Article de méthode

Détection de intracellulaire Gene Expression dans des cellules vivantes de murin, humain et porcin Origine utilisant des nanoparticules marquées par fluorescence

13.8K vues

⸱

DOI :

10.3791/53268

⸱

13 novembre 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Surgery, German Heart Center Munich, Technische Universität München, 2Institute for Medical Microbiology, Immunology, and Hygiene, Technische Universität München, 3Clinical Cooperation Groups: "Antigen-specific Immunotherapy" and "Immune Monitoring", Helmholtz Center Munich (Neuhererg), Technische Universität München, 4DZHK (German Center for Cardiovascular Research) – Partner site Munich Heart Alliance

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit décrit une nouvelle technique qui permet la détection de l’expression génique intracellulaire après endocytose de nanoparticules marquées par fluorescence directement dans des cellules vivantes. La méthode ne nécessite pas de manipulation des cellules et n’est pas limitée par rapport au gène ou à l’espèce cible.

Résumé

La reprogrammation des cellules somatiques en cellules souches pluripotentes induites (iPS) a été réalisée avec succès chez différentes espèces de mammifères, notamment la souris, le rat, l’homme, le porc et autres. La vérification des clones iPS repose principalement sur la détection de l’expression endogène de différents gènes de pluripotence. Ces gènes représentent principalement des facteurs de transcription situés dans le noyau cellulaire. Traditionnellement, la preuve de leur expression endogène est apportée par une coloration immunohistochimique après fixation des cellules. Cette approche nécessite des cultures répétées de chaque clone à ce stade précoce afin de préserver les clones validés pour d’autres expériences. Le présent protocole décrit une approche avec des nanoparticules spécifiques à un gène qui permet d’évaluer l’expression génique intracellulaire directement dans des cellules vivantes par fluorescence. Les nanoparticules sont constituées d’une particule d’or centrale couplée à un brin de capture portant une séquence complémentaire à l’ARNm cible ainsi qu’à un brin rapporteur éteint. Ces nanoparticules sont activement endocytosées et l’ARNm cible déplace le brin rapporteur qui commence alors à devenir fluorescent. Par conséquent, l’expression spécifique des gènes cibles peut être détectée directement au microscope. De plus, la fluorescence émise permet l’identification, l’isolement et l’enrichissement de cellules exprimant un gène spécifique par cytométrie en flux. Cette méthode peut être appliquée directement sur des cellules vivantes en culture sans aucune manipulation des cellules cibles.

Introduction

En 2006, une nouvelle approche a été décrite à reprogrammer des cellules somatiques dans un état pluripotent. Après la présélection d'un tableau de reprogrammation facteurs potentiels fibroblastes murins pourraient être convertis avec succès à ce qu'on appelle induits cellules souches pluripotentes (iPS) par transduction rétrovirale et la surexpression de quatre facteurs de transcription (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 1. Par la suite cette technique a effectivement été reproduite en utilisant des cellules somatiques de différentes espèces de mammifères y compris les humains, les singes 2 3, 4 rats, chiens, moutons 5 6 et 7 porcs. De plus, la modification ou le remplacement des protocoles en omettant le facteur de transcription c-MYC potentiellement oncogènes ont été publiés 8, 9.

Indépendamment de la reprogrammation initiale approcher le vrai pluripotence des colonies en croissance doit être confirmée, une tâche laborieuse et chronophage. Un inconvénient majeurde la majorité de ces analyses est qu'ils ne peuvent pas être effectuées sur des cellules vivantes. Facteurs de pluripotence établis tels que OCT4, SOX2, NANOG ou REX1 représentent des facteurs de transcription situés dans le noyau et leur détection exige la fixation des cellules avant l'immunohistochimie ou la lyse des cellules pour l'analyse RT-PCR 10 -. 12 Par la suite, ces cellules sont perdues pour l'avenir expériences exigeant cultures répétées de chaque colonie.

Ainsi, une technologie à analyser sur la pluripotence des cellules vivantes est hautement souhaitable. Plusieurs approches peuvent en effet être effectuées directement sur ​​les cellules vivantes en utilisant des anticorps dirigés contre des antigènes membranaires (par ex. TRA-1-60, SSEA4) 12, rapporté colorants fluorescents pour détecter la phosphatase 13 alcaline ou de petites molécules lesquelles une étiquette spécifique souches embryonnaires (ES) et 14 cellules iPS. Cependant, les anticorps pourraient néanmoins affecter les cellules et chaque method est limitée à un seul marqueur pluripotent. Enfin, les balises moléculaires fluorescents, des oligonucleotides antisens à double ayant des structures en épingle à cheveux, qui permettent la coloration des cellules en temps réel, ont été décrits 15. Bien que cette approche peut être appliquée à de nombreux gènes, la technique nécessite nucléofection d'une suspension cellulaire unique, qui ne sont pas applicables aux colonies iPS en croissance.

Il ya quelques années nanoparticules spécifiques du gène ont été décrits pour analyser l'expression de la survivine dans les cellules cancéreuses du sein humain SKBR3 16. Ce manuscrit décrit une approche novatrice roman à la détection de marqueurs de pluripotence dans ES vivants et des cellules iPS grâce à l'utilisation de conjugués de nanoparticules d'or. Ces nanoparticules sont constituées d'une particule d'or avec un brin central de capture couplé portant la séquence d'ARN complémentaire et un brin marqué au Cy3 reporter. Le signal fluorescent du brin rapporteur est éteinte par la particule d'or central. En outre, appropriéenanoparticules servent de témoins négatifs et positifs, respectivement (figure 1). Pour une application simplement les nanoparticules sont ajoutées au milieu de culture (figure 2) et pénètrent dans les cellules par endocytose (Figure 3). Si l'ARN cible est exprimé, il déplace le brin de journaliste qui émet alors un signal fluorescent. Cette méthode ne nécessite pas la manipulation de la cellule cible et l'expression du gène cible peut être contrôlée optiquement sous un microscope à fluorescence directement dans les cellules vivantes. En outre, la technologie peut être appliquée à n'importe quel gène cible souhaitée entre les espèces dans le cas de cellules iPS et donc peut être utilisé dans de nombreux domaines de recherche différents. Enfin, la cytométrie en flux analyse permettant l'identification et à l'enrichissement de cellules positives Cy3.

Protocole

1. Préparation des médias, Réactifs et conditions de culture cellulaire

  1. Humain HEK 293 cellules de rein embryonnaire
    1. Culture des cellules HEK 293 (CRL-1573, ATCC) par F-12 du milieu de DMEM / Ham additionné de 5% de FCS, de L-glutamine (2 mM), et de la pénicilline (100 U / ml) / streptomycine (100 ug / ml).
    2. Pour le passage des cellules, laver les cellules une fois avec du PBS, ajouter 0,05% de trypsine / EDTA et incuber pendant 3 minutes à 37 ° C et 5% de CO 2. Des cellules de transfert dans un tube de 15 ml, centrifuger pendant 5 min à 1200 rpm (300 x g) et transférer environ 5x10 5 cellules dans un flacon de culture T25 frais.
  2. Murins fibroblastes embryonnaires (MEF)
    1. Ajouter 1 ml d'une solution de gélatine à 0,1% à chaque puits et 6-incuber à température ambiante (TA) pendant 1 heure. Aspirer liquide et conserver à température ambiante jusqu'à utilisation.
    2. Culture MEF dans du DMEM supplémenté avec 10% de FCS, de L-glutamine (2 mM), de L-glucose (4,5 g / l), du pyruvate de sodium (1 mM), et de la pénicilline (100 U /ml) / streptomycine (100 ug / ml) sur des plaques à 6 puits revêtues de gélatine.
    3. Distribuer MEF dans des plaques 6 puits et les laisser pousser jusqu'à confluence. Ajouter la mitomycine (5 ug / ml) pendant 2,5 h pour arrêter les cellules. Aspirer le milieu de laver les cellules deux fois avec support MEF complète et ajouter 3 ml de milieu MEF à chaque 6 puits. Ces cellules servent comme un chargeur-couche pour les cellules murines et iPS porcine.
  3. Culture de l'ES de souris et des cellules iPS
    1. Pour préparer souris ES milieu de culture, ajouter du milieu DMEM avec 15% de FCS, de L-glutamine (2 mM), de L-glucose (4,5 g / l), MEM acides aminés non essentiels (1 x), β-mercaptoéthanol (0,1 mM) et facteur inhibiteur de leucémie (1,000 U / ml).
    2. Rincez 6 puits avec MEF de croissance arrêtée une fois avec DMEM sans sérum, ajouter 2 ml souris milieu ES et des cellules murines iPS (20% des cellules d'un plat de confluence). Tous les cellules de lavage de journée, une fois avec du DMEM sans sérum et ajouter 2 ml de milieu ES de souris frais.
    3. Pour le passage des cellules, laver chaque puits une fois avec DMEM sans sérum, ajouter 00,25% de trypsine / EDTA et incuber pendant 3 minutes à 37 ° C et 5% de CO 2. Transfert des cellules dans un tube de 15 ml, centrifuger pendant 5 min à 1200 rpm (300 x g), remettre les cellules dans 500 ul souris milieu ES et ajouter 100 pi de la suspension à 2 ml souris milieu ES dans un endroit frais à 6 puits avec un chargeur-couche MEF.
  4. Culture de porc cellules iPS
    1. Pour préparer cochon moyen iPS, compléter DMEM / Ham F-12 avec 20% de sérum de KO, L-glutamine (2 mM), MEM acides aminés non essentiels (1X), β-mercaptoéthanol (0,1 mm), et la pénicilline (100 U / ml) / streptomycine (100 ug / ml). Filtrer à travers un filtre de 0,22 um et conserver à 4 ° C pendant 2 à 3 semaines. Lors de la première utilisation, ajouter le bFGF (10 ng / ml de concentration finale).
    2. Rincez 6 puits avec MEF de croissance arrêtée une fois avec des cellules iPS DMEM sans sérum / F-12 et d'ajouter 1,5 ml de porc moyennes iPS Ham et porcine (10% des cellules d'un plat de confluence). Tous les cellules de lavage de journée, une fois avec du DMEM sans sérum / Ham F-12 et ajouter 1,5 ml porcines fraîches moyennes IPS.
    3. Pour préparer tampon de dissociation ajouter 2,5% de trypsine, la collagénase IV (10 mg / ml), sérum de knock-out (20%) et du CaCl2 (1 mM) à Ca 2+ exempt de PBS. Laver les cellules deux fois avec du PBS et on incube avec du tampon de dissociation pendant 5 min à 37 ° C et 5% de CO 2. Des cellules de transfert dans un tube de 15 ml, centrifuger pendant 5 min à 1200 rpm (300 x g).
    4. Reprendre les cellules iPS porcine dans 500 pi porc fraîche moyen iPS et ajouter 50 ul de la suspension à 1,5 ml de porc moyen iPS dans un endroit frais à 6 puits avec un chargeur-couche MEF. Tous les cellules de lavage de journée, une fois avec du DMEM sans sérum / F-12 et d'ajouter 1,5 ml de jambon de porc fraîche moyen IPS.
  5. Culture de cellules iPS humaines sans chargeur-
    1. Décongeler le flacon d'origine contenant la préparation de la membrane basale à 4 ° C et diluer avec du DMEM sans sérum glacé / F-12 à 8 mg / ml, aliquote et un magasin de Ham à -20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
    2. Décongeler une aliquote de la basement préparation membranaire à 4 ° C et diluer avec du DMEM / F12 de Ham sans sérum glacée (90 ug / ml). Pipet 1 ml de cette solution dans des boîtes de culture de 3 cm et agiter doucement pour assurer que la surface est couverte. Sceller les plats avec du parafilm et conserver à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine. Avant l'utilisation pour la culture de cellules incuber plats pour 30 minutes à 37 ° C ou 3 heures à température ambiante pour permettre la polymérisation de la préparation de la membrane basale.
    3. Aspirer le milieu des plats revêtue de la préparation de la membrane basale et laver deux fois avec du DMEM exempt de sérum / de Ham F-12. Ajouter 1,5 ml de milieu E8 à la boîte de culture et les cellules iPS humaines (10% des cellules d'un plat de confluence). Tous les cellules de lavage de journée, une fois avec du DMEM sans sérum / F-12 et d'ajouter 1,5 ml de milieu de E8 frais de Ham.
    4. Pour le passage des cellules, rincer la vaisselle deux fois avec PBS et ajouter 1 ml de PBS / EDTA 0,5 mM. Incuber les boîtes pendant 5 min à température ambiante. Surveiller les cellules sous un microscope. Remarque: Lorsque les colonies commencent à rassembler et APPEar d'avoir des trous, ils sont prêts pour le transfert.
    5. Aspirer le liquide, ajoutez 1,5 ml de milieu E8 et détacher les cellules par pipetage doucement monter et descendre. Transfert des cellules à un tube de 15 ml, centrifuger pendant 5 min à 1200 rpm (300 x g), remettre en suspension dans 500 pi de milieu E8 et ajouter 50 ul de la suspension à 1,5 ml de milieu E8 dans un plat de culture frais revêtu de la préparation de la membrane basale .

2. Conception de cible séquences entre espèces frontières

  1. Sélectionnez séquences d'ADNc de porc des gènes cibles (GAPDH, NANOG, GDF3) humaine de référence, murin et et effectuer une analyse d'alignement multi-séquence CLUSTAL.
    Note: Ceci indique les séquences homologues entre espèces.
    1. Utilisez les paramètres suivants pour l'alignement multiple: pénalité de gap (fixe) 10, pénalité de gap (variant) 5, la transition pondération 0, plage écart de peine de séparation 8,% d'identité en cas de retard de 40, le nombre maximum d'itérations à effectuer 3.
  2. Proposez séquences cibles souhaitées au fabricant (voir le tableau des matériaux) pour la conception et la fabrication de la sonde.
    Remarque: Le fabricant va alors confirmer la compatibilité de séquence désirée avec la technologie. Si la séquence souhaitée est pas compatible, le fabricant suggère séquences alternatives.
    1. Veiller à ce que des régions homologues qui peuvent être utilisés comme potentiels séquences de capture de brins ont une longueur de 27 pb.
      Remarque: Il est conseillé de commander plusieurs nanoparticules avec différents volets de capture pour un gène cible choisi comme seule l'expérience cellulaire réelle donnera une preuve définitive de la fonctionnalité d'une séquence individuelle. Par conséquent, deux séquences différentes pour GAPDH et GDF3 ont été évalués tandis que trois nanoparticules différentes ont été testées pour évaluer l'expression de NANOG. Leur emplacement et les séquences exactes ont été publiés ailleurs 17. Le fabricant qui produit commercialement le nanoparticles souhaités avec des séquences et leur fournit en format lyophilisé.

3. Reconstitution de nanoparticules et ajout à des cultures cellulaires

  1. Stockez nanoparticules lyophilisées lors de la réception à 4 ° C dans l'obscurité.
  2. Reconstituer nanoparticules par addition de 50 pi d'eau bidistillée qui donne une concentration finale de 100 nM. Une fois reconstitué nanoparticules de magasin à la température ambiante dans l'obscurité. Remarque: Dans cette condition, ils sont stables pendant au moins un an. Stockage des échantillons reconstitués à 4 ° C peut affecter leur stabilité.
  3. Pré-diluer la solution de nanoparticules d'achat d'actions avec du PBS à une concentration de 2 (cellules HEK 293) ou 8 nm (iPS et les cellules ES) sur le jour de la demande. Remarque: Cette concentration est 20 fois plus élevée que la concentration finale dans la boîte de culture. Dans les cellules ES et des cellules iPS, 400 pM de nanoparticules induit un signal fluorescent détectable facilement sous le microscope. Pour les cellules HEK 293, AConcentration de 100 PM est suffisante.
  4. Pipeter 12,5 ul de nanoparticules à une prédilué 237,5 pi de milieu de culture cellulaire complet contenant 24 puits. Pour les puits de différentes tailles, ajuster les volumes en conséquence. Agiter soigneusement la plaque pour assurer une distribution égale des nanoparticules. Incuber les cellules pendant une nuit (O / N) à 37 ° C et 5% de CO2 dans une atmosphère humidifiée.
  5. Le lendemain, l'analyse des cultures de cellules de fluorescence Cy3 spécifique de gène avec une longueur d'onde d'excitation de 546 nm (émission 575 - 640 nm) sous un microscope à fluorescence. Remarque: La durée nécessaire pour obtenir une fluorescence suffisamment forte peut dépendre du type de cellule et le gène cible. Dans ces expériences, il a été vu entre 16 et 20 heures après l'application de la sonde.

4. Identification des populations cellulaires Cy3 positifs par cytométrie en flux

  1. Cultivez HEK 293 ou cellules ES de souris en utilisant les conditions spécifiées dans la section 1.1 ou 1.3, respectively. Un jour avant l'analyse FACS ajouter GAPDH nanoparticules spécifique de différentes concentrations de cellules HEK 293 (voir figure 6A) et à 400 pM murin des cellules ES. Incuber les cellules O / N à 37 ° C et 5% de CO2 dans une atmosphère humidifiée.
  2. Analyser les cultures cellulaires pour la fluorescence Cy3 spécifique d'un gène induite sous un microscope à fluorescence.
  3. Détacher les cellules HEK 293 comme spécifié au point 1.1.2. Centrifugeuse de transférer dans un tube de 1,5 ml et remettre en suspension dans 200 ul de PBS glacé / 0,5% de BSA / (tampon FACS) 2 mM d'EDTA. Gardez cellules sombres sur la glace jusqu'à l'analyse par cytométrie de flux.
  4. Détacher les cellules ES murines comme spécifié au point 1.3.3. Centrifugeuse de transférer dans un tube de 1,5 ml et remettre en suspension dans 200 ul de PBS glacé / BSA à 0,5% / EDTA 2 mM. Gardez cellules sombres sur la glace jusqu'à l'analyse par cytométrie de flux.
  5. Appuyez sur les cellules à travers un filtre de 30 um pour empêcher l'agrégation des cellules et ajouter l'iodure de propidium (concentration finale de 2 ug / ml) 2 minavant l'analyse FACS pour exclure les cellules mortes.
  6. Pour analyser les cellules Cy3-positifs première série portes hiérarchiques sur le FSC-A / SSC-Un sous-ensemble, le FSC-H / FSC-W-sous-ensemble et le sous-ensemble SSC-H / SSC-W. Utilisez l'avant et la diffusion latérale d'exclure les débris cellulaires et les cellules qui ne sont pas dispersés. Exclure les cellules mortes par leur coloration iodure de propidium affichage PE contre PE-Texas Red. Effectuer la porte de tri final sur les cellules positives Cy3-PE (Figure 4).

Résultats

Dans une première tentative de vérifier et d'établir la détection intracellulaire de l'expression de gènes spécifiques dans les cellules vivantes utilisant des nanoparticules nous avons décidé de mener des expériences pilotes en utilisant un gène de la maison de maintien exprimé de façon constitutive (GAPDH) dans des cellules HEK 293 humaines des cellules. La concentration de nanoparticules utilisées dans ces expériences a été choisie en fonction de la recommandation du fabricant. L'ajout d'une sonde spécifique de GAPDH dans le milieu de culture à une finale 100 pM concentration induit une nette Cy3-fluorescence dans ces cellules qui était visible sous un microscope à fluorescence après O / N incubation (figure 5A). Deux témoins ont été inclus dans ces expériences pour justifier le résultat. Une commande comprend d'une soi-disant "scramble" nanoparticule où le brin de journaliste n'a pas une séquence correspondante dans des cellules de mammifères ou eucaryotes. La «ruée» nanoparticules détermine le fond non spécifique fluorescenCE en raison de la dégradation possible de la sonde ou trempe incomplète de la fluorescence. L'ajout de la sonde de brouillage produit un seul signal marginal fluorescent, ce qui est négligeable (figure 5B). Un contrôle en permanence fluorescent "d'absorption" permet de déterminer la capacité des cellules à incorporer les nanoparticules par endocytose qui peut varier entre différents types de cellules. Ces particules de contrôle positif produit un signal fluorescent lumineux dans des cellules HEK 293 (Figure 5C). Ainsi, la faisabilité de la technologie pour enregistrer un signal fluorescent spécifique d'un gène intracellulaire avec un signal d'arrière-plan négligeable a été confirmée. Il faut mentionner que la différence entre le signal d'arrière-plan et la fluorescence spécifique diminue avec le temps. Les arrière-plan augmente en raison de la dégradation ou de sonder trempe incomplète alors que la fluorescence spécifique disparaît progressivement (figure 5D). Les mêmes nanoparticules spécifique de GAPDH ontété testé dans des cultures de fibroblastes primaires de murine, porcine et ovine origine 17. Ces cellules produisent un signal de fond beaucoup plus élevé que les cellules HEK 293 tandis que la fluorescence spécifique de la cible est assez faible, probablement en raison de la relativement faible capacité de prolifération de ces cultures.

Ces expériences pilotes nous ont incités à utiliser cette technologie pour la détection de l'expression du gène de la pluripotence dans iPS dérivées de différentes espèces. A cet effet, NANOG et GDF3 ont été analysés, les deux étant connu pour être exprimé dans des cellules pluripotentes 18. Au début, les cellules iPS dérivées de fibroblastes d'un activateur cardiaque lignée de souris transgénique Nkx2.5 19 bout de la queue ont été étudiés. Pour les deux gènes un signal fluorescent forte a été obtenue (figure 6A) et une fluorescence Cy3-négligeable de la commande de brouillage (données non présentées). Des résultats similaires ont été obtenus sur les cellules iPS humaines et porcine (Figure 6B et C). Surtout, le signal de fluorescence a été limitée aux colonies iPS et n'a pas étiqueter les fibroblastes utilisés comme une couche d'alimentation pour la souris et iPS porcine (voir les flèches sur la figure 6A et C). L'analyse de l'expression du gène NANOG a également révélé que chaque séquence prédite in silico pour être «bon» est enfin fonctionnel. Un des trois dessins d'une NANOG nanoparticules spécifique de induites presque pas de signal fluorescent comparable à celle de la commande de bousculade, malgré un match de séquence de 100% dans des cellules iPS de souris (Figure 6D). Un résultat similaire a été obtenu sur les iPS cellules d'origine humaine et porcine avec cette sonde (données non présentées). Ainsi, les nanoparticules peuvent être utilisés pour détecter l'expression du gène de la pluripotence à travers les espèces frontières tandis que la fonctionnalité de chaque sonde conçue unique doit être évaluée à l'avance.

Les résultats prometteurs de l'in situmarquage des cellules vivantes dans des boîtes de culture cellulaire nous a incités à analyser quantitativement l'expression du gène par cytométrie de flux. À cette fin GAPDH nanoparticules spécifique de ont été ajoutés à des concentrations progressives à HEK 293 monocouches afin de comparer l'efficacité de l'étiquetage au sein de la population de la cellule cible. Comme évalué par microscopie fluorescente une fluorescence Cy3-induite accrue a été observée avec la plus faible concentration par rapport aux cellules qui n'a pas reçu les nanoparticules. Des concentrations croissantes des nanoparticules induit une fluorescence clairement de concentration dépend de cellules HEK 293 situ (figure 7A) dans. Le fait de soumettre ces cellules à une analyse par cytométrie en flux a confirmé l'efficacité de marquage dépend de la concentration. La fréquence des cellules positives Cy3 augmenté de façon significative (plus de sept fois) lorsque la concentration la plus élevée des nanoparticules a été appliquée (figure 7B). Dans d'autres expériences cellules ES de l'cardiaque Nkx2.5activateur de ligne de souris transgéniques 19 ont été utilisés pour analyser l'expression de gènes de pluripotence par cytométrie de flux. Des expériences pilotes avec 400 heures le contrôle de l'absorption positifs obtenus clairement Cy3 colonies positives ES vivants sous le microscope et cytométrie de flux détectés près de 40% de cellules positives Cy3 (Figure 7C). En revanche, comparable aux cellules non traitées d'environ 0,1% des cellules traitées avec la course teinté positive (données non présentées). De même, l'addition de nanoparticules spécifiques pour GAPDH et Nanog GDF3 induit un signal de fluorescence distinct dans les colonies individuelles dans la boîte de culture cellulaire. La fréquence des cellules positives pour Cy3 Gapdh tel que déterminé par cytométrie de flux a été comparable à celle observée pour les deux gènes de pluripotence (Figure 7C). Ce résultat est prévisible que sont également pensés Nanog et GDF3 être exprimé de façon constitutive dans les cellules ES pluripotentes. Ainsi, ces données clairement indiCate que les cellules exprimant un gène particulier peuvent être identifiés par cytométrie de flux analyses, qualitativement et par leur quantité relative.

figure-results-1
Figure 1: Représentation schématique de la structure des nanoparticules. (A) Structure d'une nanoparticule spécifique d'un gène. (B) nanoparticule Scramble (contrôle négatif). (C) L'absorption de nanoparticules (contrôle positif). Adapté de Lahm et al. 17, réimprimé avec la permission de Wiley.

figure-results-2
Figure 2: Application des nanoparticules to Cell Cultures Une solution diluée appropriée de nanoparticules est pipeté simplement dans le milieu de culture.. Après O / N cellules fluorescentes spécifiques du gène incubation sont visibles sous af luorescent microscope.

figure-results-3
Figure 3:. Absorption active des nanoparticules par les cellules par endocytose (a) des cellules engloutissent activement les nanoparticules par endocytose (B) cible ARNm se lie au brin de capture et déplace le journaliste fluorescent..

figure-results-4
Figure 4: Stratégie Gating pour cytométrie de flux. (A) Stratégie pour les cellules HEK 293 Stratégie (B). Pour les cellules ES murines. Les données ont été acquises à l'aide dispositif 1 pour les cellules HEK 293 ou dispositif 2 pour les cellules ES murines et ont ensuite été analysés par un outil logiciel (voir le tableau des matériaux).

/53268fig5.jpg "/>
Figure 5:. Analyse de GAPDH -expression dans des cellules HEK 293 Une nanoparticule spécifique de GAPDH a été ajouté aux cellules à 100 pM (concentration finale) et la fluorescence a été enregistrée après O / N incubation (A) nanoparticules spécifique de GAPDH (B.. ) Scramble (contrôle négatif). (C) Absorption (contrôle positif). (D) Cinétique de bousculade et de contrôle absorption. La fluorescence a été déterminée au moment points indiqués après addition de nanoparticules spécifique de GAPDH. Les barres d'échelle représentent 50 um.

figure-results-5
Figure 6:. Analyse de la pluripotence Gene expression dans des cellules iPS de différentes espèces nanoparticules spécifique pour NANOG ou GDF3 ont été ajoutés aux cellules à 400 pM (conce finalentration) et la fluorescence a été enregistrée après O / N incubation. (a) des cellules iPS murin. (b) des cellules iPS humaines. (C) des cellules iPS porcin. Flèches dans (A) et (C) désignent les cellules de la couche de liaison de fibroblastes non marqué. (D) de fluorescence dans des cellules iPS de souris après addition de la NANOG-conception SF3 nanoparticule. Les barres d'échelle représentent 50 um.

figure-results-6
Figure 7: nanoparticules a marqué des cellules vivantes peuvent être identifiés par cytométrie de flux. (A) Vue au microscope de Cy3 HEK positif des cellules 293 après addition de différentes concentrations de nanoparticules. (B) Fréquence de cellules positives Cy3 déterminées par cytométrie en flux. (C) la coloration directe de murins colonies de cellules ES et la détermination de la fréquence de Cy3 positif cellules. Les nanoparticules ont été ajoutésà une concentration finale de 400 pM. Les barres d'échelle représentent 50 um.

Discussion

Le présent ouvrage décrit l'utilisation de nanoparticules marqué par fluorescence qui permettent l'évaluation fiable de l'expression du gène intracellulaire directement dans les cellules vivantes provenant de différentes espèces de mammifères avec de diverses origines histogénétique sous un microscope à fluorescence. Cette approche présente plusieurs avantages par rapport à d'autres méthodes publiées. Tout d'abord le chercheur ne se limite pas à l'égard de l'une ou l'autre gène cible ou type de cellule. Toutes les méthodes de détection des anticorps en fonction sont limités à un épitope unique. Bien que les balises moléculaires fluorescents peuvent également être conçus pour un large spectre de gènes, cette méthode nécessite la dissociation des cellules et des 15 nucléofection ultérieur. En revanche, l'application de nanoparticules spécifiques d'un gène ne nécessite aucune manipulation de la cellule cible qui engloutit les nanoparticules activement par endocytose. Au cours de repiquage ultérieur des particules d'or quittent progressivement les cellules et la culture peuvent être utilisés dans downstream expériences.

Néanmoins, la technologie a aussi encore quelques limitations. Certains marqueurs sont évidemment pas détectable en raison de leur nature glucidique comme SSEA-1 ou TRA-1-81 20. Actuellement, une large gamme de nanoparticules est disponible dans le commerce. Ces particules ont été pré-testés pour leur fonctionnalité dans des expériences cellulaires. L'objectif de ce travail était de concevoir des sondes personnalisées qui peuvent être utilisés à travers les espèces frontières. En suivant une telle approche ou lors de la conception d'une sonde pour un roman d'un gène cible doit être conscient que la fonctionnalité d'un in silico prédit sonde doit être soigneusement évaluée in vitro. La sonde NANOG-SF3 qui a montré une homologie de 100% à l'homologie de séquence n'a pas fonctionné du tout en NANOG-SF1 avec une base dépareillés dans le murin et la séquence porcine produit un signal de fluorescence agréable. Une autre question se réfère à l'absorption efficace des nanoparticules. Les particules entrentles cellules par endocytose, un processus qui est influencé par la taille des nanoparticules 21, le type de cellule et l'état de différenciation 22 cellulaire et la capacité d'effectuer des phagocytose et macropinocytose 23. La concentration optimale pour obtenir un signal de fluorescence satisfaisant doit être testé pour chaque application individuelle ou lignée cellulaire. À cette fin, la première expérience devrait toujours être l'application de la commande de capture pour évaluer la compatibilité des sondes dans les types cellulaires et conditions de culture avant de passer au-cible spécifique détection de l'expression du gène.

Un point essentiel pour obtenir des résultats fiables lors de l'application de ce protocole à une ligne nouvelle cellule ou population de cellules est l'inclusion de contrôles appropriés. Le contrôle de l'absorption jamais fluorescent fournira une indication des concentrations de nanoparticules qui induiront un signal de fluorescence suffisante de la population de cellules cibles. La fluorescence doit être évaluerd le lendemain que le signal se fanent avec le temps 17. Dans le même temps le contrôle de brouillage sans un homologue dans le génome eucaryote appliqué à une concentration identique doit induire un signal de fond négligeable. Comme un troisième contrôle, il est conseillé d'utiliser une nanoparticule spécifique d'un gène de ménage (par exemple GAPDH, β-actine). Ces nanoparticules servent de témoin positif que l'approche peut être utilisée pour détecter l'expression spécifique du gène dans la population de cellules cible sélectionné. Si ces contrôles révèlent un satisfaisant peut attendre à obtenir des signaux fluorescents spécifiques fiables utilisant des nanoparticules spécifiques pour d'autres gènes cibles. La concentration des nanoparticules peut également être appliqués critique car ils se sont révélés réguler à la baisse la séquence cible 24. Cependant, cet effet requiert concentrations beaucoup plus élevées (5 nm) que les concentrations utilisées dans les expériences présentées ici (400 heures). A cette concentration, le nanoflares ne touchent pas l'ARNm du gène cible ou les niveaux et les concentrations aussi élevées que 2 nM ne nuisent pas à la prolifération des cellules HEK293 et ES murines 17 protéines. En outre, toute une analyse de l'expression du génome n'a pas révélé de changements significatifs dans l'expression du gène 25. Par conséquent, à des concentrations allant jusqu'à 1 nM les nanoflares ne devraient pas présenter des effets indésirables importants.

Une application très prometteuse de cette technologie est la possibilité de marquer une population cellulaire donnée qui est marquée par un gène spécifique. Récemment, des nanoparticules spécifiques de gènes ont été utilisés avec succès pour colorer sélectivement les myocytes ventriculaires en direct 26, sous-populations de 27 cellules de mélanome, des monocytes et des cellules du cervelet 28 29 cultures. De telles populations de cellules marquées par fluorescence peuvent être triés et purifiés par cytométrie en flux des cellules comme vivantes. Dans le domaine de l'oncologie, il est imaginable pour isoler les cellules tumorales métastatiques en direct dans des modèles animauxen fonction de leur expression de CEA, le plus précieux pour la recherche de métastases potentiel promotion des gènes ou des structures cibles. Nous avons récemment montré que les colonies iPS vraiment reprogrammées murins peuvent être identifiées in situ avec Nanog spécifique de nanoparticules à base de l'intensité de fluorescence détectée 17. Par conséquent, l'identification des colonies iPS vraiment reprogrammées peut être effectuée sur des plates-formes à haut débit, qui utilisent la détection de fluorescence et des dispositifs de prélèvement de robot afin d'identifier les colonies les plus prometteurs. Cette technologie semble être approprié dans de nombreux domaines de recherche pour sélectionner les sous-populations cellulaires spécifiques et il semble possible d'appliquer les nanoparticules dans les plates-formes à haut débit. En conclusion, ce protocole représente une nouvelle approche utilisant marqué par fluorescence des nanoparticules qui permet la détection de l'expression génique intracellulaire directement dans les cellules vivantes. Cette technologie peut être un outil précieux pour purifier, développez et davantage de caractèreiser sous-populations cellulaires rares dans de nombreux domaines de recherche.

Déclarations de divulgation

HL a reçu les nanoparticules de Merck Millipore Corporation gratuitement. Tous les autres auteurs ont rien à révéler.

Remerciements

Nous remercions Lynette Henkel pour son excellent soutien dans la réalisation de l’analyse cytométrique en flux. Nous remercions le Dr Don Weldon et le Dr Victor Koong (Temecula, CA) pour la lecture critique du manuscrit et les commentaires utiles. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation allemande pour la recherche, KR-3770-7/1 et KR-3770-9/1 (M. K.), de la Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), de la bourse de recherche Dr. Rusche 2014 de la Deutsche Stiftung für Herzforschung et de la Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.), et le Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A et DZHK B 14-013SE (M. K.).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Milieu DMEM/Ham F12 avec glutamine stableBiochrome GmbHFG4815
Sérum de veau fœtalLife TechnologiesSV30160.03
Pénicilline/Streptomycine (100x)MilliporeA2213
Pyruvate de sodium (100x)Life Technologies11360-039
DMEM à haute teneur en glucose avec glutamine stableBiochrome GmbHFG0435
Mitomycine CRoche10 107 409 001empêche la division cellulaire des MEF MEM
aminés non essentiels (100x)Life Technologies11140-050
b-MercaptoethanolSigmaM3148
Facteur inhibiteur de la leucémie (107 U/ml)MilliporeESG1107facteur de croissance pour les cellules ES et iPS murines, empêche la différenciation
0,25 % Trypsine/EDTA (1x)Life Technologies25200-056détache les cultures cellulaires adhérentes
Sérum knockoutInvitrogen10828-028supplément pour culture cellulaire iPS humaine et porcine
bFGFPeprotech100-18Bfacteur de croissance pour cellules iPS humaines et porcines
Collagénase IVWorthingtonLS004188dissociation des cellules iPS porcines
MatrigelCorning354277surface efficace pour la culture sans feeder de cellules iPS humaines, appelée membrane de préparation basale dans le
milieu E8Stem Cell Technologies05940milieu défini pour la culture sans feeder de cellules iPS humaines sur Matrigel
EDTA 0.5 MInvitrogen15575-038
SondesSmartFlareEMD Millipore CorporationDétection personnaliséede l’expression génique intracellulaire dans des cellules vivantes, appelées nanoparticules dans le manuscrit
Microscope à fluorescenceZeissAxiovert 200M
HeraCell 150i CO2 IncubateurThermo Scientific51026282
Gélatine (de peau de porc)SigmaG6144améliore la fixation des MEF à la surface
Iodure de propidium (1 mg/ml)SigmaP4864marque les cellules mortes dans les analyses cytométriques en flux
BD FACS Aria IlluBecton DickinsonA4544désigné comme dispositif 1 sur la figure 4
NaviosBeckman Coulter775213désigné comme dispositif 2 sur la figure 4
FloJo vX 10.0.7r2Treestarpour l’analyse des données de cytométrie en flux
acides du manuscrit Logiciel

Références

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Liu, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell. 3 (6), 587-590 (2008).
  4. Liao, J., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell. 4 (1), 11-15 (2009).
  5. Luo, J., et al. Generation of leukemia inhibitory factor and basic fibroblast growth factor-dependent induced pluripotent stem cells from canine adult somatic cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1669-1678 (2011).
  6. Bao, L., et al. Reprogramming of ovine adult fibroblasts to pluripotency via drug-inducible expression of defined factors. Cell Res. 21 (4), 600-608 (2011).
  7. Esteban, M. A., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from Tibetan miniature pig. J. Biol. Chem. 284 (26), 17634-17640 (2009).
  8. Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat. Biotechnol. 6 (1), 101-106 (2008).
  9. Maekawa, M., et al. Direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glis1. Nature. 474 (7350), 225-229 (2011).
  10. Marti, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).
  11. Wada, N., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human gingival fibroblasts and periodontal ligament fibroblasts. J. Periodontal Res. 46 (4), 438-447 (2011).
  12. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  13. Singh, U., et al. Novel alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. Rep. 8 (3), 1021-1029 (2012).
  14. Kang, N. -Y., et al. Embryonic and induced pluripotent stem cell staining and sorting with the live-cell fluorescence imaging probe CDy1. Nat. Protoc. 6 (7), 1044-1052 (2011).
  15. Ban, K. B., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons targeting cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128 (17), 1897-1909 (2013).
  16. Seferos, D. S., Giljohann, D. A., Hill, H. D., Prigodich, A. E., Mirkin, C. A. Nano-flares: probes for transfection and mRNA detection in living cells. J. Am. Chem. Soc. 129 (50), 15477-15479 (2007).
  17. Lahm, H., et al. Live fluorescent RNA-based detection of pluripotency gene expression in embryonic and induced pluripotent cells of different species. Stem Cells. 33 (2), 392-402 (2015).
  18. Clark, A. T., et al. NANOG and GDF3 genes are expressed in pluripotent cells and map to chromosome 12p13, a hotspot for teratocarcinoma. Stem Cells. 22 (2), 169-179 (2004).
  19. Wu, S. M., et al. Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart. Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).
  20. Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
  21. Yue, T., Zhang, X. Cooperative effect in receptor-mediated endocytosis of multiple nanoparticles. ACS Nano. 6 (4), 3196-3205 (2012).
  22. Andersson, L. I., Hellman, P., Eriksson, H. Receptor-mediated endocytosis of particles by peripheral dendritic cells. Hum. Immunol. 60 (10), 625-633 (2008).
  23. Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nat. Mater. 13 (2), 125-138 (2014).
  24. Prigodich, A. E., Seferos, D. S., Massich, M. D., Giljohann, D. A., Lane, B. C., Mirkin, C. A. Nano-flares for mRNA regulation and detection. ACS Nano. 3 (8), (2009).
  25. Weldon, D., Williams, Y., Ko, A. Cell sorting based on RNA detection in living cells using SmartFlareTM RNA detection reagents.. , EMD Millipore Application Note. Available from: http://www.emdmillipore.com/ (2013).
  26. Mehta, A., et al. Re-trafficking of hERG reverses long QT syndrome 2 phenotype in human iPS-derived cardiomyocytes. Cardiovasc. Res. 102 (3), 497-506 (2014).
  27. Seftor, E. A., et al. Melanoma tumor cell heterogeneity: a molecular approach to study subpopulations expressing the embryonic morphogen Nodal. Sem. Oncol. 41 (2), 259-266 (2014).
  28. Khare, S., et al. The PYRIN domain-only protein POP3 inhibits ALR inflammasomes and regulates responses to infection with DNA virus. Nat. Immunol. 15 (4), 343-353 (2014).
  29. Kratz, A., et al. Digital expression profiling of the compartmentalized translatome of Purkinje neurons. Genome Res. 24 (8), 1396-1410 (2014).

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

D tection de l expression g niquenanoparticules fluorescentesanalyse de cellules vivantescytom trie en fluxmicroscopie fluorescencesynth se de nanoparticulesd tection d ARNm ciblemarqueurs de pluripotenceincubation de cultures cellulairesquantification de la fluorescence

Articles connexes