Nous présentons ici un protocole adapté qui peut être utilisé pour générer un grand nombre de lymphocytes T tueurs naturels invariants murins à partir de la rate de souris. Le protocole décrit une approche par laquelle les cellules spléniques iNKT peuvent être enrichies, isolées et développées in vitro à l’aide d’un nombre limité d’animaux et de réactifs.
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Article de méthode
Un procédé optimisé pour isoler et expansion Invariant Cellules T Tueuses Naturelles de Spleen souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
La capacité à sécréter des cytokines rapidement lors d'une stimulation est une caractéristique fonctionnelle de l'invariant T tueuses naturelles (iNKT) lignée cellulaire. iNKT cellules sont donc caractérisées par une population de cellules T capables d'activer innée et adaptative direction réponses immunitaires. Le développement des techniques améliorées pour la culture et l'expansion des cellules iNKT murins facilite l'étude de la biologie des cellules iNKT in vitro et dans des modèles in vivo. Nous décrivons ici un procédé optimisé pour l'isolement et l'expansion de cellules spléniques murines iNKT.
Les rates de souris C57BL / 6 sont supprimés, disséqués et tendues et la suspension cellulaire obtenue est en couches sur les médias de gradient de densité. Après centrifugation, les cellules mononucléaires spléniques (EMN) sont recueillies et (CD5 +) des lymphocytes CD5-positifs sont enrichies en utilisant des billes magnétiques. iNKT cellules au sein de la fraction CD5 + sont ensuite colorées avec du ^5; GalCer tétramère CD1d-chargé et purifié par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Triées par FACS des cellules iNKT sont initialement puis cultivées in vitro en utilisant une combinaison de cytokines murines recombinantes et des récepteurs des cellules T de plaque lié (TCR) des stimuli avant d'être détendu dans la présence de murine IL-7 recombinante. En utilisant cette technique, environ 10 8 cellules iNKT peuvent être générés à l'intérieur de 18-20 jours de culture, après quoi ils peuvent être utilisés pour des tests fonctionnels in vitro, ou in vivo pour les expériences de transfert chez la souris.
Introduction
Murine T (iNKT) les cellules tueuses naturelles invariant constituent une population distincte de lymphocytes T innées choisis dans le thymus thymocytes corticaux par CD1d exprimant 1,2. cellules iNKT expriment un récepteur de lymphocyte T (TCR) comprenant une chaîne Vα14-Jα18 TCR invariant associé à chaque Vß8, Vβ7 ou Vβ2 TCR 3, qui est capable de reconnaître endogène ainsi que des antigènes lipidiques étrangers dans le cadre de CD1d. Par exemple, des cellules murines reconnaissent iNKT et sont activées par un antigène lipide endogène appelé isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4, ainsi que les α-galactosylcéramide (aGalCer) 5,6,
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Protocole
Dans cette étude, des adultes (6-8 semaines) femelles C57BL / 6 ont été utilisées. Les souris ont été logées et élevés selon les directives du vivarium Université de Gand. Toutes les procédures animales ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et de l'éthique institutionnelle.
1. Préparation des cellules mononucléaires (MNC) de Spleen souris
- Sacrifiez la souris par dislocation cervicale.
- Placez la souris vers le bas sur le plateau de dissection et fixer la biche et les pattes avec des épingles.
- Stériliser la surface de la peau avec 70% (vol / vol) d'éthanol / H 2 O. <....
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Résultats
Isolement des cellules mononucléaires spléniques en utilisant d'un gradient de densité prend environ une heure et élimine l'utilisation de réactifs nécessaires pour lyser les globules rouges (RBC). Un rendement élevé de cellules viables est obtenue en utilisant cette méthode et les débris générés pendant l'organe de déformation est supprimée. Typiquement, la fréquence des cellules iNKT au sein du pool de lymphocytes de la rate est comprise entre 1 et 5% des lymphocytes T totaux Cependant, cela peut varier se.......
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Discussion
Les étapes critiques dans le protocole actuel comprennent l'isolement et l'enrichissement ultérieur de CD5 + lymphocytes (Section 1 & 2), tri FACS (section 3) et l'étalement initial de cellules iNKT (section 4). Parmi les étapes effectuées dans la section 1, rappelez-vous à la couche attentivement la suspension cellulaire splénique sur le milieu de gradient de densité telle que une interphase cellulaire distincte est générée après la centrifugation. L'enrichissement ultérieur pour CD5
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun intérêt concurrent à divulguer.
Remerciements
D.E. et M.B.D. sont membres d’une plateforme de recherche multidisciplinaire (MRP) de l’Université de Gand et du consortium GROUP-ID (Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Matériau | |||
| murin recombinant IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| murin recombinant IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| murin recombinant IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purifié anti-souris CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purifié anti-souris CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| E450-conjugué anti-souris CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugué anti-souris CD8&alpha ; (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| CD5 (53-7.3) anti-souris conjugué à la FITC | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| CD3&epsilon anti-souris conjugué à V500 ; (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| microbilles anti-souris CD5 (Ly-1) | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| anti-souris purifié CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Bleu trypan, 0,4 % (poids/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 moyen | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ - gratuit] |
| Sérum de veau fœtal | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Pénicilline-streptomycine | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Albumine | sérique bovineSigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| &beta ;-Mercaptoéthanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Acide éthylènediaminetétraacétique ; | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Équipement | |||
| Plaque 96 puits F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| Plaque 24 puits | Greiner-bio one | 665-180 | |
| Plaque 6 puits | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml tube falcon | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µ ; m filtre | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 & micro ; m filter | Millipore | SVGP01050 | |
| Séparateur MiniMACS | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Colonnes | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Incubateur à CO2 à chemise d’eau | VWR | ||
| Hémocytomètre | VWR | ||
| Kit de dissection | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
Références
- Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
- Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (20....
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Réimpressions et autorisations
