High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Dépense énergétique Assay

Résumé

Les poissons-zèbres sont un organisme modèle important pour l’étude de l’homéostasie énergétique. En utilisant un indicateur redox sensible au NADH₂, alamar Blue, nous avons mis au point un test qui mesure le taux métabolique des larves de poisson-zèbre dans un format de plaque à 96 puits et peut être appliqué à la découverte de médicaments ou de gènes.

Résumé

Poisson zèbre sont une importante organisme modèle avec des avantages inhérents qui ont le potentiel pour faire un poisson zèbre modèle largement appliqué pour l'étude de l'homéostasie énergétique et l'obésité. La petite taille du poisson zèbre permet des dosages sur les embryons soient menées dans un format de plaque à 96 ou 384 puits, les technologies basées Morpholino et CRISPR promouvoir la facilité de manipulation génétique, et de traitement de la toxicomanie par l'application de bain est viable. En outre, le poisson-zèbre sont idéales pour les écrans avant génétique permettant la découverte de nouveaux gènes. Compte tenu de la relative nouveauté de poisson zèbre comme un modèle pour l'obésité, il est nécessaire de développer des outils qui exploitent pleinement ces avantages. Ici, nous décrivons une méthode pour mesurer la dépense énergétique en milliers de poisson zèbre embryonnaire simultanément. Nous avons développé ensemble une plate-forme de microplaques animal dans lequel nous utilisons des plaques à 96 puits pour isoler chaque poisson et nous évaluer production cumulative NADH _{2 à l'aide} disponible dans le commerce culture cellulaire viabilité rel'agent alamarBlue. Dans poïkilothermes la relation entre NADH ₂ production et la dépense d'énergie est étroitement liée. Cette analyse de la dépense d'énergie crée le potentiel pour cribler rapidement les manipulations génétiques ou pharmacologiques qui modifient directement des dépenses d'énergie ou modifient la réponse à un médicament appliquée (par exemple des sensibilisateurs à l'insuline).

Introduction

La souris est actuellement le modèle prédominant pour la recherche sur l'obésité. Le court intervalle de génération et des outils génétiques disponibles chez la souris ont été inégalée à ce jour. Cependant, le poisson zèbre a aussi un intervalle de génération court (3 - 4 mois) et dépasse même la souris dans la facilité de la manipulation génétique ^1,2. Le poisson zèbre maintient près de 90% des gènes de mammifères, tout en dépassant de loin la souris dans nombre de descendants et le potentiel pour une utilisation dans les écrans génétiques et drogues ^3.

Pour exploiter le potentiel du modèle de poisson zèbre pour les études à l'obésité, les dosages doivent être développées pour étudier les facteurs qui influencent la régulation du poids corporel, y compris les dépenses d'énergie. Comme métabolites sont traités par β-oxydation et l'oxygène du cycle de l'acide tricarboxylique est consommé et ₂ NADH est produit. Ainsi, le NADH ₂ est un indicateur direct du flux de métabolites par l'intermédiaire des voies métaboliques (oxydation) de métabolite. Dans poikilotherms, H ⁺ à travers la fuite la membrane mitochondriale interne, qui découple oxydation de NADH _deux la synthèse d'ATP, est de 4 à 5 fois plus faible que dans les homéothermes ^4. En conséquence, dans NADH poisson zèbre ₂ est très étroitement liée à la production d'ATP par la phosphorylation oxydative. Ici, nous décrivons un essai qui mesure ₂ NADH production larvaire chez le poisson zèbre comme un proxy pour les dépenses d'énergie ^5.

La consommation d'oxygène est l'étalon-or pour mesurer la dépense énergétique. Pourtant, pour profiter au mieux du potentiel de débit élevé de poisson zèbre, les dosages de la dépense d'énergie doivent se prêter à haut débit. Des systèmes de consommation d'oxygène qui dépendent d'une chambre fermée système de circulation sont limitées en débit par le nombre de chambres disponibles ^6. Ouvrir air _consommation d'O 2 / CO ₂ des essais de production ont également été appliqué dans le poisson zèbre ^5,7. Ceux-ci en plein air de 96 puits de la plaque de baseD Systems se prêtent à haut débit. Malheureusement, les échanges gazeux avec l'environnement limite la sensibilité de ces tests. Nous avons récemment publié la demande d'un dosage qui surveille NADH ₂ en utilisant l'indicateur d'oxydo-réduction alamarBlue ^5. Ce dosage permet de surmonter les limitations de débit commun et de la sensibilité de l'analyse de la consommation d'oxygène dans le poisson zèbre.

Le poisson zèbre est en train de devenir un modèle de plus en plus important pour les études de l'homéostasie de l'énergie du corps. En partie parce que le poisson-zèbre se prêtent à utiliser dans les écrans génétiques à terme et de dépistage de drogues. En outre, la manipulation génétique ciblée, y compris effet de choc et knock-in, peuvent être appliquées rapidement. Nous avons précédemment montré que ce dosage peut être combiné avec l'application de la drogue bain et knock-down génétique ou knock-out pour identifier des composés qui modifient les gènes et les ^taux de 5 métabolique. En outre, ce dosage est conçu pour exploiter les avantages inhérents à haut débit pour le poisson zèbre.

Protocole

Remarque: Ce protocole suit les lignes directrices de l'Université de l'Arizona Bureau pour la conduite responsable de la recherche et a été approuvé par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle

1. élevage de poisson zèbre et de l'embryon Entretien

1. Préparer E3 moyen d'embryons ^8. Pour Faire 60x stocks solution, dissoudre 34,8 g NaCl, 1,6 g de KCl, 5,8 g _de CaCl2 ^● 2H _{2 O,} et 9,78 g _de MgCl2 ^● 6H _{2 O dans} 1,95 L ddiH ₂ O. Ajuster le pH à 7,2 en utilisant NaOH et HCl Ajuster le volume à l'aide de 2 L ddiH ₂ O.
2. Pour préparer le milieu de l'embryon 1x E3, dilué 16,5 ml 60x stock de 1 L ddiH20. Ajouter 100 pi de 1% de bleu de méthylène.
3. Reproduction
   1. Maison Homme et Femme couvée stock (7 - 18 mois d'âge) séparément afin de maximiser la fécondité.
   2. Éteignez les lumières 1 - 2 h avant le jour avant les œufs sont souhaitées. Mettre en place l'accouplement (1 mâle et 1 - 2 femelles) dans cdes cages de Rossing ⁹ tels que décrits précédemment. Traverser les cages permettent aux oeufs d'échapper à la prédation de leur passage à travers le fond perforé de l'insert de réservoir dans lequel les poissons adultes sont organisées.
   3. Facultatif:. Pour l'élevage chronométré, (comme cela serait nécessaire pour des études impliquant l'injection morpholino), séparer le poissons mâles et femelles par un diviseur de plastique transparent, retirez ce dans la matinée pour entraîner pose chronométré des oeufs et de la fertilisation. Pour morpholino études, effectuer des calculs de puissance pour évaluer le nombre de poissons embryonnaires requise par traitement. Sans une estimation de l'ampleur de l'effet ou des variations, d'un essai préliminaire peut être exécuté avec une n = 8.
4. Verser les œufs de la cage de passage dans une boîte de Pétri (100 - 150 embryons / 10 cm de boîte de Pétri). Laissez les oeufs de se déposer au fond du plat et versez hors de l'eau. Éliminer toute l'eau restante à l'aide d'une pointe fine transfert jetable pipette. Rajouter moyen E3 de l'embryon fait à l'étape 1.1.
5. Assurez-afboiteux pipette jetable poli pour oeuf avenir et le transfert de poissons. Avec des ciseaux, couper une pipette de transfert jetable graduée au 0,25 ml obtention du diplôme. Pour retirer les bords rugueux, vernis flamme la pointe de coupure sur un bec Bunsen.
6. Maintenir poissons embryonnaires à 4 jours après la fécondation (DPF) à 10 cm des boîtes de Pétri chez le poisson zèbre moyen E3 de l'embryon à 28,5 ^○ C. Deux fois par jour, utiliser une flamme brillant diplômé de transfert jetable pipette pour enlever les œufs non fécondés ou d'embryons morts (aspect blanc opaque). Une fois chaque jour, remplacer moyen d'embryon E3. Décanter moyen d'embryon E3, retirez le liquide restant avec l'aide d'une pointe fine transfert jetable pipette, et rajouter préchauffé (28,5 ^○ C) moyen de l'embryon E3.

2. Préparer Dosage Solution

1. Préparer la solution d'essai, conformément au tableau 1. Solution de dosage de filtre stérile en utilisant un filtre de 0,22 uM. Avant le dosage initiation, réchauffer la solution de dosage stérile dans un ^○ C 28,5bain d'eau.

Ingrédient	% Du total	Volume (pl / 10 ml)
60x E3 embryon moyen	1.667	166,7
Double déminéralisée (DDI) H 2 0	96,233	9623,3
Bleu d'Alamar	1	100
NaOH 400 mM	1	100
DMSO	0,1	10

Tableau 1. Dosage Moyen

3. Effectuer Assay

1. Rincer embryons de poisson zèbre 3 fois avec du milieu de l'embryon E3 filtrée stérile. Mélanger tous les embryons de poisson zèbre viables de l'embrayage dans un bécher. Filtre stérile 75 moyen d'embryons ml E3. En utilisant une pointe fine transfert jetable pipette, REdéplacer autant du milieu de l'embryon E3 à partir des embryons de poisson zèbre que possible. Rajouter 20 ml de milieu d'embryon E3 filtrée stérile. Retirer et remplacer moyen d'embryon E3 3 fois.
2. Planche 1 poisson dans chacun des 93 puits d'une noire 96 puits verso plaque de fond clair. Transférez le poisson embryonnaire à la plaque en capturant individuellement un embryon au sein d'une flamme brillant diplômé en plastique pipette de transfert jetable (étape 1.5) et éjecter délicatement dans le puits. Transfert moyen de l'embryon E3 pris dans le bécher contenant le poisson rincé dans les 3 puits vierges. Cela garantit que les puits à blanc ont été exposés à la même eau exact que les puits qui contiennent du poisson. Les deux puits qui contiennent des poissons et des puits vides devraient être au moins ½ pleine (200 pi) à l'issue de cette étape.
3. Remplacer moyen d'embryon E3 avec une solution d'analyse dans tous les 96 puits, y compris les puits vierges. Cette étape doit être effectuée une colonne à la fois pour chacune des 12 colonnes d'une plaque à 96 puits. En utilisant une pointe fine trans jetablefer pipette, éliminer le milieu de l'embryon E3 de chaque puits dans une colonne de la plaque (8 puits). Prenez soin de ne pas toucher l'embryon de poisson zèbre. Ajouter 300 ul de solution d'essai dans chaque puits à partir de laquelle l'eau a été enlevée. Répéter l'élimination de l'E3 moyen d'embryon et de remplacement avec une solution d'essai à l'ensemble des 12 colonnes de la plaque.
4. Facultatif: Pour tester le changement de taux métabolique en réponse à un composé, faire une solution qui est 100 fois (100X) la concentration de traitement souhaité. Il convient de noter, à ce que la solution ne dépasse pas 100 x 10% de DMSO à limiter la concentration finale en DMSO à pas plus de 0,1%. Ajouter 3 ul de la solution de 100x à chacun des puits de traitement.
   REMARQUE: Effectuer les calculs de puissance pour évaluer le nombre de puits de traitement. Toutefois, sans une estimation de l'ampleur de la réponse ou de modification d'un essai préliminaire peut être exécuté en composé 8 et 8 traités traités avec le véhicule des puits témoins contenant des poissons.
   1. Ajouter 3 pi de contrôle du véhicule au contrôle (pas drutraitement g) des puits qui contiennent des poissons. Pour veiller à ce que la réponse au composé fluorescent est le résultat d'actions dans le poisson, appliquer les traitements médicamenteux et les véhicules à 3 puits à blanc dans une plaque de 96 puits.
5. Lire poissons assiette remplie sur le lecteur de plaque fluorescente avec d'onde d'excitation à 530 nm et une longueur d'onde d'émission à 590 nm.
6. Placer la plaque dans l'incubateur humidifié fixé à 28,5 ^○ C (maintenir la plaque dans l'obscurité tout au long de dosage pour éviter photoblanchiment de la solution de dosage). Le test peut être exécuté pour des durées de temps qui vont de 1 h à 24 h. La durée du test dépend de l'objectif de l'étude. Pour tester la réponse à un composé non stable courte durée d'action courte durée peut être plus approprié. Pourtant, pour les tests de composés stables ou les tests d'effets génétiques, en maximisant la durée de l'essai est préférable d'exploiter les avantages associés au signal cumulatif.
7. A un point de temps pré-déterminé (voir l'étape 3.6 pour aider à déterminer le moment)lire la fluorescence de la plaque de poisson-rempli à nouveau avec les mêmes paramètres que l'étape 3.5.

4. Évaluer le changement relatif de fluorescence associée avec le traitement

1. Calculer changement de fluorescence de chaque puits en soustrayant la fluorescence au temps 0 de la fluorescence à la fin de l'étude. Wells sans poissons (blancs) doivent avoir des valeurs proches de 0, bien en dessous des valeurs de puits qui contiennent des poissons.
   Changement de fluorescence = fluorescence à la conclusion - fluorescence au temps 0
2. Pour déterminer la variation relative de fluorescence, calculer la variation moyenne de la fluorescence pour les puits témoins puis divisent la variation de fluorescence de chaque puits par le changement de la fluorescence moyenne des puits témoins. Fait à noter, les contrôles pourraient être soit des contrôles de véhicules ou des contrôles génétiques.
   

Résultats

Solution de dosage ne ​​pas augmenter la fluorescence en l'absence de poisson embryonnaire (Figure 1). Cependant, le dosage est très sensible à de petits changements dans le taux de métabolisme dans le puits. Un poisson unique dans un puits crée un signal significativement différente de puits à blanc dans les 1 h (P <0,0001). La figure 2 fournit une représentation visuelle des signaux générés par les poissons embryonnaire après 24 heures d'incubation. Aux fins de cette image ...

Discussion

La contamination par des bactéries ou des champignons considérablement limiter l'application de cette analyse. Le bleu de méthylène dans le support d'embryon E3 limite la possibilité d'une contamination fongique. Tout au long de l'embryon cabrait il est essentiel que l'on prend soin de retirer les embryons morts deux fois par jour. En outre, il est indispensable de rincer abondamment les embryons avec le milieu d'embryon de E3 stérile sur le jour de l'analyse initiation. Ces 2 étapes de limit...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
AlamarBlue	Fisher Scientific	10-230-103	Fabriqué par Thermo Scientific
Pipette de transfert jetable à pointe fine	Fisher Scientific	13-711-26	Fabriqué par Thermo Scientific
Fisherbrand Pipette de transfert jetable graduée	Fisher Scientific	13-771-9AM	Fabriqué par Thermo Scientific
Plaques à fond transparent à flancs noirs à 96 puits	Fisher Scientific	50-320-785	Fabriqué par E& Produits K Scientific Inc.