Article de méthode

Un rapide et quantitative Méthode fluorimétrique pour Small Molecule dépistage du médicament protéique Ciblage

DOI :

10.3791/53261

⸱

16 octobre 2015

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1Institute of Materials Research and Engineering, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 2School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Dans cet article

Résumé

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Un protocole pour le criblage de petits médicaments moléculaires basé sur la synthèse in situ de nanoclusters d’or fluorescents ultra-petits (NC Au) en utilisant des protéines chargées de médicaments comme modèle est présenté. Cette méthode est simple pour déterminer l’affinité de liaison des médicaments à une protéine cible par un signal fluorescent visible émis par les NC Au à matrice de protéines.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous démontrons une nouvelle méthode de criblage de médicaments pour la détermination de l'affinité de liaison de petites molécules de médicament à une protéine cible par formation d'nanoclusters fluorescentes d'or (Au CN) au sein de la protéine de médicament chargé, sur la base du signal de fluorescence différentielle émis par le Au CN. Des protéines telles que l'albumine de sérum albumine humaine (HSA) et l'albumine de sérum bovin (BSA) sont sélectionnées comme les protéines du modèle. Quatre petits médicaments moléculaires (par exemple, l'ibuprofène, la warfarine, la phénytoïne et sulfanilamides) de différentes affinités de liaison aux protéines d'albumine sont testés. Il a été constaté que le taux de formation de fluorescence Au CN à l'intérieur de la protéine d'albumine de médicament chargée dans des conditions de dénaturation (par exemple, 60 ° C ou en présence d'urée) est plus lente que celle formée dans la protéine intacte (sans médicament). En outre, l'intensité de fluorescence du CN comme formé se trouve être inversement corrélée aux affinités de liaison de ces médicaments contre les protéines d'albumine. En particulier,plus l'affinité de liaison protéine-médicament, le ralentissement de la vitesse de formation Au CN, et donc une intensité de fluorescence inférieure de la résultante Au CN est observée. L'intensité de fluorescence de la résultante Au CN fournit donc une mesure simple de la force de liaison relative des différents médicaments testés. Cette méthode est également extensible pour mesurer la constante de liaison spécifique médicament-protéine (K D) en faisant simplement varier la teneur en médicament préchargée dans la protéine à une concentration en protéine déterminée. Les résultats mesurés correspondent bien avec les valeurs obtenues en utilisant d'autres méthodes de prestige, mais plus compliquées.

Introduction

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Les albumines sériques telles que l'albumine de sérum humain (HSA) et l'albumine de sérum bovin (BSA) sont la protéine la plus abondante dans le plasma et jouent un rôle vital dans le maintien de la pression osmotique du compartiment sang. Ils sont également reconnus comme protéines porteuses pour les petites molécules de faible solubilité dans l'eau, tels que les stéroïdes, les acides gras, les hormones thyroïdiennes, et une grande variété de médicaments. La propriété de liaison (par exemple, les sites de liaison, d'affinité ou force de liaison) de ces molécules au sérum albumines forme un sujet important de la pharmacocinétique. 1-4 Plusieurs méthodes analytiques ont été développées pour étudier les propriétés de liaison de différents médicaments à la sérum albumine, comme cristallographie aux rayons X, 5,6 résonance magnétique nucléaire (RMN), 7-11 et la résonance plasmonique de surface (SPR), 12,13, etc. Cependant, ces méthodes sont limitées soit par un processus d'analyse fastidieux et prend du temps (par exemple, la croissance de monocristal pour cristallographique aux rayons Xétude graphique), l'exigence de l'équipement spécialisé et coûteux (SPR), ou dans le besoin de marquage isotopique coûteuse (RMN) pour la détection. Il est donc hautement souhaitable de développer des moyens alternatifs pour les petites criblage moléculaire de la drogue d'une manière rapide, straight-forward, et rentable.

Nanoclusters de l'or (Au ​​CN) sont un type spécial de nanomatériau qui contiennent plusieurs dizaines d'atomes de métal avec des tailles inférieures à 2 nm. 14-17 Ils ont attiré de vastes intérêts de recherche en raison de leur structure électronique discrète et dépendant de la taille, 18, 19 et moléculaire, comme des absorptions et des émissions. 20-23 Ces propriétés des matériaux uniques, en particulier la fluorescence forte, ont trouvé diverses applications telles que la détection et l'imagerie dans des systèmes biologiques. 24-32 Ultrasmall fluorescent Au CN peut être synthétisé en utilisant des protéines fonctionnelles, telles que les albumines sériques, comme matrice. 33 Dans une synthèse typique de protéine sur matrice de Au CN, une certaine quantité de sels sont des Au premier encapsulé à l'intérieur de la protéine et par la suite réduite de la protéine elle-même. Le pouvoir réducteur de la protéine constituant est attribuée à des résidus d'acides aminés fonctionnels (par exemple, tyrosine) qui peuvent être activés en augmentant le pH de la solution à alcalin. Déroulement de la structure de protéine est considérée comme une étape critique pour la formation de Au CN. En effet, dans une protéine dépliée, plusieurs groupes fonctionnels réducteurs peuvent être exposés à l'UA sels encapsulés. Dépliage de la protéine peut être obtenue par traitement thermique ou exposition à des agents dénaturants. Introduction de médicaments à petites moléculaires peut également affecter le processus de déroulement, à savoir la modification de la température de dénaturation milieu et l'enthalpie de déroulement. 34,35 L'effet de tous ces facteurs, à son tour, peut être réfléchie par la cinétique de formation de fluorescente Au CN et manifesté dans l'intensité de fluorescence des résultantes Au CN. 36

e_content "> Cette vidéo montre le procédé de criblage de médicaments par synthèse Au CN en protéines d'albumine médicament chargé à une température élevée (60 ° C) ou en présence d'agents dénaturants (par exemple urée). L'intensité de fluorescence de la résultante Au CN est la lecture du signal. Tout d'abord, Au-CN sont synthétisés dans HSA et BSA modèles traités à 60 ° C ou en présence d'urée pour montrer comment la protéine dépliage (induite par un traitement thermique ou dénaturants) affecte la cinétique de formation de Au CN. Deuxièmement, Au CN sont synthétisés dans les modèles de protéines préchargés avec différents médicaments, et l'effet de chargement de médicament sur les intensités relatives de fluorescence de résultante Au CN est étudié, qui fournissent la mesure de la force relative de liaison. Enfin, le protocole de dépistage Au NC-médicament est modifiée pour la mesure quantitative de protéine-médicament constante de liaison (K D) en faisant varier la teneur en médicament préchargée dans la protéine d'une concentration fixe.

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Protocole

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Attention: S'il vous plaît consulter les fiches de données de sécurité (FDS) de tous les produits chimiques impliqués avant utilisation. L'expérience de criblage de médicaments implique la synthèse et la manipulation des nanomatériaux, qui peut avoir des risques supplémentaires par rapport à leur homologue vrac. S'il vous plaît assurer que toutes les mesures de contrôle nécessaires pour être pratiquées pendant toute l'expérience, y compris l'utilisation des contrôles d'ingénierie (hottes) et équipement de protection individuelle (EPI, par exemple, un pantalon long de la sécurité, des chaussures fermées, des gants résistant aux produits chimiques, et des lunettes de sécurité).

1. Préparation des réactifs chimiques pour le dépistage de drogues

  1. Précurseurs pour la synthèse Au CN
    1. Dissoudre 30 mg de solution d'or (III) de chlorure (99,99% métaux traces de base, 30 en poids.% Dans HCl dilué) dans 6,9 ml d'eau ultra pure pour préparer 15 mM d'or (III) de la solution de chlorure. Attention: solution de chlorure d'or est corrosif et irritant. Porter l'EPI approprié pour éviter le contact direct avec les yeux et la peau.
    2. Dissolve 74 mg de HSA ou BSA dans 1 ml d'eau ultra pure pour préparer 74 mg / ml de solution de protéines de stock.
  2. Solutions médicamenteuses
    1. Dissoudre la quantité désirée de médicament, par exemple, 1,9 mg de (a) l'ibuprofène, 2,8 mg de (b) la warfarine, 2,3 mg de (c) la phénytoïne, et 1,5 mg de (d) sulfanilamide dans 20 pi de DMSO pour préparer 450 mM de solutions mères de médicament.
      Remarque: Le DMSO est choisi comme solvant parce que ces médicaments sont hydrophobes et ont une faible solubilité dans l'eau.
  3. D'autres réactifs
    1. Dissoudre 600 mg de NaOH en pastilles dans 10 ml d'eau ultra-pure pour préparer 1,5 M de solution de NaOH. Dissoudre 2,4 g d'urée dans 2 ml d'eau ultra pure pour préparer 20 M de solution d'urée.

2. synthèse de la protéine-Templated Au CN

  1. HSA-templated Au CN (HSA-Au CN)
    1. Placez deux flacons en verre, chacune contenant une barre d'agitation magnétique micro en elle, à deux température séparé agitation magnétique contrôlableRER.
    2. Régler la température d'un agitateur magnétique à 60 ° C, et l'étiquette du flacon de verre sur le dessus de celui-ci en tant que "60 ° C"; tandis que l'autre agitateur magnétique est maintenu à température ambiante (TA) lorsque le flacon de verre sur le dessus de celui-ci est marqué comme "RT".
    3. Ajouter 200 ul de solution de HSA, 200 ul d'eau ultrapure, et 200 ul d'une solution d'or (III) de chlorure de chaque flacon sous agitation constante (défini comme 360 ​​tours par minute, sauf indication contraire) pour permettre l'encapsulation de Au ions à l'intérieur du gabarit de la protéine.
    4. 2 minutes plus tard, ajouter 20 ul de solution de NaOH à chaque flacon de manière à activer la capacité réductrice de la HSA dans la formation Au CN et commencer à enregistrer la durée de réaction à 0 min.
    5. Chaque 20 min, tirer 50 pl de solutions à partir de chacun de l'échantillon d'une plaque noire de 384 puits et mesurer le spectre d'émission avec un lecteur de microplaque. La configuration typique de balayage: λ ex = 370 nm, λ em = 410-850 nm.
    6. Arrêtez l'agitateur magnétique après 100 min.
    7. Refroidir les flacons de verre sous l'eau courante dans un évier. Attention: Les flacons de verre sont chauds. Porter des gants résistants à la chaleur pour éviter de brûler.
    8. Tracer les spectres de photoémission en tout temps pour chaque échantillon d'acquérir la cinétique de formation de Au CN à différentes conditions de température.
  2. BSA-templated Au CN (BSA-Au CN)
    1. Placez un flacon en verre contenant une barre d'agitation magnétique micro sur le dessus d'un agitateur magnétique. Laisser la température que la température ambiante.
    2. Mélanger 200 ul de solution de BSA, 200 ul d'urée, et 200 pl de solution d'or (III) de chlorure dans le flacon en verre sous agitation constante.
    3. 2 minutes plus tard, ajouter 20 ul de solution de NaOH à activer la capacité de réduction de BSA pour former Au CN et commencer à enregistrer la durée de réaction à 0 min. Mesurer le spectre du mélange de réaction de photoémission horaire.
      Remarque: Le spectre de BSA-Au CN photoémission est mesuréemoins fréquemment parce que le taux de BSA-Au CN formation est plus lente que celle de la HSA-Au à la même température en raison de moins d'efficacité de l'urée pour déplier la protéine.
    4. Arrêtez l'agitateur magnétique après 7 h. Tracer les spectres de photoémission en tout temps pour voir la cinétique de formation de Au CN par l'urée dénaturation.

Projection 3. Petit Drug moléculaire

  1. Écran affinité de liaison relative des différents médicaments à petites moléculaires à HSA
    1. Placez cinq flacons de verre, chacun contenant une barre d'agitation magnétique en elle, au-dessus d'une température contrôlable multipoint agitateur magnétique. Marquez ces flacons comme A, B, C et D, respectivement, pour chaque médicament, à savoir l'ibuprofène, la warfarine, la phénytoïne et sulfanilamide. Étiqueter celui avec HSA pur comme contrôle.
    2. Ajouter 200 pi de HSA à chaque flacon. Ajouter 1 pi de solution de médicament à quatre flacons correspondants. Ajouter 1 pi de DMSO à la commande. Allumez l'agitateur et régler la vitesse de rotation à 360rpm et incuber pendant 1 heure pour permettre la liaison à la HSA médicament pour terminer.
    3. 1 h plus tard, ajouter 200 ul d'eau Milli-Q et les 200 ul de solution d'or (III) de chlorure de chaque flacon sous agitation constante. Régler la température à 60 ° C sous agitation constante pendant 10 min. Ajouter 20 ul de NaOH 1,5 M dans chaque flacon et commencer à enregistrer la durée de réaction à 0 min.
    4. Dessiner rapidement 50 pi de solution de chaque flacon dans une plaque noire de 384 puits et mesurer le spectre d'émission (résultats étiquetés comme 0 min). Enregistrer les spectres d'émission de chaque échantillon toutes les 10 min. Recueillir au moins quatre spectres à quatre fois différente, qui est de 0, 10, 20, et 30 min.
    5. Répétez les étapes 3.1.1 - 3.1.4 à plusieurs reprises pour obtenir des résultats avec une tendance constante. Arrêtez l'agitateur magnétique.
    6. Tracer les spectres de photoémission résolue en temps pour chaque échantillon (A - D, et de contrôle). Identifier l'intensité du pic de tous les échantillons et complot contre le temps de comparer la cinétique de formation de Au CN en différents modèles de protéines chargés en médicament.
  2. Mesure de la constante de liaison d'un médicament spécifique pour HSA
    1. Répétez les étapes 3.1.1 - 3.1.4. Remplacer la solution de médicament avec des solutions d'ibuprofène à quatre concentrations différentes (y compris un échantillon de contrôle utilisant HSA seulement sans charge de médicament). Marquer le flacon en verre en fonction de la concentration du médicament de manière correspondante.
    2. 10 min plus tard, refroidir les flacons de verre sous l'eau courante dans un évier. Attention: Les flacons de verre sont chauds. Porter des gants résistants à la chaleur pour éviter de brûler.
    3. Dessinez 50 pi des solutions ci-dessus de chaque flacon dans une plaque noire de 384 puits et mesurer le spectre d'émission.
    4. Répétez les étapes 3.2.1 - 3.2.3 deux fois de plus d'obtenir deux autres ensembles de résultats à différentes concentrations de médicaments.
    5. Arrêtez l'agitateur magnétique. Tracer les spectres de photoémission et analyser les résultats.
      1. Pour les données brutes obtenues dans chaque lot individuel, tracer le spectre de photoémission de chaqueéchantillon dans les logiciels tels que les logiciels OriginPro et découvrir l'intensité maximale.
      2. Calculer et tracer l'intensité de fluorescence relative [(I 0 - I) / I 0] contre la concentration du médicament, où je et je 0 réfère à l'intensité de fluorescence de Au CN formée dans la drogue chargé HSA et pure HSA, respectivement.
      3. Calcul de la constante de liaison en ajustant les données à un modèle de liaison à site unique en utilisant l'équation de Michaelis-Menten: Y = R max × C / (K D + C), où R max indique le signal de réponse maximale, C est la concentration du ligand D et K est la constante de liaison. Effectuez cette dans des logiciels tels que OriginPro. Sélectionnez le menu Analyse non linéaire d'adaptation Curve Fit, puis sélectionnez la fonction Hill, de croissance / catégorie Sigmoidal. Sur les paramètres: la page de sélection de fonction, cliquez sur Ajuster pour montrer les résultats ajustés.

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Résultats

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Dépliement des protéines est une procédure importante pour la formation de protéines templated Au CN parce que les groupes fonctionnels plus réactifs (par exemple, des résidus de tyrosine) d'une protéine peuvent être exposés à réduire les ions Au encapsulés et donc accélérer le rythme de Au CN de formation. De chauffage et de dénaturation externe agents sont deux moyens communs pour promouvoir le processus de déroulement des protéines. La figure 1 montre l'effet de la chaleur et en ajoutant des...

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Discussion

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Il ya plusieurs étapes critiques qui doivent être mis en évidence dans cette méthode. Dans le protocole de criblage de l'affinité de liaison relative des différents médicaments à petites moléculaires, les étapes 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 et sont essentiels pour obtenir de bons résultats montrant tendance constante pour la force relative de liaison. Dans ces étapes, les actions de l'ajout de produits chimiques et de l'élaboration de solutions de réaction pour la mesure doivent être aussi rapidement que possible afi...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Y.N.T. tient à remercier l’Agence pour la science, la technologie et la recherche (A*STAR) de Singapour pour son soutien financier dans le cadre de la subvention JCO CDA 13302FG063.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solution de chlorure d’or (III), 30 %Sigma-Aldrich484385corrosive et irritante
, 96 %Sigma-AldrichA1887
Albumine sérique bovine, 96 %Sigma-AldrichA2153
Ibuprofène, 98 %Sigma-AldrichI4883.
warfarine, 98 %Sigma-AldrichA2250
phénytoïneSigma-AldrichPHR1139
sulfanilamide, 99 %Sigma-AldrichS9251
diméthyl sulfoxydeSigma-AldrichD8418
uréeSigma-AldrichU5128
Hydroxyde de sodiumSigma-Aldrich
Agitateur magnétiqueIKART5
Lecteur de microplaquesTecanInfinite M200
Plaque 384 puitsCorning
5 ml pipette à déplacement d’airEppendorf
1 000 μ ; l pipette à déplacement d’airEppendorf
100 μ ; l pipette à déplacement d’airEppendorf
5 000 μ ; l pourboires
1 000 μ ; l Pointes
100 μ ; l Embouts
Microtube de 1,5 mlEppendorf
de 20 ml avec bouchon
Flacon en verre de 4 ml avec bouchon
Albumine sérique humaine 221465EppendorfEppendorfEppendorf Flacon en verre à vis à vis

Références

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Mots-clés

Fluorescent Gold NanoclustersProtein Targeting Drug ScreeningBinding Affinity MeasurementHuman Serum AlbuminFluorescence Intensity AnalysisGold Nanocluster FormationDrug Protein Binding ConstantMicroplate Reader EmissionTemperature Denaturing ConditionsUrea Denaturation Method

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