Ex Vivo intestinale Sacs pour évaluer la perméabilité de la muqueuse dans les modèles de maladies gastro-intestinales

Résumé

Ce protocole décrit l’utilisation de préparations de tissus intestinaux excisés ou « sacs intestinaux » comme modèle ex vivo de la fonction de la barrière intestinale. Ce modèle peut être utilisé pour évaluer l’intégrité de la barrière épithéliale et de la couche de gel muqueux à des sites intestinaux spécifiques dans des modèles animaux de maladies digestives.

Résumé

La barrière épithéliale est la première défense innée du tractus gastro-intestinal et régule de manière sélective le transport de la lumière dans les compartiments de tissu sous-jacentes, ce qui limite le transport de petites molécules à travers l'épithélium et presque complètement interdisant le transport macromoléculaire épithéliale. Cette sélectivité est déterminée par la couche de gel muqueux, ce qui limite le transport de molécules lipophiles et les deux récepteurs apical et les complexes protéiques de jonction serrées de l'épithélium. Modèles in vitro de culture de cellules de l'épithélium sont pratiques, mais en tant que modèle, il leur manque la complexité des interactions entre le microbiote, muqueux-gel, l'épithélium et du système immunitaire. D'autre part, l'évaluation in vivo de l'absorption intestinale ou de la perméabilité peut être effectuée, mais ces dosages mesurent absorption gastro-intestinale dans l'ensemble, sans aucune indication de spécificité de site. Ex vivo en utilisant des essais de perméabilité intestinale "sacs"; sont une méthode rapide et sensible de mesurer soit l'intégrité intestinale globale ou le transport comparative d'une molécule spécifique, avec l'avantage supplémentaire de l'intestin spécificité du site. Nous décrivons ici la préparation de sacs intestinaux pour les études de perméabilité et le calcul de la perméabilité apparente _(Papp) d'une molécule à travers la barrière intestinale. Cette technique peut être utilisée comme méthode d'évaluation de l'absorption du médicament, ou d'examiner dysfonctionnement de la barrière épithéliale régionale dans des modèles animaux de maladies gastro-intestinales.

Introduction

La barrière épithéliale intestinale du tractus gastro-intestinal est une surface mucosale à environ 400 m ² chez l'adulte humain. Par conséquent, il est constamment exposé à contester des microbes, des médicaments ingérés, les nutriments et les toxines bactériennes. L'hôte doit non seulement faire la distinction entre les bactéries commensales acceptables et des agents pathogènes potentiels, mais doit empêcher ces espèces et de leurs molécules sécrétées de traverser la barrière épithéliale, tout en permettant en même temps l'absorption des nutriments. Ainsi, le rôle de l'épithélium intestinal est d'agir comme une barrière sélective le contenu luminal ^1. Ceci est obtenu, en partie, par le système de défense innée à épithéliale de la muqueuse, ce qui agit à travers un système biologique sensible constitué de mécanismes constitutifs et inductibles ^2.

Perte de la fonction barrière épithéliale est une pathologie qui est caractéristique d'un certain nombre de maladies gastro-intestinales. In vivoExamen de la fonction de barrière épithéliale peut être évaluée par gavage oral d'une molécule de traceur et l'analyse subséquente du sérum ^3. Toutefois, cette technique présente aucune indication quant à l'emplacement du dysfonctionnement de la barrière. In vitro et ex vivo évaluation de la résistance transepitheliale Transwell en utilisant des systèmes ^{3 et} des chambres d'Ussing ^4,5 respectivement, sont couramment utilisés comme marqueurs de substitution de la fonction de barrière épithéliale, mais il leur manque la physiologie de la maladie à part entière de modèles animaux ^6. Dans ce protocole, nous décrivons un modèle de préparation des tissus ex vivo qui permet une évaluation directe et localisée de l'intégrité intestinale et qui peut être utilisé pour évaluer la fonction de barrière mucosale à un certain nombre de niveaux. Fait important, cette technique peut être appliquée à des modèles animaux de la maladie, ou peut être manipulée afin de permettre le plan pharmacologique en profondeur interrogation d'un dysfonctionnement de la barrière muqueuse.

Protocole

Tous les travaux des animaux dans ce protocole est effectuée dans le strict respect de l'Université du comité d'éthique animale Newcastle procédures approuvées.

1. Préparation des instruments, Culture Media et Plats

1. Préchauffer médias 199 (TC199) ou Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco médias à 37 ° C. Pré-oxygéner le milieu en faisant barboter avec 95% _{O 2/5%} CO _2. Vérifier que le milieu a un pH final de 7,3.
2. Préparer suture en coupant deux 5 sections cm pour chaque sac. Boucle les sutures dans un nœud non fermée.

2. Dissection et préparation de l'appareil gastro-intestinal

1. Retirer la nourriture solide 12 h avant l'euthanasie. Si l'on désire placer les animaux sur les suppléments nutritifs de gel au cours de cette période.
2. Euthanasier les souris par surdose de pentobarbital de sodium ([200 mg / kg], injection intrapéritonéale), suivie par dislocation cervicale, conformément à l'éthique institutionnelle protocols et pulvériser éthanol à 70% sur l'abdomen et le thorax.
3. En utilisant une paire de ciseaux, faire une incision horizontale au milieu de l'abdomen et d'exposer le péritoine.
4. Passez à séparer et l'enlever le tractus gastro-intestinal en coupant l'intestin grêle supérieur de l'estomac au niveau du sphincter du pylore et couper le gros intestin à la marge de l'anus. Utilisez une pince pour enlever délicatement le mésentère. Placez le tractus intestinal, milieu oxygéné préchauffé.
5. Identifier la section de l'intestin à évaluer la perméabilité (figure 1) et couper cette partie libre du reste du tractus intestinal.
   1. Afin de maintenir la cohérence entre les animaux, mesurer sections du duodénum et le jéjunum par rapport à l'estomac, et de mesurer les sections du côlon et de l'iléon par rapport au caecum.
   2. Lors de la sélection des segments de tissus, noter la présence de tissus lymphoïdes associés aux muqueuses telles que les plaques de Peyer. Ceux-ci peuvent être identifiés comme petit hochement de têteules sur la face séreuse de la lumière.
   3. En utilisant une seringue de 1 ml, rincer doucement le contenu luminal du segment intestinal dans une boîte de Pétri avec du PBS préchauffé (37 ° C). Ces contenus fécaux peuvent être éliminés ou stockés à -80 ° C pour une analyse ultérieure comme souhaité.

3. Préparation de l'intestin Sacs

1. Préparer une seringue de 1 ml avec un volume de 300 ul du composé ou de la molécule test. L'intégrité de la muqueuse, une solution à 1 mg / ml de FITC-Dextran M.Wt. 4400 peuvent être utilisés. Sondes allant de 4,400-70,000 Da taille peuvent être utilisés pour augmenter la sensibilité. adapter en toute sécurité d'un petit cathéter vasculaire des animaux sur la seringue.
2. Mesure 5 cm de l'ouverture du segment intestinal et attacher le segment bien fermés avec un fil de suture en boucle en ce moment. Placez délicatement une suture en boucle pré-noué autour de l'ouverture de l'intestin et insérer le cathéter émoussé. Tirer la corde fermée de manière à assurer le segment intestinalet libérer le volume de 300 ul de la seringue dans l'intestin, en sorte que toute la solution est injectée.
3. Retirez délicatement le cathéter tout en tirant la corde de suture pour assurer la fermeture du sac intestinal. Couper le sac intestinal détacher de l'intestin et le placer dans un tube conique de 50 ml rempli avec 20 ml de milieu oxygéné, préchauffé à 37 ° C.

4. Mesure de la Perméabilité

1. des tubes coniques de place contenant les sacs intestinaux dans un bain d'eau chauffée à 37 fixés ° C. À 0, 30, 60, 90 et 120 points de temps min, prendre un échantillon de 100 ul du tube conique et le transfert à une plaque de 96 puits, en remplaçant le volume avec 100 ul de milieu frais dans chaque cas.
2. Après l'échantillon final est pris, couper sacs ouverts au point de suture et sur toute la longueur du segment, l'exposition de la surface de la muqueuse.
3. Mesurer la longueur et la largeur de chaque segment intestinal. Si desirouge, snap geler les segments et les conserver à -80 ° C pour les protéines ou l'analyse biochimique, ou encore, de stocker dans une solution de stabilisation de l'ARN pour des analyses moléculaires.
4. Construire une courbe standard de dilutions de journaux pour des molécules FITC marqués allant de 1 à 1 x ^{10 -6.}
5. échantillons et normes Mesure pour FITC sur un lecteur de plaque fluorescente, FITC excitation / émission: 495 nm / 519 nm.

5. Calcul de la perméabilité apparente pour chaque individu intestinale Sac

1. Convertir des unités de temps à sec.
2. Pour chaque point de temps, calculer la concentration cumulative, Q
   
   Q _{t =} (C _t * V _r) + (Q _{t Somme *} V _s), Où:
   
   Q _t = concentration cumulée à l'instant t
   C _{t =} concentration à l'instant t
   V _{r =} Volume du côté récepteur
   Q _t = _somme Somme de toutes les Q précédente _{t
   S =} Vle volume échantillonné
   
3. Terrain Q en fonction du temps (T) et de calculer la pente: AQ / AT
4. Calculer la perméabilité apparente _(Papp)
   
   P _{app =} (AQ / AT) / (A * Co), Où:
   
   A = zone de tissu
   C ₀ = concentration initiale

Résultats

Ce protocole peut être utilisé pour étudier les changements régionaux dans la fonction de barrière intestinale chez des modèles animaux de maladies gastro-intestinales. En mesurant le flux d'une sonde paracellulaire à travers la surface de la muqueuse dans des zones différentes du tractus ^gastro-7, l'intégrité des jonctions serrées épithéliales peut être évaluée. En outre, en faisant varier la nature de la sonde paracellulaire par la taille (figure 2) ...

Discussion

Ici, nous avons détaillé l'isolement et la préparation des sacs intestinaux pour évaluer la fonction de barrière mucosale ex vivo. Préparations sac intestinal ont principalement été utilisés dans la recherche pharmaceutique, en examinant l'absorption de médicaments candidats à travers l'intestin. Cependant, ce test est également bien adapté à l'étude de la maladie intestinale. la perméabilité intestinale peut varier considérablement d'une région et d'évaluation spécifique au site de la p...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dekantel  ; Suture en soie non résorbable	Braintree Scientific	SUT-S 116
Media 199 (TC199)  ;	Life Technologies	11043-023	Pas de rouge de phénol car cela interfère avec la fluorescence
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	21063-045	Pas de rouge de phénol car cela interfère avec la fluorescence
N-acétylcystéine	Sigma Aldrich		Utilisation à 10 mM dans le milieu
Cathéthera vasculaire pour petits animaux : Physiocath	Data Sciences International	277-1-002
FITC-Dextran 4 400 MW	Sigma Aldrich	FD-4
FITC-Dextran 20 000 MW	Sigma Aldrich	FD-20
FITC-Dextran 70 000 MW	Sigma Aldrich	FD-70