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Article de méthode

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, latéral Septal Nucleus- et le striatum spécifique

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DOI :

10.3791/53303

⸱

18 janvier 2016

 , 
1TARC (Translational Animal Research Center), University Medical Center, JGU Mainz

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit en détail comment transfecter spécifiquement différentes régions du système nerveux central C57BL/6 via électroporation in utero. Ce protocole comprend des instructions détaillées pour les transfections de régions qui se développent dans le cortex, l’hippocampe, le thalamus, l’hypothalamus, le noyau septal latéral et le striatum.

Résumé

L’électroporation in utero est une technique largement utilisée pour la manipulation spatio-temporelle rapide et efficace de divers gènes dans le système nerveux central du rongeur. La surexpression des gènes souhaités est tout aussi possible que les études de perte de fonction médiées par shRNA. Par conséquent, il offre un large éventail d’applications. La possibilité de cibler des cellules particulières dans une zone distincte augmente encore la gamme d’applications potentielles de cette méthode très utile. Pour cibler efficacement des régions spécifiques, il est indispensable de connaître les subtilités, telles que le stade embryonnaire, la tension à appliquer et surtout la position des électrodes.

Ici, nous fournissons un protocole détaillé qui permet une électroporation in utero spécifique et efficace de plusieurs régions du système nerveux central de la souris C57BL/6. En particulier, il est montré comment transfecter des régions qui se développent dans le cortex rétrosplénien, le cortex moteur, le cortex somatosensoriel, le cortex piriforme, le cornu ammonis 1-3, le gyrus denté, le striatum, le noyau septal latéral, le thalamus et l’hypothalamus. Pour cette information sur le stade embryonnaire approprié, la tension appropriée pour le stade embryonnaire correspondant est fournie. Plus important encore, une carte d’angle, qui indique la position appropriée du pôle positif, est représentée. Ce protocole standardisé permet de faciliter l’électroporation in utero efficace, ce qui pourrait également conduire à une réduction du nombre d’animaux.

Introduction

Depuis la première description en 2001 par trois groupes indépendants 1-3 i n utero électroporation est devenu un outil standard largement utilisé pour l'analyse de l'expression des gènes dans le système nerveux central des rongeurs. Par rapport à la génération de souris knock-out, ce qui est, en dépit de l'amélioration continue des techniques, encore temps et d'argent, de consommer les électroporation in utero appels en raison de sa simplicité. Donc, in utero électroporation permet intensité forte rapide et efficace et des études de perte de fonction 4.

Pour transfecter les régions cérébrales, la solution contenant le plasmide chargé négativement est injecté dans un ventricule. Pendant l'impulsion électrique, l'ADN chargé négativement migre vers le pôle positif et, par conséquent la région transfectée peut être sélectionnée simplement en modifiant la position du pôle positif. Il a été démontré fréquemment que de nombreuses régions du système nerveux central peuvent être targeted 3,5-8. Par exemple, des études récentes montrent transfections spécifiques de l'hippocampe, le cortex piriforme ou le striatum 11/09. Cependant, les informations sur les positions appropriées ne sont souvent guère normalisée et ne sont pas toujours faciles à transférer à différentes souches de souris.

Transfection de certaines étapes embryonnaires est loin d'être anodin. De nombreux facteurs influencent doivent être prises en considération lors du choix du set-up pour spécifique électroporation in utero. Tout d'abord, pour la transfection de manière optimale les stades embryonnaires respectifs, les connaissances sur les tensions appropriées est nécessaire. Des tensions élevées diminuent le taux de survie, alors que de faibles tensions réduisent la 2,3,12 de l'efficacité de transfection. Également la taille de la palette de l'électrode joue un rôle crucial, car l'utilisation de palettes d'électrodes qui sont trop grands résultats dans la spécificité réduite ou peuvent causer la mort en raison de l'affection du rythme cardiaque 4,12,13. La appliquéla tension et la taille et la position de la palette d'électrode sont les caractéristiques les plus importantes à considérer, mais il ya aussi d'autres facteurs qui influent sur le résultat de l'électroporation, comme la quantité appliquée de l'ADN-solution.

Nous avons développé un protocole détaillé qui permet transfection rapide et efficace des diverses régions cérébrales de la souris C57BL / 6 12. Dans ce protocole, des informations détaillées sur les tensions à être utilisé et la taille de la palette d'électrode pour une spécificité accrue est fourni. En outre, des informations sur le ventricule à être rempli avec des recommandations pour la quantité de solution de plasmide et la position de l'électrode est fournie. L'indication de l'information de position dans un plan détaillé et la poursuite de la visualisation de ces positions permet spécifique simple et efficace de l'électroporation in utero du cortex rétrosplénial, le cortex moteur, le cortex somatosensoriel, le cortex piriforme, til corne d'Ammon 1-3, le gyrus denté, le striatum, le noyau septal latéral, le thalamus et l'hypothalamus.

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Protocole

Déclaration d'éthique: La manipulation de la souris et les procédures expérimentales ont été menées en conformité avec les directives européennes, nationales et institutionnelles pour les soins aux animaux.

1. électroporation in utero

Remarque: In utero électroporation a été réalisée comme précédemment publiée 12,14. Par conséquent, le procédé est seulement brièvement décrit ci-après (figure 1).

  1. Les préparatifs
    1. Préparer couleur verte solution (contenant 1,5 pCAGGS) rapide sans endotoxine avancée transfection plasmidique-grade comme décrit précédemment 12.
    2. Tirez et broyer (35 ° d'angle) capillaires en verre borosilicate (0,8-0,9 de diamètre) pour les injections.
    3. Stériliser les instruments.
  2. Chirurgie
    1. Administrer des analgésiques (carprofène, 4 mg / kg de poids corporel, SC, dépôt de 24 h) au moins 30 min avant de commencer la chirurgie.
    2. Gardez la longueur del'anesthésie à un maximum de 35-45 min (Phase III - stade de l'anesthésie chirurgicale en fonction de Guedel 15 - maximale 25-30 min).
    3. Anesthésier les souris enceintes chronométrés avec l'isoflurane (induction dans une chambre: 2,8%, la chirurgie par masque: 2,5%). Confirmez l'anesthésie par l'absence de réponse à l'orteil-pincement.
    4. Appliquer une pommade oculaire pour éviter la sécheresse oculaire pendant l'anesthésie.
    5. Stériliser la zone chirurgicale avec 7,5% de solution Providone-iode et couvrir la souris avec de la gaze stérile (humide avec une solution à 0,9% d'alcool benzylique saline) avec seulement la zone chirurgicale exposée.
    6. Couper ouvrir la cavité abdominale avec un scalpel (incision de la peau: 1,5-2 cm, incision musculaire: 1-1,5 cm).
    7. Préserver la cavité abdominale ouverte de sécher en les humectant avec réchauffé solution alcool benzylique saline à 0,9% ou toute autre solution isotonique stérile comme dirigé par le personnel vétérinaire ou un comité.
    8. Extraire soigneusement cornes utérines (en utilisant une pince à anneau, ne touchez pas l'utérus avec le doigts).
  3. L'injection d'ADN et d'électroporation. Remarque: Les détails exacts pour cibler des régions spécifiques sont indiqués à l'article 2.
    1. Injecter lentement la solution d'ADN coloré dans le ventricule, comme indiqué sur la figure 1 et la section 2 par l'intermédiaire des capillaires en borosilicate préparées.
    2. Appliquer la tension appropriée pour le stade embryonnaire correspondant (par exemple., 36-38 V pour E14) par l'intermédiaire d'électrodes spécialisées pince de type platine (cycle de 50 ms d'intervalle longueur, intervalle de pause 950 ms). Les palettes d'impulsion d'électroporation pendant l'application de la tension pour minimiser les dommages de la paroi utérine.
  4. Poster électroporation / soins post-opératoires
    1. Remettre soigneusement les cornes utérines dans la cavité abdominale.
    2. Suturer le muscle et l'incision de la peau séparément.
    3. Laisser reposer la souris sur un dispositif de soutien pour la récupération thermique.
    4. Superviser la souris lors de la récupération (comportement, fourrage etla consommation d'eau), 4 h, 24 h et 48 h après l'opération. Si nécessaire, appliquer analgésiques supplémentaires (carprofène, 4 mg / kg de poids corporel, un dépôt de 24 h) pour plus de 2 jours.

2. La transfection des zones cérébrales spécifiques

Remarque: La position du pôle positif est représenté comme étant l'angle entre la ligne centrale verticale passant par le ventricule rempli avec la solution d'ADN (le ventricule droit ou troisième) et la position du pôle positif. Lors du remplissage du ventricule gauche les positions sont miroir inversé. Sur la figure 4, les positions de la primordial de l'oreille sont représentés, qui fournissent des points de référence importants.

  1. Transfection des aires corticales (figure 2A, Tableau 1).
    1. Effectuer la chirurgie comme décrit dans la section 1.2. Pour l'électroporation in utero de zones corticales utiliser des embryons E14.
    2. Injecter 1,5-2 ul ADN solution contenant de l'ADN de 4 pg dans le ventricule latéral droitpar l'intermédiaire des capillaires en borosilicate préparées.
      1. Positionner soigneusement l'embryon en utilisant une pince à anneau afin qu'il n'y ait pas de vaisseaux visibles au-dessus du site de ponction.
      2. Injecter lentement la solution d'ADN d'environ 0,75 mm à partir de la suture coronale lambdoïde et 0,5 mm latéral de la suture sagittale (figure 3). Assurez-vous que la profondeur d'insertion est de 1,2 mm (E14, mesurée à partir de la paroi utérine). Vérifiez une coloration bleu-vert avec une démarcation nette.
    3. Appliquer la tension via les électrodes de platine pince-type spécialisé (cycle de l'intervalle de longueur 50 ms, intervalle de pause 950 ms).
      1. Utiliser une électrode paddle 3 ou 5 mm.
      2. Utilisez une tension allant de 36 à 38 V.
      3. Placez le centre des électrodes juste antérieures des ébauches oreille.
      4. Pour transfecter les angles rétrosplénial d'utilisation du cortex ° 330-0, pour transfecter le cortex moteur 0-40 ° par rapport à transfecter le cortex somatosensoriel 40 à 95 ° par rapport à transfecterle cortex piriforme de 95 à 110 ° (figure 2A).
    4. Effectuez après électroporation / soins post-opératoires comme décrit dans la section 1.4. Sacrifiez les souris et d'analyser les embryons 4 jours après l'électroporation (E18) comme décrit dans la section 3.
  2. La transfection de l'hippocampe (figure 2B, tableau 1).
    1. Effectuer la chirurgie comme décrit dans la section 1.2. Pour l'électroporation in utero de formation hippocampique utiliser des embryons E15.
    2. Injecter 2 ul ADN solution contenant 4 pg d'ADN dans le ventricule latéral droit via les capillaires de borosilicate préparées.
    3. Appliquer la tension via les électrodes de platine pince-type spécialisé (cycle de l'intervalle de longueur 50 ms, intervalle de pause 950 ms).
      1. Utiliser une électrode paddle 3 ou 5 mm.
      2. Utilisez une tension allant de 38 à 40.
      3. Placer le centre du pôle négatif juste antérieure de l'ébauche de l'oreille et du centre of le pôle positif au milieu de l'ébauche de l'oreille.
      4. Pour transfecter le gyrus denté utilisent des angles de 190 à 210 °, afin de transfecter la corne d'Ammon (CA) 3 210-230 °, pour transfecter l'CA2 230 à 250 °, afin de transfecter la CA1 250-275 ° (figure 2B).
    4. Effectuez après électroporation / soins post-opératoires comme décrit dans la section 1.4. Effectuer une analyse complète après formation hippocampique (après la naissance, p21), comme décrit dans la section 3.
  3. La transfection du noyau septal latéral et le striatum (figure 2C, Tableau 1)
    Remarque: Les angles se chevauchent avec ceux pour la transfection de l'hippocampe. Pour transfecter efficacement le noyau septal latéral et l'hippocampe striatum sans indésirable transfection stades embryonnaires (E12 précédemment) doivent être utilisés.
    1. Effectuer la chirurgie comme décrit dans la section 1.2. Pour l'électroporation in utero du noyau septal latéral et striatum utiliser des embryons E12.
    2. Injecter 1 ul ADN solution contenant 4 pg d'ADN dans le ventricule latéral droit via les capillaires de borosilicate préparées.
    3. Appliquer la tension via les électrodes de platine pince-type spécialisé (cycle de l'intervalle de longueur 50 ms, intervalle de pause 950 ms).
      1. Utiliser une électrode de 0,5 mm.
      2. Utilisez 33 V.
      3. Placez le centre des électrodes au niveau des primordia de l'oreille.
      4. Pour transfecter les angles latéraux utilisation septale noyau 100-170 °, pour transfecter le striatum de 170 à 240 ° (figure 2C).
    4. Effectuez après électroporation / soins post-opératoires comme décrit dans la section 1.4. Sacrifiez les souris et d'analyser les embryons 6 jours après l'électroporation (E18) comme décrit dans la section 3.
  4. La transfection du thalamus et de l'hypothalamus (figure 2D, tableau 1)
    1. Effectuer la chirurgie comme décrit dans la section 1.2. Pour l'en uTero électroporation des thalamus et l'hypothalamus utiliser des embryons E12-E13.
    2. Injecter de 1 à 1,5 solution d'ADN-pi contenant 4 pg d'ADN dans le ventricule latéral (gauche ou droite) par l'intermédiaire des capillaires en borosilicate préparées. Attendez 2-3 min, jusqu'à ce que la solution est diffusée dans le troisième ventricule. Alternativement injecter directement dans le troisième ventricule.
      Note: Ceci augmente la spécificité, mais pourrait provoquer un taux de survie diminué (risque élevé de dommages).
    3. Appliquer la tension via les électrodes de platine pince-type spécialisé (cycle de l'intervalle de longueur 50 ms, intervalle de pause 950 ms).
      1. Utiliser une électrode de 0,5 ou 3 mm.
      2. Utilisez une tension allant de 33 à 35 V.
      3. Placez le centre des électrodes juste derrière les ébauches oreille.
      4. Pour transfecter les angles d'utilisation de 25 à 40 ° thalamus, l'hypothalamus pour transfecter 90-180 ° (figure 2D).
    4. Effectuez après électroporation / soins post-opératoires comme described dans la section 1.4. Sacrifiez les souris et d'analyser les embryons 6 jours après l'électroporation (E18) comme décrit dans la section 3.

3. Fixation Perfusion

  1. Les préparatifs
    1. Chaud paraformaldéhyde 4% (PFA) à 37 ° C.
    2. Remplir une seringue de 50 ml avec du PBS (4 ° C) et une seconde seringue avec réchauffé PFA. Éviter les bulles.
    3. Connecter les seringues à un robinet à trois voies. Branchez la troisième fin à un ensemble de perfusion à ailes (papillon).
    4. Rincer le dispositif de perfusion à ailes avec du PBS.
  2. Perfusion
    1. Profondément anesthésier les souris (enceinte ou postnatale transfectées) avec l'application sous-cutanée de chlorhydrate de kétamine (60 mg / kg) et de xylazine (7,5 mg / kg).
    2. Confirmez l'étape chirurgicale de la tolérance par l'absence de réponse à l'orteil-pincement.
    3. Ouvrir la cavité abdominale juste au-dessous de la cage thoracique.
    4. Découpez soigneusement le diaphragme.
    5. Soigneusement ouvrir la cage thoracique par une coupure sur esite ACH jusqu'à la clavicule.
    6. Insérez le bout du papillon dans la chambre cardiaque gauche (à partir de la pointe du cœur).
    7. Couper l'appendice auriculaire gauche.
    8. Perfuser lentement la souris avec du PBS (environ 10 ml).
    9. Mettez le robinet à trois voies.
    10. Perfuser la souris avec 5-10 ml 4% PFA.
    11. Décapiter la souris en utilisant des ciseaux et de disséquer le cerveau commence à le foramen magnum. Effectuer la dissection comme précédemment publié 16.
    12. Postfixate le cerveau pendant 2 jours dans 4% de PFA. Gardez les cerveaux à 4 ° C dans l'obscurité.

4. immunohistochimie

  1. Générer 70 sections um (par exemple avec un vibratome).
  2. Facultatif: renforcer la fluorescence avec la coloration des anticorps.
    1. Bloquer les sections pour une heure à température ambiante (de 0,1 à 0,2% de Triton X-100, 5% de sérum de chèvre normal)
    2. Incuber O / N avec l'anticorps approprié (anti-GFP, 1: 1000)
    3. Lavez 3-5 Fois avec du tampon phosphate 0,1 M.
    4. Incuber 3-5 h avec l'anticorps secondaire conjugué à de fluorescence approprié (Alexa Fluor 488 conjugué anti-IgG de lapin, 1: 1000).
    5. Facultatif: contre-coloration avec 4-6 diaminodino-phénylindole-2-(DAPI, 0,2 g / ml dans du tampon phosphate 0,1 M) pendant 1 min.
    6. Analyser la fluorescence avec un microscope à fluorescence approprié.

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Résultats

Figure 2, montre des exemples pour le spécifique in utero électroporation des régions en développement dans le cortex rétrosplénial, le cortex moteur, le cortex somatosensoriel, le cortex piriforme, la corne d'Ammon 1-3, le gyrus denté, le striatum, le noyau septal latéral , le thalamus et l'hypothalamus. Les résultats des transfections sont présentés à côté de l'angle recommandé (Figure 2). Pour une meilleure visualisation des angles in vivo la position de...

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Discussion

Ce protocole décrit en détail comment transfecter le cortex rétrospléniel, le cortex moteur, le cortex somatosensoriel, le cortex piriforme, le cornu ammonis 1-3, le gyrus denté, le striatum, le noyau septal latéral, le thalamus et l’hypothalamus des souris C75BL/6. Avec toutes les informations fournies, il s’agit du premier protocole, qui fournit toutes les informations nécessaires pour recréer facilement les transfections de ces régions cérébrales chez la souris C57BL/6. Les publications précédentes ne se concentraient...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Technique soutenu par Melanie Pfeifer et Nikolai Schmarowski (Institut d’anatomie microscopique et de neurobiologie, Centre médical universitaire de Mayence).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
EndoFree Plasmid Maxi KitQIAGEN12362
Fast GreenRoth0301.1
pCAGGSAddgene
capillaires en verre borosilicaté (0,8-0,9 mm de diamètre)Wold Precision Instrument Inc.1B100F-4
Isoflurane (Forene)AbbottPZN 4831850
Carprofène (Rimadyl)Pfizer GmbH: 400684.00.00
pommade pour les yeux (Bepanthen Augen und Nasensalbe)Bayer  ;PZN 01578681
0,9 % alcool benzylique 0,9 % solution salinePharmacie
du Centre médical universitaire de Mayence
gaze (ES-Kompressen)Hartmann407835
stérile 5-0 Perma-Hand Suture en soieEthicon Johnson & JohnsonK890H
Pince à anneau 1/ 1,5 mmOutils de science fine11101-09
Pince à anneau 4,8/ 6 mmOutils de science fine11106-09
Pince à anneau 2,2/ 3 mmOutils de science fine11103-09
Pince Adson-Dentelée droite 12 cmOutils de science fine1106-12
IrisCiseaux-Délicat Droit-Pointu/ Blunt 10 cmFine Science Tools14028-10
Mayo-Stille Ciseaux-Straight 15 cmFine Science Tools14012-15
Dumont #5 Forceps-InoxFine Science Tools11251-20
Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cmFine Science Tools12565-14
Elektroporator CUY21 SC  ;Nepa Gene Co.
FST 250 Stérilisateur à billes chaudesOutils de sciences fines18000-45
Microbroyeur EG-44Narishige
P-97 Micropette PullerSutter Instrument CompanyP-97
Électrodes en platine 650P 0,5 mmNepageneCUY650P0,5
Électrodes en platine 650P 3 mmNepageneCUY650P3
Électrodes en platine 650P 5 mmNepageneCUY650P5
Électrodes en platine 650P 10 mmNepageneCUY650P10
Système d’anesthésieRothacher-Medical GmbHCV-30511-3 Vapor 19.3
Plaque chauffanteRothacher-Medical GmbHHP-1M
Régulateur de température 220V ACRothacher-Medical GmbHTCAT-2LV
Numéro d’approbation

Références

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