Une cellule endothéliale Planar Modèle for Imaging Dynamics Synapse immunologique

Résumé

L’immunité adaptative est contrôlée par des 'synapses immunologiques' dynamiques formées entre les lymphocytes T et les cellules présentatrices d’antigènes. Ce protocole décrit des méthodes d’étude des cellules endothéliales à la fois en tant qu’APC physiologiques sous-étudiées et en tant que nouveau type de « modèle d’APC cellulaire planaire ».

Résumé

L'immunité adaptative est régulée par des interactions dynamiques entre les cellules T et les cellules présentatrices d'antigènes ("APC") appelés «synapses immunologiques». Au sein de ces interfaces cellule-cellule intimes grappes de sous-cellulaire discrètes de CMH / Ag-TCR, la F-actine, l'adhérence et des molécules de signalisation forment et remodeler rapidement. Ces dynamiques sont pensés pour être des facteurs déterminants de l'efficacité et la qualité des réponses immunitaires qui développent et donc de protection contre l'immunité pathologique. La compréhension actuelle des synapses immunologiques avec physiologique APC est limitée par l'insuffisance de la résolution obtenue d'imagerie. Bien que les modèles de substrat artificiel (par exemple, des bicouches lipidiques planes) offrent une excellente résolution et ont été des outils extrêmement précieux, ils sont intrinsèquement non-physiologique et simpliste. Les cellules endothéliales vasculaires et lymphatiques ont émergé comme un tissu périphérique importante (ou stroma) compartiment de 'semi-professional APC ». Ces APC (qui expriment la plupart de la machinerie moléculaire des APC professionnelle) ont la particularité de former surface cellulaire pratiquement plane et sont facilement transfectable (par exemple, avec les journalistes de protéines fluorescentes). Ici une approche de base pour mettre en œuvre les cellules endothéliales comme un roman et physiologique »plane modèle APC cellulaire» pour l'amélioration de l'imagerie et de l'interrogatoire des processus fondamentaux de signalisation antigéniques sera décrit.

Introduction

Les lymphocytes T sont une branche du système immunitaire adaptatif caractérisé par la capacité de reconnaître efficacement antigène peptidique (Ag) lié à complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) à travers leurs récepteurs de lymphocytes T ^(TCR) 1. Lymphocytes naïfs migrent constitutivement et Scan 'Ag cellules présentatrices professionnels »(CPA; par exemple, les cellules dendritiques) dans les ganglions lymphatiques, tandis que les cellules mémoire / T effecteurs doivent pouvoir surveiller efficacement une gamme extrêmement large d'APC et les cellules cibles potentielles dans les tissus périphériques.

D....

Protocole

Toutes les expériences décrites dans ce protocole sont menées avec des cellules T humaines primaires et des cellules primaires humaines disponibles dans le commerce endothéliales (cutanée ou microvasculaire du poumon EC) .Tout protocole de recherche impliquant des sujets humains doit être approuvée par un comité d'examen institutionnel et le consentement éclairé écrit doit être fourni à partir de chaque donneur de sang. Des expériences menées en utilisant ce protocole a été approuvé par la CISR de Beth Israel Deaconess Medical Center.

1. préparation de cellules CD4 ⁺ Th1 humain effecteur / T mémoires

1. Appliquer garrot au bras du donne....

Résultats

Une nouvelle approche de formation d'image en utilisant des cellules endotheliales et en combinant les avantages de résolution du plan modèle de bicouches lipidiques avec la complexité physiologique et la déformabilité des APC professionnelle a été développé (figure 1). La figure 2 donne des exemples de migration typique, le flux de calcium et de la dynamique topologiques observé avec ce approche. En l'absence d'affaissement .......

Discussion

Dans l'ensemble, ce protocole décrit des méthodes pour étudier les cellules endothéliales que i) APC physiologiques peu étudiés et ii) comme un type de «modèle plane APC cellulaire» de roman. En ce qui concerne le premier, il est devenu de plus en plus apprécié que les APC périphérique non-hématopoïétiques (ou «stromales ') jouent des rôles critiques, non redondants (ie, par rapport à hématopoïétique APC) dans l'élaboration de réponses immunitaires adaptatives ^16-18. Parmi ces «semi-profe.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Garrot sans latex extensible BD	Biosciences	367203
BD Tampons imbibés d’alcool	BD Biosciences 326895
BD Vacutainer Safety-Lok	BD Biosciences	367861	K2 EDTA
BD Vacutainer Kit de prélèvement de sang à bouton-poussoir	BD Biosciences	367335
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R8758-1L
Ficoll-Paque	Sigma-Aldrich	GE17-1440-02	Amener à RT avant utilisation
FCS-Optima	Atlanta Biologics	s12450
Pénicilline-Streptomycine	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154-20ML
entérotoxine staphylococcique B	Toxine Technologie	BT202RED	Solution mère 1mg/ml dans la
toxine 1 du syndrome de choc toxique	Technologie	TT606RED	solution mère 1mg/ml dans PBS
IL-15 humain	R& D Systems	247-IL-025	Solution mère 50ug/ml dans PBS
PBS Life	Technologies	10010-049
Fibronectin	Life Technologies	33016-015	Solution mère 1mg/ml dans H20
HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells	Lonza	CC-2543	D’autres EC microvasculaires humains peuvent être utilisés, c’est-à-dire HLMVECs
EGM-2 MV bullet kit	Lonza	CC-3202
Trypsine-EDTA	Sigma-Aldrich	T-4174	Solution mère 10x, diluée dans PBS
amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit	Lonza	vpb1003	Kit requis pour l’étape 4
IFN-g	Sigma-Aldrich	I3265	Solution mère 1mg/ml dans H20
TNF-alpha 10ug,	human Life Technologies	PHC3015	Solution mère 1mg/ml dans H20
sans rouge de phénol HBSS	Life Technologies	14175-103
Hepes	Fisher Scientific	BP299-100
Chlorure	de calcium Sigma-Aldrich	C1016-100G	Solution mère 1M dans H20
Chlorure	de magnésium Sigma-Aldrich	208337	Solution mère 1M dans H20
Albumine sérique humaine	Sigma-Aldrich	A6909-10ml
Immersol 518 F huile d’immersion sans fluorescence	Fisher Scientific	12-624-66A
Fura-2 AM 20x50ug	Life Technologies	F1221	Solution mère 1mM dans DMSO
pEYFP-Mem (Mem-YFP)	Clontech	6917-1
pDsRed-Monomère (Soluble Cytoplasmic DsRed)	Clontech	632466
pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed)	Clontech	632512
pEGFP-Actin	Clontech	6116-1
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Life Technologies	A12379
Solution de formaldéhyde 37 %	Fisher Scientific	BP531-500	Toxique, utilisation de la hotte
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-5ML
; Falcon 15mL Tubes coniques à centrifuger	Fisher Scientific	14-959-70C
Falcon 50mL Tubes coniques	Fisher Scientific	14-959-49A  ;
Flacons traités pour culture tissulaire Falcon T25	Fisher Scientific	10-126-9
; Flacons traités pour la culture tissulaire Falcon T75	Fisher Scientific	; 13-680-65
; Corning Cell Culture Treated T175	Fisher Scientific	10-126-61  ;
Couvre-lamelles en verre  ;	Fisher Scientific	12-545-85  ;	Diamètre 12 mm
; Falcon Plaques de culture tissulaire 24 puits	Fisher Scientific	08-772-1
Plaques Delta-T	Bioptechs	04200415B
Pipettes Pasteur jetables	Wheaton Fisher Scientific	13-678-8D
1,5 ml Tube Eppendorf  ;	Fisher Scientific	05-402-25
; Souris ICAM1 anti-humaine	BD Biosciences	555509
souris HS1 anti-humaine	BD Biosciences	610541
Anti-Human CD11a (LFA-1alpha)	Purified ebioscience	BMS102
Anti-Human CD3 Alexa Fluor® ; 488	ebioscience	53-0037-41
Anti-MHC Classe II anticorps  ;	Abcam	ab55152
Anticorps anti-talin 1	Abcam	ab71333
Anticorps thêta anti-PKC  ;	Abcam	ab109481
phosphotyrosine (4G10 Platinum)	Millipore	50-171-463
Nucleofector II	Amaxa Biosystems		Électroporateur requis pour l’étape 4
Zeiss Axiovert	Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss LSM510  ;	Carl Zeiss MicroImaging
Logiciel Zeiss Axiovison	Carl Zeiss MicroImaging
NU-425 (Série 60) Armoire de sécurité biologique	NuAIRE	Nu-425-600
; Forma STRCYCLE 37 ° ; C, 5 % CO2 Culture cellulaire	Incubateur Fisher Scientific	202370
Centrifugeuse 5810	Eppendorf	EW-02570-02
Hémocytomètre	Sigma-Aldrich	; Z359629	Hémocytomètre Bright-Line
Isotemp Waterbath modèle 202	Fisher Scientific	15-462-2

inactivée par la chaleur PBS