Un rapide et quantitative Méthode fluorimétrique pour Small Molecule dépistage du médicament protéique Ciblage

Résumé

Un protocole pour le criblage de petits médicaments moléculaires basé sur la synthèse in situ de nanoclusters d’or fluorescents ultra-petits (NC Au) en utilisant des protéines chargées de médicaments comme modèle est présenté. Cette méthode est simple pour déterminer l’affinité de liaison des médicaments à une protéine cible par un signal fluorescent visible émis par les NC Au à matrice de protéines.

Résumé

Nous démontrons une nouvelle méthode de criblage de médicaments pour la détermination de l'affinité de liaison de petites molécules de médicament à une protéine cible par formation d'nanoclusters fluorescentes d'or (Au CN) au sein de la protéine de médicament chargé, sur la base du signal de fluorescence différentielle émis par le Au CN. Des protéines telles que l'albumine de sérum albumine humaine (HSA) et l'albumine de sérum bovin (BSA) sont sélectionnées comme les protéines du modèle. Quatre petits médicaments moléculaires (par exemple, l'ibuprofène, la warfarine, la phénytoïne et sulfanilamides) de différentes affinités de liaison aux protéines d'albumine sont testés. Il a été constaté que le taux de formation de fluorescence Au CN à l'intérieur de la protéine d'albumine de médicament chargée dans des conditions de dénaturation (par exemple, 60 ° C ou en présence d'urée) est plus lente que celle formée dans la protéine intacte (sans médicament). En outre, l'intensité de fluorescence du CN comme formé se trouve être inversement corrélée aux affinités de liaison de ces médicaments contre les protéines d'albumine. En particulier,plus l'affinité de liaison protéine-médicament, le ralentissement de la vitesse de formation Au CN, et donc une intensité de fluorescence inférieure de la résultante Au CN est observée. L'intensité de fluorescence de la résultante Au CN fournit donc une mesure simple de la force de liaison relative des différents médicaments testés. Cette méthode est également extensible pour mesurer la constante de liaison spécifique médicament-protéine (K _D) en faisant simplement varier la teneur en médicament préchargée dans la protéine à une concentration en protéine déterminée. Les résultats mesurés correspondent bien avec les valeurs obtenues en utilisant d'autres méthodes de prestige, mais plus compliquées.

Introduction

Les albumines sériques telles que l'albumine de sérum humain (HSA) et l'albumine de sérum bovin (BSA) sont la protéine la plus abondante dans le plasma et jouent un rôle vital dans le maintien de la pression osmotique du compartiment sang. Ils sont également reconnus comme protéines porteuses pour les petites molécules de faible solubilité dans l'eau, tels que les stéroïdes, les acides gras, les hormones thyroïdiennes, et une grande variété de médicaments. La propriété de liaison (par exemple, les sites de liaison, d'affinité ou force de liaison) de ces molécules au sérum albumines forme un sujet important de la pharmacocinétique. ^1-4

Protocole

Attention: S'il vous plaît consulter les fiches de données de sécurité (FDS) de tous les produits chimiques impliqués avant utilisation. L'expérience de criblage de médicaments implique la synthèse et la manipulation des nanomatériaux, qui peut avoir des risques supplémentaires par rapport à leur homologue vrac. S'il vous plaît assurer que toutes les mesures de contrôle nécessaires pour être pratiquées pendant toute l'expérience, y compris l'utilisation des contrôles d'ingénierie (hottes) et équipement de protection individuelle (EPI, par exemple, un pantalon long de la sécurité, des chaussures fermées, des gants résistant aux produit....

Résultats

Dépliement des protéines est une procédure importante pour la formation de protéines templated Au CN parce que les groupes fonctionnels plus réactifs (par exemple, des résidus de tyrosine) d'une protéine peuvent être exposés à réduire les ions Au encapsulés et donc accélérer le rythme de Au CN de formation. De chauffage et de dénaturation externe agents sont deux moyens communs pour promouvoir le processus de déroulement des protéines. La figure 1 montre l'effet de la chaleur et en ajou.......

Discussion

Il ya plusieurs étapes critiques qui doivent être mis en évidence dans cette méthode. Dans le protocole de criblage de l'affinité de liaison relative des différents médicaments à petites moléculaires, les étapes 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 et sont essentiels pour obtenir de bons résultats montrant tendance constante pour la force relative de liaison. Dans ces étapes, les actions de l'ajout de produits chimiques et de l'élaboration de solutions de réaction pour la mesure doivent être aussi rapidement que possible afi.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution de chlorure d’or (III), 30 %	Sigma-Aldrich	484385	corrosive et irritante
, 96 %	Sigma-Aldrich	A1887
Albumine sérique bovine, 96 %	Sigma-Aldrich	A2153
Ibuprofène, 98 %	Sigma-Aldrich	I4883.
warfarine, 98 %	Sigma-Aldrich	A2250
phénytoïne	Sigma-Aldrich	PHR1139
sulfanilamide, 99 %	Sigma-Aldrich	S9251
diméthyl sulfoxyde	Sigma-Aldrich	D8418
urée	Sigma-Aldrich	U5128
Hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich
Agitateur magnétique	IKA	RT5
Lecteur de microplaques	Tecan	Infinite M200
Plaque 384 puits	Corning
5 ml pipette à déplacement d’air	Eppendorf
1 000 μ ; l pipette à déplacement d’air	Eppendorf
100 μ ; l pipette à déplacement d’air	Eppendorf
5 000 μ ; l pourboires
1 000 μ ; l Pointes
100 μ ; l Embouts
Microtube de 1,5 ml	Eppendorf
de 20 ml avec bouchon
Flacon en verre de 4 ml avec bouchon

Albumine sérique humaine 221465EppendorfEppendorfEppendorf Flacon en verre à vis à vis