitesse à 6000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
    4. Répétez l'étape 2.2.3 si nécessaire.
    5. Remettre en suspension les corps d'inclusion lavés à une concentration finale de 10 mg / ml en utilisant un tampon contenant 8,0 M d' urée (ou 6,0 M de chlorhydrate de guanidinium (GdCl)) , plus un détergent ( par exemple, DCM ou LDAO) à 2x CMC ou plus.
      Remarque: Si vous le souhaitez, pour des cibles de protéines de la membrane contenant un marqueur histidine, chromatographie métal affinité immobilisé (IMAC) purification peut être effectuée en utilisant co dénaturantnditions (dans 8,0 M d'urée ou de 6,0 M GdCl) comme une première étape similaire à celle décrite ci-dessous dans la section 2.3.
    6. Effectuer la réaction de repliement par lentement (la nuit) retirer le dénaturant par dialyse dans un tampon dépourvu du dénaturant.
      Remarque: Il peut prendre plusieurs changements du tampon de dialyse pour accomplir cela. Par ailleurs, si les corps d'inclusion sont d'abord liés à une colonne IMAC, on peut faire la réaction de repliement tout liée à la colonne en échangeant lentement tampons pour enlever le dénaturant. Dans les deux cas, rappelez-vous que ceci est une protéine membranaire, par conséquent, le détergent doit être présent pour stabiliser la cible. De plus, si le détergent utilisé est dialysable, il doit être ajouté au tampon (s) de dialyse, aussi bien.
    7. Faites tourner les échantillons repliés à 200.000 xg pendant 1 h à 4 ° C. Le surnageant contient la cible β-baril OMP détergent solubilisé replié.
    8. Procéder à la section 2.3, comme indiqué ci-dessous.
  3. Une purification en utilisant IMAC, Ion-Exchange et Gel Filtration
    Remarque: la chromatographie d' affinité de métal- En supposant que la protéine a été conçu avec une étiquette histidine, que ce soit en mode natif exprimé ou repliée en utilisant des méthodes in vitro, puis immobilisé (IMAC) est effectuée pour la purification un peu comme pour l' histidine tagged protéines solubles, à l' exception du détergent doit être conservé dans tous les tampons suivants pour maintenir la OMP cible β-baril solubilisé et stable.
    1. Préparer une colonne 1-5 ml IMAC ou utiliser une colonne préemballées. Effectuer les étapes de chromatographie ultérieures à 4 ° C. Rincer à l'eau pour éliminer les traces de conservateurs. Si l'on utilise un système de purification automatisée d'installation de la colonne selon les instructions du fabricant.
    2. Préparer 500 ml d'IMAC tampon A (50 mM de K 2 HPO 4, à pH 7,5, NaCl 200 mM, 0,1% de DCM) et 250 ml d'IMAC tampon B (50 mM de K 2 HPO 4, à pH 7,5, NaCl 200 mM, 0,1% DCM et 1,0 M d'imidazole).
      Note: D'autres détergents qui peuvent être utilisés icymal nclure-6 (0,05%), du Triton X-100 (0,03%) et LDAO (0,05%).
    3. Equilibrer la colonne IMAC en utilisant 10 volumes de colonne de tampon A. IMAC
    4. Ajouter l'imidazole à l'échantillon de protéine à une concentration finale de 25 mM et mélanger. Chargez l'échantillon sur la colonne IMAC équilibrée à 2 ml / min. Recueillir l'écoulement à travers.
    5. Laver la colonne IMAC avec 5 volumes de colonne chacune des concentrations d'imidazole à l' aide du tampon B croissante (ie, 25 mM, 50 mM, 100 mM). Ramassez les lavages en fractions de 2 ml.
    6. Éluer l'échantillon avec une concentration finale de 250 mM pour 5 volumes de colonne. Recueillir l'échantillon élué dans 2 ml fractions.
    7. Analyser le flux à travers les fractions de lavage et les fractions d'élution en utilisant une analyse par SDS-PAGE (voir l'étape 1.2.6) en fonction de leur absorbance à 280 nm. Mettre en commun les fractions contenant l'OMP cible β-baril vérifiée par analyse SDS-PAGE.
    8. Supprimer l'étiquette 6x-histidine en ajoutant TEV protéase à l'échantillon groupé (selonle protocole du fabricant) et incubation pendant une nuit à 4 ° C avec doux balancement.
    9. Charger la solution échantillon / protéase sur une colonne IMAC à nouveau pour séparer la cible β-baril OMP (dynamique) des étiquettes clivés et tout échantillon non clivée. Le débit sera par contenir l'échantillon clivé manque la balise.
      Remarque: Ce serait également supprimer toute protéase comme TEV-His, qui a également une étiquette 6x-histidine non clivable lui-même. Sinon, d'autres méthodes seront nécessaires pour éliminer la protéase après digestion.
    10. Le cas échéant, effectuer une chromatographie échangeuse d'ions pour purifier davantage l'échantillon. Suivez les instructions du fabricant pour la colonne à utiliser, en étant sûr d'inclure détergent dans tous les tampons.
    11. Pour se préparer à la cristallisation, charger l'échantillon sur une colonne de filtration sur gel dans un tampon contenant le détergent à utiliser pour la cristallisation, tel que 25 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM de NaCl, 1% d'OG.
    12. Prélever 1 ml fractions et analyser les usianalyse ng SDS-PAGE (voir L'étape 1.2.6) en fonction de leur absorbance à 280 nm. Les fractions de piscine avec les absorbances à 280 nm, car ils contiennent la protéine cible. On concentre à ~ 10 mg / ml.
      Remarque: Si vous le souhaitez, un pliage approprié peut être évaluée en utilisant un test de modifiabilité de chaleur tel que décrit ci-dessous.
  4. Heat Modifiabilité Assay
    Remarque: Une méthode pour surveiller un repliement approprié de β-baril purifié OMP est d'effectuer des essais de modifiabilité de chaleur en utilisant une SDS-PAGE semi-native 22. Ici, les échantillons non chauffés qui sont pliées correctement typiquement migrer différemment de celles qui sont la chaleur dénaturée. Cette propriété est unique à la ß-barrel OMP et largement utilisé pour étudier cette famille de protéines membranaires.
    1. Avant la préparation des échantillons, assembler l'appareil de gel. Pour commencer, placez le réservoir tampon dans un seau à glace et entourer complètement avec de la glace. Insérez une distribution en interne ou d'un gel de gradient natif commercial dans le support et la placer dans le réservoir. Remplissez til réservoir complètement à froid 1x MES course du tampon (50 mM d'acide 2- [N-morpholino] éthanesulfonique, 50 mM de base Tris, 1 mM d'EDTA, 0,1% de SDS, pH 7,3).
    2. 0,25 pipette ul de l'échantillon (10 mg / ml) dans deux tubes de 1,5 ml de microcentrifugation. Etiqueter un comme «Boiled» et l'autre comme «RT».
    3. Ajouter 9,75 ul de tampon d'échantillon à chacun et à mélanger par pipetage. Pour les deux échantillons, ajouter 10 pi de tampon 2x SDS de chargement (100 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% de SDS, 0,2% de bleu de bromophénol, et 20% de glycérol) et mélanger doucement par pipetage.
    4. Faire bouillir l'échantillon 'Boiled' à 95 ° C pendant 5 minutes tout en laissant l'échantillon 'RT' à la température ambiante. Faites tourner la 'Boiled' brièvement échantillon.
    5. Charge 20 pi des deux échantillons sur le gel natif prémonté. Exécuter pendant 60 min à 150 V. constante Retirer le gel et laisser tremper dans une solution de coloration pour visualiser les résultats.

3. Cristallisation

Remarque: Pour la cristallisation des deuxdes cibles protéiques solubles et membranaires, il est un protocole standard pour maximiser la pureté des échantillons et de la stabilité ( par exemple, le meilleur détergent, des ligands, des cofacteurs, etc.). Méthodologie actuelle pour la cristallisation des protéines cibles membranaires en général , comprend trois grandes approches qui satisfont aux exigences amphiphiles des protéines bicouches-embedded: (1) détergents, (2) bicelle, et (3) la phase cubique lipidique (LCP) (figure 6) 23. L' utilisation d'un robot nanolitre de cristallisation est fortement recommandé lorsque cela est possible afin d'augmenter le nombre de conditions qui peuvent être criblés pour un volume d'échantillon donné, ainsi que, en utilisant les progrès récents dans les outils visant à faciliter la détermination de la structure (figure 7).

  1. Cristallisation utilisant Détergents
    1. Obtenir un détergent solubilisé échantillon de protéine qui est à ~ 10 mg / ml de concentration. Éventuellement, ajouter l'additif 1,2,3-heptanetriol directement à l'échantillon à une concentration finale de 3% pour réduire détertaille micellaire ent.
    2. Filtrer l'échantillon en utilisant un filtre centrifuge de 0,22 um pour éliminer les particules et les précipitations.
    3. L'utilisation d'un robot de cristallisation, effectuer une large cristallisation de la matrice criblage en utilisant disponibles dans le commerce 96 écrans ainsi soit par pendaison ou assis méthode de vaporisation de gouttes avec des gouttes composées de ~ 200 nl échantillon de protéine et ~ 200 tampon de cristallisation nl.
    4. Incuber les plaques de cristallisation à ~ 21 ° C. Inspecter les plaques hebdomadaires pour la croissance du cristal à l'aide d'un stéréomicroscope.
    5. Optimiser les fils de cristallisation par des composants de l'état de cristallisation de façon systématique variable (augmentant / diminuant les concentrations de sel ou précipitants, un tampon pH, la température d'incubation et / ou de la concentration de protéine).
  2. Utilisation de la cristallisation bicelles
    Note: Une démonstration plus détaillée des techniques bicelle a déjà été décrit par Ujwal et Abramson 24.
    1. Préparer ou acheter un 3Mélange de 5% bicelle constitué de DMPC CHAPSO à un rapport de 2,8: 1 selon les protocoles publiés 25. D'autres concentrations peuvent également être testés, ainsi que d'autres lipides et détergents selon les besoins.
    2. Obtenir un détergent solubilisé échantillon de protéine qui est à ~ 10 mg / ml de concentration.
    3. Ajouter le mélange de bicelle sur de la glace, à un rapport à partir de 4: 1 v / v (protéine: bicelle) (par exemple, ajouter 10 ul de mélange bicelle à 40 ul de protéine et mélanger rapidement par pipetage).
    4. Incuber sur la glace 30-60 min.
      Remarque: La protéine: solution bicelle doit rester la plupart du temps clair, mais peut souvent tourner légèrement opaque. Cependant, si la protéine: La solution devient laiteuse bicelle blanc, indiquant une précipitation, puis les autres variables doivent être analysées ( par exemple, un détergent, un tampon, etc.). Pour les nouveaux échantillons, faire des tests à petite échelle (protéines 8 pi et 2 bicelles pi) est recommandé de vérifier la stabilité avant mise à l'échelle pour empêcher la perte d'échantillon inutile.
    5. L'utilisation d'un robot de cristallisation, effectuer une large cristallisation de la matrice criblage en utilisant disponibles dans le commerce 96 écrans ainsi soit par pendaison ou assis méthode de vaporisation de gouttes avec des gouttes composées de ~ 200 nl échantillon de protéine et ~ 200 tampon de cristallisation nl.
    6. Incuber les plaques de cristallisation à ~ 21 ° C. Inspecter les plaques hebdomadaires pour la croissance du cristal à l'aide d'un stéréomicroscope.
    7. Optimiser les fils de cristallisation par des composants de l'état de cristallisation de façon systématique variable (augmentant / diminuant les concentrations de sel ou précipitants, un tampon pH, la température d'incubation et / ou de la concentration de protéine).
  3. Cristallisation Utilisation Lipidique phase cubique (LCP)
    Note: Une démonstration plus détaillée des techniques de LCP a été précédemment décrit par Liu et Cherezov 26,27.
    1. Obtenir un détergent solubilisé échantillon de protéine qui est à ~ 20 mg / ml de concentration.
    2. Préchauffer le monooléine à ~ 40 ° C. Charge60 ul monooléine dans une seringue 100 pi étanche aux gaz et 40 pi de protéine échantillon dans une autre.
    3. L'utilisation d'un coupleur de mélange, raccorder les seringues, en faisant attention de ne pas introduire de l'air.
    4. Mélanger doucement en appliquant une pression en alternance sur les pistons de seringue poussant le mélange d'une seringue à l'autre complètement jusqu'à ce que l'échantillon devienne translucide et homogène.
    5. À l'aide d'un robot de cristallisation conçu pour des procédés de LCP, effectuer une large cristallisation de la matrice de criblage en utilisant disponibles dans le commerce écrans 96 puits avec des plaques de cristallisation en sandwich de type (épaisseur du puits 0,1 mm) avec des gouttes composées de 100 nl échantillon de protéine et 750 du tampon de cristallisation nl.
      Note: les taux d'abandon peuvent être ajustés si nécessaire. En outre, des couvertures solides (c. -à- verre ou de plastique épais) sont recommandés qui soutiennent les gouttes bien plutôt que des films minces, qui tendent à permettre aux gouttes de se déplacer bien que les plaques sont traitées.
    6. Incuber la cristallisation pLates à ~ 21 ° C. Inspecter les plaques hebdomadaires pour la croissance du cristal à l'aide d'un stéréomicroscope.
    7. Optimiser les fils de cristallisation par des composants de l'état de cristallisation de façon systématique variable (augmentant / diminuant les concentrations de sel ou précipitants, un tampon pH, la température d'incubation et / ou de la concentration de protéine).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yiur est un transporteur de fer dépendant de TonB qui est une cible pour un vaccin contre Yersinia pestis putatif. Il a été identifié à l' origine en utilisant une analyse de puces à ADN. Ici, les mesures qui ont été prises pour déterminer la structure de yiur utilisant cristallographie aux rayons X sont décrits (Figure 9). Pour le clonage, la séquence d'ADN de yiur (sans la séquence signal N-terminale) a été amplifié par PCR à partir d'ADN génomique et sous-clo...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

β-baril OMP jouent des rôles essentiels dans les bactéries Gram-négatives, les mitochondries et les chloroplastes et sont des cibles importantes pour l'analyse structurelle qui offrent une multitude d'informations sur les mécanismes moléculaires essentiels aux membranes extérieures de ces organites respectives. Cependant, la production d'échantillon suffisant pour l'analyse structurelle est pas toujours simple et, par conséquent, un pipeline général est présenté pour la production de quantités suffisante...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à remercier Hervé Celia du CNRS pour avoir fourni les images UV et Chris Dettmar et Garth Simpson du Département de chimie de l’Université Purdue pour avoir fourni les images SONICC. Nous tenons à souligner le financement de l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales et du Programme de recherche intra-muros des Instituts nationaux de la santé. De plus, nous tenons à souligner le financement supplémentaire de l’Institut national des sciences médicales générales (A.M.S. et C.J.), de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses (N.N. 1K22AI113078-01) et du Département des sciences biologiques de l’Université Purdue (N.N.).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Robot de cristallisationTTP Labtech, Art Robbins-Anydevrait fonctionner ici, à l’exception
thermocycleur PCREppendorf, BioRad-Media
ShakerNew Brunswick, spectromètre Infors HT-UV-vis
Eppendorf-SDS-PAGE
appareilBioRad1645050, 1658005
SDS-PAGE et gels natifsBioRad, Life Technologies4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)
AkTA PrimeGEHealthcare-AkTA
PurifierGEHealthcare-Microcentrifugeuse
Eppendorf-Centrifuge
(basse-moyenne vitesse)Beckman-Coulter-Ultracentrifuge
(haute vitesse) vitesse)Rotor Beckman-Coulter-SS34
Rotor Sorvall-Type
45 TiRotor Beckman-Coulter-Type
70 Ti
06 435C
EmulsiflexAvestin-Dialysis
tubingSigmaD9652
Outils LCPHamilton, TTP Labtech-VDX
Plaques à 24 puitsHampton ResearchHR3-172
Plaques sandwichHampton Research, Dimensions moléculairesHR3-151, MD11-50 (MD11-53)
Grace Feuilles de cristallisationGrace Bio-Labs875238
HiPrep S300 HR colonneGE Healthcare17-1167-01
Colonne Q-SepharoseGE Healthcare17-0510-01
Écrans de cristallisationHampton Research, Qiagen, Dimensions
étanche aux gaz (100 ml)Hamilton  ;
du de cristallisation LCP Homogénéisateur Fisher Scientific moléculaires-Seringue

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence. Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).
  2. Ricci, D. P., Silhavy, T. J. The Bam machine: A molecular cooper. Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).
  3. Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex. Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).
  4. Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
  5. Noinaj, N., et al. Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins. Nature. 501, 385-390 (2013).
  6. Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition. Structure. 16, 1873-1881 (2008).
  7. Kim, S., et al. Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine. Science. 317, 961-964 (2007).
  8. Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher. Nature. 496, 243-246 (2013).
  9. Phan, G., et al. Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate. Nature. 474, 49-53 (2011).
  10. van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M. Jr, Rapoport, T. A. Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL. Science. 304, 1506-1509 (2004).
  11. Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports. Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).
  12. Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function. Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).
  13. Siburt, C. J., et al. Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae. Metallomics. 1, 249-255 (2009).
  14. Cornelissen, C. N., Hollander, A. TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae. Front in Micro. 2 (117), (2011).
  15. Dautin, N., Bernstein, H. D. Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway. Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).
  16. Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane. Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).
  17. Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G. Comprehensive Biophysics. Engelman, E. H., Tamm, L. K. 5, Academic Press. 139-163 (2011).
  18. Buchanan, S. K., et al. Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import. EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).
  19. Yamashita, S., et al. Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis. Structure. 19, 1672-1682 (2011).
  20. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).
  21. Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
  22. Rosenbusch, J. P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding. J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).
  23. Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., et al. Crystallization of integral membrane proteins. Curr Prot in Prot Science. Coligan, J. E., et al. Chapter 17, Unit 17 19(2007).
  24. Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. JoVE. , e3383(2012).
  25. Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).
  26. Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , e4000(2012).
  27. Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , (2011).
  28. Buchanan, S. K. Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli. Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).
  29. Buchanan, S. K. Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding. Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).
  30. Stanley, A. M., Fleming, K. G. The process of folding proteins into membranes: challenges and progress. Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).
  31. Pautsch, A., Schulz, G. E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain. Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).
  32. Cowan, S. W., et al. The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form. Structure. 3, 1041-1050 (1995).
  33. Ujwal, R., et al. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. PNAS. 105, 17742-17747 (2008).
  34. Robert, V., et al. Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif. PLoS Bio. 4, e377(2006).
  35. Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not? BMC Genomics. 13, 510(2012).
  36. Agah, S., Faham, S. Crystallization of membrane proteins in bicelles. Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).
  37. Ujwal, R., Bowie, J. U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55, 337-341 (2011).
  38. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).
  39. Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution. J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).
  40. Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482, 369-374 (2012).
  41. White, J. F., et al. Structure of the agonist-bound neurotensin receptor. Nature. 490, 508-513 (2012).
  42. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
  43. Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
  44. Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Prot ines de membrane externe en tonneau b taexpression et purification des OMPvecteur d expression T7transformation BL21 DE3induction l IPTGanalyse par SDS PAGEpurification par IMACclivage par la prot ase TEVchromatographie de filtration sur gelessais de cristallisation

Articles connexes