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Article de méthode

A Novel modèle murin de la fistule artério-veineuse échec: la procédure chirurgicale en détail

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DOI :

10.3791/53294

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3 février 2016

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1Department of Nephrology, Leiden University Medical Center, 2Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Leiden University Medical Center, 3Department of Surgery, Leiden University Medical Center, 4Division of Nephrology, University of Cincinnati

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un modèle murin d’insuffisance de la fistule artérioveineuse (FAV) dans lequel une configuration anastomotique cliniquement pertinente est incorporée. Ce modèle peut être utilisé pour étudier la physiopathologie et pour tester d’éventuelles interventions thérapeutiques.

Résumé

La fistule artérioveineuse (FAV) souffre encore d’un nombre élevé d’échecs causés par un remodelage insuffisant et une hyperplasie intimale dont la physiopathologie exacte reste inconnue. Afin de démêler la physiopathologie, un modèle murin d’échec de la FAV a été développé, dans lequel la configuration de l’anastomose ressemble à la situation préférée dans le cadre clinique. Un modèle a été décrit dans lequel une FAV est créée en connectant l’extrémité veineuse de la branche de la veine jugulaire externe au côté de l’artère carotide commune à l’aide de sutures interrompues. Au niveau histologique, nous avons observé des lésions intimales sténosées progressives dans la voie d’éjection veineuse qui sont également observées dans les FAV humaines défaillantes. Bien que cette procédure puisse être techniquement difficile en raison de la petite taille de l’animal, nous avons pu atteindre un taux de réussite chirurgicale de 97 % après une formation suffisante. Le principal avantage d’un modèle murin est la disponibilité d’animaux transgéniques. Compte tenu des différents mécanismes proposés qui sont responsables de l’échec de la FAV, la désactivation des gènes qui pourraient jouer un rôle dans le remodelage vasculaire peut nous aider à démêler la physiopathologie complexe de l’échec de la FAV.

Introduction

Un conduit d'accès vasculaire fonctionnelle est d'une importance vitale pour les patients souffrant d'insuffisance rénale qui dépendent de l'hémodialyse chronique pour rester en vie. La construction d'une fistule artério-veineuse (FAV) est actuellement le meilleur choix pour l'accès vasculaire. Toutefois, des complications liées AVF constituent une cause majeure de morbidité chez les patients sous hémodialyse chronique. Malgré d'importants efforts scientifiques, aucune des approches novatrices pour réduire les complications liées à l'accès AVF a eu pour résultat une amélioration substantielle des AVF durabilité. Une partie de ce progrès décevants concerne compréhension incomplète de la physiopathologie de l'insuffisance de l'accès d'hémodialyse.

Pour élucider la physiopathologie de l'insuffisance d'accès AV, des modèles animaux qui imitent étroitement pathologie humaine sont d'une importance capitale. À cet égard, non seulement les espèces animales, mais aussi le site de l'anastomose, la thérapie anti-coagulatory nécessaire et la durée du suivi après surtensionry devrait être prise en compte 1. Alors que les grands animaux sont les plus appropriés pour les études d'intervention visant à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, des modèles murins ont le plus grand potentiel pour gagner plus de perspicacité dans les mécanismes moléculaires sous-jacents échec d'accès AV en raison de la disponibilité des souris transgéniques. En outre, un grand nombre de souris peut être utilisé à cette fin à des coûts inférieurs par rapport à une plus grande utilisation des animaux.

Le premier modèle murin de défaillance AVF a été décrit en 2004 par Kwei et et al. 2 Dans ce modèle, FAV ont été construits en utilisant l'artère carotide et la veine jugulaire de manière bout à bout à l'aide d'un cathéter intravasculaire. Ce modèle pourrait être utile d'étudier l'adaptation veineuse au début de FAV bien que la configuration de bout en bout et la présence d'un cathéter intravasculaire limitent la validité de ce modèle pour les FAV humaines. Un modèle amélioré AVF a été introduit par Castier et et al. 3 dans lequel l'extrémité del'artère carotide est relié au côté de la veine jugulaire. Cependant, FAV chez les patients sous hémodialyse sont généralement construits par anatomizing l'extrémité d'une nervure sur le côté d'une artère. La configuration exacte de la FAV est une caractéristique essentielle d'un modèle d'accès AV car il détermine le profil hémodynamique l'intérieur du conduit 4. Ce dernier est un important contributeur à la dysfonction endothéliale et le développement ultérieur de l'hyperplasie intimale (IH) 5.

Un modèle murin roman a été récemment mis au point avec une configuration anatomique identique est utilisé chez l'homme 6. Dans ce modèle, AVF sont créés dans C57BL / 6 par anastomose la fin d'une branche de la veine jugulaire externe sur le côté de l'artère carotide commune avec des sutures interrompues. Dans le présent article, nous nous concentrons sur la procédure microchirurgicale de ce modèle afin de faciliter l'utilisation généralisée de ce modèle murin, visant à démêler la physiopathologie complexede l'échec de l'accès d'hémodialyse.

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Protocole

Toutes les expériences ont été approuvés par le comité de protection des animaux de la Leiden University Medical Center.

1. Préparation des animaux et anesthésie

  1. Anesthésier la souris (old 1-3 mois) dans une chambre d'induction de l'anesthésie continue remplie de 3-4% d'isoflurane.
  2. Raser la face ventrale du cou et la partie intérieure de la cuisse gauche à l'aide d'un rasoir électrique et utiliser un morceau de ruban adhésif pour enlever les poils.
  3. Appliquer une pommade oculaire des deux yeux.
  4. Placez l'animal sur la couverture chauffante sur laquelle le masque de ventilation avant est fixé. Fixer la tête au masque de nez à l'aide de ruban adhésif.
    1. Livrer isoflurane à une concentration de 1,5 à 2,0% en utilisant de l'oxygène enrichi ensemble de l'air à l'écoulement suivant: l'air de 0,3 L / min, 100% d'oxygène de 0,2 L / min. Pincer la peau entre les orteils pour évaluer la profondeur de l'anesthésie et ajuster la concentration d'isoflurane si nécessaire.
  5. Fixer l'animal aucouverture chauffante avec du ruban adhésif sur tous les membres qui est fixé à environ 37 ° C dans une position couchée.
  6. Injecter buprénorphine dissous dans du chlorure de sodium (NaCl) 0,9% à une dose de 0,1 mg / kg en même temps que 0,5 ml de NaCl à 0,9% stérile sous-cutanée dans le flanc de l'animal.
  7. Appliquer chlorhexidine teinture 0,5% sur la zone préparée.

Incision de la peau 2.

  1. Placez l'animal sous le microscope avec la tête vers le chirurgien.
  2. Faire une incision longitudinale d'environ 1,5 cm de la ligne médiane ventrale du cou en utilisant une micro ciseaux.
  3. Récupérer les glandes salivaires avec une pince et déplacer la glande salivaire droit crânienne jusqu'à ce qu'il soit partiellement à l'extérieur de la plaie.

3. disséquer et préparer la veine

  1. Identifier et carrément disséquer la branche dorsomédial de la veine jugulaire externe droite complètement de son tissu périvasculaire en diffusant seulementgrand côté et dans la direction du vaisseau sanguin.
  2. Placez une boucle (10,0 suture) autour de la veine disséqué et appliquer un noeud sans le verrouiller.

4. Retrait du muscle sterno

  1. En utilisant des pinces, disséquer carrément le muscle sterno droit de son environnement en diffusant le long de sa frontière. Placer une paire de pinces ouvertes sous le muscle isolé et ligaturer proximale et distale avec une suture à 6,0. Par la suite, exciser le muscle en utilisant un cauterizer.

5. disséquer et préparer l'artère carotide commune

  1. Identifier et disséquer le droit artère carotide commune en utilisant une pince. Placer un fil de suture 6,0 autour de l'artère pour faciliter la manipulation de l'artère.
  2. Appliquer pinces vasculaires distale et proximale que possible.
  3. Faire une incision longitudinale dans le milieu de l'artère d'environ 1 mm à l'aide du micro ciseaux spécialisé.
  4. rincer leartère avec une solution d'héparine [100 UI / ml] jusqu'à ce que le navire est clair de sang.
  5. Mesurer et régler la longueur de l'incision si nécessaire pour correspondre à la largeur de la pince vasculaire [1,1 mm].

6. La ligature de la veine

  1. Appliquer une pince vasculaire proximale de la veine déjà préparé et placer un fil de suture autour de la veine.
  2. Exercer une traction douce caudale à la veine à l'aide d'une pince hémostatique qui est placé sur le fil de suture et ligaturer la veine en direction distale que possible en utilisant le fil de suture 10,0 qui a été placé précédemment.
  3. Couper la veine à l'aide d'un ciseau juste proximale à la ligature.
  4. En utilisant des pinces vasculaires, ouvrir doucement la lumière de la veine et le rincer avec une solution d'héparine [100 UI / ml].

7. Création d'anastomose Partie 1

  1. Branchez la veine de l'artère avec une suture interrompue (10,0) en utilisant 2 noeuds carrés à la position douze heures suivie d'une suture à six o 'la position de l'horloge. Assurez-vous de connecter la veine de l'artère sans lui permettant de tourner autour de son axe. Tournez l'animal afin d'améliorer l'exposition chirurgicale.
  2. Placez un fil de suture autour de la veine et d'appliquer une traction latérale douce en utilisant un hémostatique.
  3. En utilisant les mêmes points séparés, compléter l'anastomose en plaçant environ 3-4 sutures supplémentaires à la face ventrale visible de l'anastomose.

8. L'administration d'héparine

  1. Tournez couverture chauffante à 180 ° et de se concentrer le microscope sur la cuisse gauche.
  2. Identifier la veine fémorale / artère / faisceau nerveux par la recherche d'une structure vasculaire qui court longitudinalement dans la partie médiane de la jambe supérieure et peut être vu à travers la peau. Faire une incision avec le micro ciseaux d'environ 1 cm directement au-dessus de la veine fémorale de manière longitudinale.
  3. disséquer soigneusement le tissu périvasculaire de la veine fémorale et injecter l'héparine à une dose of 0,2 UI / g de poids corporel dans la veine fémorale.

9. Création d'anastomose Partie 2

  1. Retour à la région du cou et retirer le fil de suture qui a été placé autour de la veine.
  2. Placer un fil de suture (6,0) qui passe ensuite en dessous de l'artère carotide, sur la veine et de nouveau en dessous de l'artère carotide. (Figure 1L)
  3. Retirer la pince vasculaire veineuse.
  4. Ensuite, tourner la moitié rempli fistule artério-veineuse 180 ° le long de l'axe de l'artère carotide dans le sens horaire en tordant simultanément les clamps vasculaires et exercer une traction médiane aux extrémités du fil de suture.
  5. Compléter l'anastomose de la même manière que celle décrite dans l'étape 7.2.

10. vasculaire Clamp Enlèvement

  1. Retirez le fil de suture et faire tourner le système vasculaire de serrage de 180 ° dans le sens antihoraire.
  2. Retirer la pince vasculaire distale suivie par la pince vasculaire proximale.
  3. évaluer la perméabilité de l'anastomose en bouchant doucement les voies de drainage veineux avec la pince vasculaires. Dans le cas d'une anastomose de brevet, la section veineuse pré-occlusion élargira de façon pulsatile. Relocaliser la glande salivaire droit à sa position à l'aide des pinces anatomiques originaux.

11. Peau de fermeture et de Soins postopératoires

  1. Fermez la peau de la cuisse avec une suture ininterrompue (6.0).
  2. Fermez la peau du cou avec une suture ininterrompue (6.0).
  3. Retirer l'animal de la couverture chauffante et injecter 0,5 ml de NaCl à 0,9% sous-cutanée.
  4. Placer l'animal dans une cage obscure qui est chauffé avec une lampe chauffante et laisser récupérer complètement. Quand un animal ne récupère pas complètement, assurez-vous qu'il ne souffre pas d'un choc hémodynamique en raison de saignements dans la zone chirurgicale. Rechercher des signes comme un cou enflé et la fuite de sang.
  5. Au bout d'environ 6 heures après la première injection de buprenorphine, injecter une dose unique d'une formulation à libération prolongée de la buprénorphine sous-cutanée à une dose qui est recommandé par le fabricant, afin de fournir une analgésie suffisante pour un montant supplémentaire de 72 heures.

12. La récolte de tissus

  1. Anesthésier l'animal avec un anesthésique-mélange contenant du midazolam (5 mg / kg), de médétomidine (0,5 mg / kg) et de fentanyl (0,05 mg / kg) administrée par voie intrapéritonéale.
  2. Fixer l'animal en décubitus dorsal par l'insertion d'aiguilles à travers les pattes et les joues dans un tapis en silicone non-chauffée.
  3. Faire une incision d'environ 1,5-2,0 cm sur la cicatrice dans le cou avec le micro ciseaux.
  4. Disséquer l'AVF, et placer des fils de suture (6,0) dans le proximal-, artère distale et veineuse sortie voies pour faciliter l'identification.
  5. Évaluer la perméabilité de la FAV comme cela est décrit dans la section 10.3 du Protocole.
  6. Ouvrir la cavité péritonéale en effectuant une laparotomie médiane uchanter la micro ciseaux.
    1. Couper à travers la cage thoracique ventrale gauche et à droite en utilisant une paire de ciseaux à partir caudale dans la ligne médio-claviculaire. L'utilisation d'un micro-ciseaux, sectionner la membrane qui est fixée à la partie centrale de la cage thoracique ventrale et par la suite déplacer cette partie céphalique en utilisant une pince.
    2. Localiser la veine cave inférieure et sectionner avec un micro ciseaux.
  7. Insérez une aiguille de calibre 23 aiguilles dans le ventricule gauche et perfuser avec du PBS à une pression d'environ 100 mmHg jusqu'à ce que le fluide intravasculaire peu près limpide.
  8. Sans retirer l'aiguille, maintenant perfuser avec 4% de formol pendant 10 minutes à une pression d'environ 100 mmHg.
  9. Exciser le AVF par sectionnant les artères et les veines avec le micro ciseaux et le plonger dans une solution de formol O 4% / N.

13. Tissue inclusion et la coupe

  1. Traiter le tissu à la paraffine selon la protoco de la fabricationl. Le protocole appliqué est composée des éléments suivants:
    1. Plongez dans l'éthanol 70% pendant 1 heure à température ambiante. Répéter 2x.
    2. Plongez dans l'éthanol 96% pendant 1 heure à température ambiante. Répéter 2x.
    3. Plongez dans l'éthanol à 99,5% pendant 1 heure à température ambiante. Répéter une fois.
    4. Plongez dans l'éthanol à 99,5% pendant 1,5 heure à température ambiante.
    5. Plongez dans le xylène à 100% pendant 1 heure à température ambiante. Répéter une fois.
    6. Plongez dans l'univers de paraffine pendant 1 heure à 62 ° C. Répéter 2x.
  2. Incluez l'AVF dans de la paraffine de sorte que la voie d'éjection veineuse est orienté perpendiculairement à la cassette intégration.
  3. L'utilisation d'un microtome, la création de 12 sections en série constitués chacun de 30 sections d'une épaisseur de 5 um. Puis de chaque section de série, placer une partie sur un seul verre de montage à partir de la position d'un à douze de façon ordonnée commençant par la zone la plus proche de l'anastomose.

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Résultats

Après la création de l'anastomose (Figure 1), la perméabilité doit être évaluée par l'occlusion peu les voies de drainage veineux avec une pince vasculaires. Lorsque l'anastomose est brevet, l'extrémité proximale de l'appareil vasculaire à l'occlusion doit élargir clairement d'une manière pulsatile. En outre, la perméabilité est confirmée à l'aide de la fluoroscopie proche infra-rouge (NIRF) qui fonctionne effectivement comme une angiographie (Figure 2). ...

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Discussion

L'AVF est considéré comme le talon d'Achille dans le traitement d'hémodialyse. Malheureusement, l'AVF souffre encore d'un nombre élevé d'échec 8-10. Malgré des recherches approfondies sur les mécanismes sous-jacents, la physiopathologie exacte reste inconnue. De nombreux modèles murins de l'échec AVF ont déjà été décrits dans la littérature 2,3,11,12. Cependant, aucun de ces modèles incorporent une extrémité veineuse à la configuration d'anastomose artérielle qui est...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ont rien à révéler.

Remerciements

Cette étude a été financée par une subvention de la Dutch Kidney Foundation (KJPB 08.0003).

Carolien Rothuizen est reconnue pour sa contribution à l’étude. Hoang Pham est remercié pour son aide dans le bilan pathologique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microsocpe de dissectionLeicaM80
ForcepsMedicon07.61.25
Pince vasculaireS& TJFL-3D.2
Pince vasculaireS& TD-5a.2
PinceRobozSS/45
Micro ciseaux Lame de 5 mmOutils de sciences fines15000-08
Microciseaux Lame de 2 mmOutils de sciences fines15000-03
CiseauxMedicon05.12.21
Applicateur de pince 1S& TCAF-4
Pince vasculaire 1S& TB-1V
Applicateur à clip 2BBraunFE572K
Pince vasculaire 2BBraunFE740K
Pince hémostatiqueBBraunBH110
10.0 suturesBBraunG1117041
6.0 suturesBBraun768464
CauterizerOutils de science fine18010-00
Porte-aiguilleMedicon11.82.18
Pommade oculairePharmachemie41821101
Teinture de chlorhexidine 0,5 %Centre médical de l’Université de LeidenNA
HéparineLeo Pharma012866-08
BuprénorphineRB Pharmaceuticals  ;
IsofluranePharmachemie45,112,110
Masque d’anesthésiede Maastrichtsur
MidazolamActavisAAAC6877
DexmedetomidineOrion141-267
FentanylBipharma15923002
Chambre d’induction à anesthésie continueSolutions vétérinairesAN010R
283732 Université mesure

Références

  1. Rotmans, J. I. Animal Models for Studying Pathophysiology of Hemodialysis Access. The Open Urology & Nephrology Journal. 7, 14-21 (2014).
  2. Kwei, S., et al. Early adaptive responses of the vascular wall during venous arterialization in mice. Am.J.Pathol. 164 (1), 81-89 (2004).
  3. Castier, Y., et al. Characterization of neointima lesions associated with arteriovenous fistulas in a mouse model. Kidney Int. 70 (2), 315-320 (2006).
  4. Krishnamoorthy, M. K., et al. Hemodynamic wall shear stress profiles influence the magnitude and pattern of stenosis in a pig AV fistula. Kidney Int. 74 (11), 1410-1419 (2008).
  5. Ene-Iordache, B., Cattaneo, L., Dubini, G., Remuzzi, A. Effect of anastomosis angle on the localization of disturbed flow in 'side-to-end' fistulae for haemodialysis access. Nephrol. Dial. Transplant. 28 (4), 997-1005 (2013).
  6. Wong, C. Y., et al. Vascular remodeling and intimal hyperplasia in a novel murine model of arteriovenous fistula failure. J.Vasc.Surg. 59 (1), 192-201 (2014).
  7. Rekhter, M., Nicholls, S., Ferguson, M., Gordon, D. Cell proliferation in human arteriovenous fistulas used for hemodialysis. Arterioscler. Thromb. 13 (4), 609-617 (1993).
  8. Falk, A. Maintenance and salvage of arteriovenous fistulas. J. Vasc. Interv. Radiol. 17 (5), 807-813 (2006).
  9. Tordoir, J. H., et al. Prospective evaluation of failure modes in autogenous radiocephalic wrist access for haemodialysis. Nephrol. Dial. Transplant. 18 (2), 378-383 (2003).
  10. Dixon, B. S., Novak, L., Fangman, J. Hemodialysis vascular access survival: upper-arm native arteriovenous fistula. Am. J. Kidney Dis. 39 (1), 92-101 (2002).
  11. Yang, B., Shergill, U., Fu, A. A., Knudsen, B., Misra, S. The mouse arteriovenous fistula model. J. Vasc. Interv. Radiol. 20 (7), 946-950 (2009).
  12. Kang, L., et al. Regional and systemic hemodynamic responses following the creation of a murine arteriovenous fistula. Am. J. Physiol Renal Physiol. 301 (4), F845-F851 (2011).
  13. Wong, C. Y., et al. Elastin is a key regulator of outward remodeling in arteriovenous fistulas. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 49 (4), 480-486 (2015).
  14. Kennedy, R., et al. Does renal failure cause an atherosclerotic milieu in patients with end-stage renal disease. Am. J. Med. 110 (3), 198-204 (2001).
  15. Cheung, A. K., et al. Atherosclerotic cardiovascular disease risks in chronic hemodialysis patients. Kidney Int. 58 (1), 353-362 (2000).
  16. Lee, T., et al. Severe venous neointimal hyperplasia prior to dialysis access surgery. Nephrol. Dial. Transplant. 26 (7), 2264-2270 (2011).
  17. Kokubo, T., et al. CKD accelerates development of neointimal hyperplasia in arteriovenous fistulas. J. Am. Soc. Nephrol. 20 (6), 1236-1245 (2009).

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