Article de méthode

Une alternative simple à injection stéréotaxique pour Brain Knockdown spécifique de miARN

DOI :

10.3791/53307

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26 décembre 2015

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1CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology, New Delhi, India, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), New Delhi, India

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Les microARN jouent un rôle crucial dans le cerveau et sont des cibles potentielles pour la modélisation de la neurodégénérescence. Cependant, il est difficile de perturber les niveaux de miARN en raison de la courte longueur des miARN et de l’inaccessibilité du tissu cérébral. Cette vidéo présente une méthode de conception d’antagomir et d’administration spécifique au cerveau à l’aide d’un neuropeptide chez la souris.

Résumé

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Les microARN (miARN) sont des régulateurs clés de l’expression des gènes. Dans le cerveau, les processus vitaux tels que le neurodéveloppement et les fonctions neuronales dépendent de l’expression correcte des microARN. La perturbation des microARN dans le cerveau peut être utilisée pour modéliser les maladies neurodégénératives en modulant la mort cellulaire neuronale. Actuellement, l’injection stéréotaxique est utilisée pour administrer des agents d’inhibition des miARN à un endroit spécifique du cerveau. Ici, nous discutons des stratégies de conception d’antagonmirs contre les miARN avec des modifications nucléotidiques verrouillées (LNA). Décrire ensuite une méthode d’administration d’antagomirs spécifique au cerveau, uniformément dans différentes régions du cerveau. Cette méthode est simple et largement applicable puisqu’elle permet de surmonter la chirurgie, les blessures associées et la limitation de l’administration locale dans les injections stéréotaxiques. Nous avons préparé un complexe de glycoprotéine du virus de la rage (RVG) peptidique neurotrope pénétrant dans les cellules avec de l’antagomir contre le miARN-29 et injecté à travers la veine de la queue, pour l’administrer spécifiquement dans le cerveau. La conception de l’antagomir incorporait des caractéristiques qui permettent un ciblage spécifique du miARN et la formation de complexes non covalents avec le peptide. L’inactivation du miARN dans les cellules neuronales a entraîné la mort des cellules apoptotiques et des défauts de comportement associés. Ainsi, la méthode peut être utilisée pour des modèles aigus de neuro-dégénérescence par perturbation des miARN.

Introduction

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Les microARN ont émergé comme de nouvelles cibles thérapeutiques en raison de leur rôle universel dans la régulation de l'expression des gènes et de preuve directe de l'implication dans la maladie. MiRNAs sont activement explorées pour leur potentiel en tant que médicament cible 1,2. En outre, dans l'expression des miARN altérations sont associées à plusieurs maladies 3 et simulation de ces changements par une perturbation artificielle d'expression des miARN peuvent être utilisées pour étudier les voies cellulaires impliquées dans la manifestation de la maladie. Livraison spécifique tissulaire de médicaments ciblant miARN est actuellement un défi majeur pour le développement de médicaments à base de miARN. Antagomirs et imite miARN sont des agents prometteurs pour perturber les niveaux de miARN 4-6. Cependant, les caractéristiques spéciales qui améliorent leur spécificité et l'efficacité doivent être intégrées dans la conception des antagomirs avant qu'ils ne puissent être utilisés pour perturbation in vivo d'expression des miARN.

Les microARN sont particulièrement pertinentes comme cibles dans neurodégénérative actuellement incurable et les maladies neuro-développementale. La barrière hémato-encéphalique constitue une restriction à la fourniture de antagomirs dans le cerveau. Injections stéréotaxiques sont largement utilisés dans les modèles de rongeurs pour délivrer des molécules à des endroits précis dans le cerveau 7. Il exige des compétences, d'importants investissements dans l'instrumentation et de l'heure. Injections stéréotaxiques sont envahissantes, implique la chirurgie, provoquer au moins des blessures légères et sont limitées à la livraison locale. L'utilisation de peptides de pénétration de cellules avec une préférence pour les neurones de ciblage peut contrer ces limitations, car ils peuvent être livrés par la voie trans-vasculaire, mais franchir la barrière hémato-encéphalique. Un tel peptide dérivé de la glycoprotéine virus de la rage (RVG), a déjà été utilisé pour délivrer siRNA contre le virus de l'encéphalite japonaise chez des souris 8. Nous avons trouvé que l'utilisation du peptide pour antagomir livraison, miARN peut être efficacement éliminé dans le cerveau de souris 9.

ontenu "> Le deuxième défi majeur de miARN knock-down découle de la petite taille des miARN et la présence d'isoformes de séquences étroitement liés. Nous prenons l'exemple de la MMU-miR-29 famille qui se compose de trois isoformes étroitement liés, miR-29a , b et c. antagomirs sont aussi généralement modifié le long de l'épine dorsale d'augmenter leur stabilité et les rendre résistant à l'attaque par des nucléases. Verrouillé Nucleic Acids (LNA) offrent un autre avantage à ce qu'ils améliorent la stabilité thermique et même conduire à cibler la dégradation au cours et au-delà 10 encombrement stérique. Présentation des modifications tout le long du squelette peut être efficace mais coûteux. Nous avons vu précédemment que des modifications au-delà d'un nombre optimal ne peuvent pas améliorer encore l'efficacité. La conception de l'antagomir implique donc la modification de la antagomir optimale.

Pour le complexe antagomir non covalente avec le peptide neurotrophique, un hepta chargé de l'extension de nona-arginine est utilisé. D-arginineles résidus sont utilisés car ils confèrent une meilleure stabilité car ils ne sont pas sensibles au clivage par des proteases. Hepta à tronçons de nona-arginine Loi sur les agents de pénétration de cellules comme efficaces, même si elles ne confèrent pas de spécificité de type cellulaire. Par liaison covalente du peptide RVG au lieur nona-arginine, un neurotrope, pénétrant dans les cellules peptide a été généré. Les résidus chargés positivement du peptide d'interagir avec le squelette d'acide nucléique chargé négativement, pour former des complexes. Ces complexes peuvent être utilisés pour transfecter efficacement ADN ou d'ARN dans des cellules en culture et in vivo dans les tissus.

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Protocole

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Remarque: Tous les sujets y compris la procédure d'animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel Animaux éthique (AIVE) à l'Institut de Génomique et biologie intégrative, New Delhi (IGIB / AEC / 10/2013). Ce protocole est particulièrement adaptée pour l'administration ciblée de antagomir-29 dans le cerveau et knock-down de miR-29.

1. Stratégie de conception antagomir

  1. Récupérer la séquence miARN mature à partir miRBase 11 (http://www.mirbase.org/).
  2. Récupérez les séquences de membres de la famille liés miRNA en utilisant le lien "Gene famille" dans le dossier de miRBase
    (Http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009).
  3. Inverser compléter la séquence: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html fournit un outil pratique pourinverser séquences complément.
  4. Marquez les positions être modifiés par LNA en utilisant les lignes directrices suivantes:
    1. Choisissez résidus thymine placés 3-4 bases en dehors de la modification de LNA, depuis pyrimidines de LNA sont plus stables que les purines 12.
    2. Choisissez résidus cytosine séparés par 3-4 résidus si l'étape précédente produit moins de cinq modifications.
    3. Prioriser les cinq modifications à l'extrémité 5 'de la antagomir, puisque cela évite la séquence de semences.

Préparation Complexe 2. antagomir-neuropeptide

Note: Ceci est l'étape la plus critique dans le protocole et il a besoin de normalisation. Pour standardiser le protocole tout oligonucléotide marqué par fluorescence (FLO) peut être utilisé à la place du antagomir 9. Les peptides devraient être de haute pureté (qualité HPLC, 98% de pureté) et .Sequences charge de peptide et antagomir sont donnés dans le tableau 1.

  1. Déterminez le nombre de Mode les antagomir à injecter sur la base de la charge molaire de antagomir, sa toxicité et de poids de la souris. Calculer le nombre de moles de peptide à être injecté basée sur rapport de charge molaire de antagomir: peptide.
    NOTE: Normaliser rapport de charge molaire de antagomir: peptide pour la toxicité et la prestation efficace dans le cerveau de la souris. Utilisez différents rapports de charge molaire de l'oligonucléotide marqué par fluorescence: peptide de normalisation. Nous avons constaté que antagomir-29 et de contrôle étaient à la fois toxique à 4microgram / gramme de poids corporel de souris. Antagomir-29 et de contrôle ont été utilisés au poids corporel 2microgram / gramme, mais cette concentration efficace est susceptible de varier pour chaque microARN.
  2. Diluer le peptide et antagomir dans des tubes de microcentrifugation séparer les solutions mères avec le D-glucose stérile à 10% de la concentration finale souhaitée, tel que calculé à l'étape 1.
  3. Maintenir le tube de centrifugeuse avec la solution de peptide sur un vortex à la vitesse de tourbillonnement modéré.
  4. Ajouter 1/3 de l'unntagomir solution dans le tube de solution de peptide, lentement, goutte à goutte, pendant qu'il est bien mélangé sur un mélangeur vortex.
  5. Continuer de mélanger des solutions sur le vortex pendant 1 min suivantes, puis laisser le mélange reposer pendant 1 min.
  6. Répétez l'étape 4 et 5 deux fois de plus à mélanger la solution restante antagomir avec la solution de peptide dans le même tube de microcentrifugation. L'addition lente est critique pour la formation de complexes mono-dispersée qui sont efficaces pour la transfection. Plus rapide peut conduire à l'agrégation des complexes et leur précipitation.
  7. Incuber le complexe pendant 30 min à la température ambiante sans agitation au vortex. Pendant ce temps d'incubation, les souris s'acclimater au laboratoire où les injections seront réalisées.

3. L'injection de la veine caudale Complexe antagomir neuropeptide-

  1. Pour retenir l'animal, placer la souris dans un dispositif de retenue ou decapicone de la bonne taille.
  2. Nettoyer la surface de la queue en utilisant un coton-tige pre-imbibée d'eau tiède (environ 40 ° C). Cela permettra de promouvoir la vasodilatation et accroître la visibilité de la veine.
  3. Approchez la queue avec un petit volume (0,5 à 1,0 cc) seringue à insuline à un angle de 15-20 °. Veillez à ne pas introduire de l'air dans la seringue. Commencez par la partie distale de la queue. Injecter du complexe. Retirer l'aiguille et appliquer un tampon antiseptique directement au site d'injection (environ 5-10 sec) pour arrêter le saignement.
  4. Remplacer la souris dans une cage ventilée individuellement dans le groupe de 3-5, à l'épi de maïs et du papier de soie que l'enrichissement. Ne gardez pas les souris non-injecté et injectés dans la même cage.

4. comportementales Assays

Remarque: Conservez l'intervalle de temps de 3-4 heures entre injection et comportementaux tests pour permettre la récupération après l'injection. Apportez la souris dans une chambre calme. Ne pas déranger les animaux pendant cette période d'acclimatation.

  1. Acclimater la souris vers lanouvelle ambiante pendant 30 min, puis commencer les tests comportementaux suivants. Gardez un espace de 10 min entre chaque test de comportement.
  2. Accrochage postérieur:
    NOTE: Ce test indique un dysfonctionnement du moteur et des troubles neurologiques.
    1. Soulevez doucement la souris en maintenant près de la base de la queue dans le fond clair.
    2. Vérifiez la position des membres postérieurs pour 10-15 sec. Ébrasements de souris de type sauvage membres postérieurs loin de l'abdomen, alors qu'une souris ataxique tend à rétracter un ou les deux membres postérieurs en direction de l'abdomen de plus de 50% du temps mis en suspension 13.
    3. Retour de la souris à la cage
  3. Test de Ledge:
    1. Soulevez doucement la souris en maintenant la queue et le garder sur le rebord d'une cage.
    2. Observez la souris spécifiquement à l'angle de la cage. Souris de type sauvage peut passer facilement les coins sans peur et sans perdre l'équilibre. Souris Ataxique perdre son équilibre, gel ou secoue tout en marchant le long de la corniche de la cage et dans les coins.
  4. dosage pied souris d'impression:
    NOTE: Pour cet essai garder la feuille absorbante prêt, à l'étage d'une piste étroite (~ 70 cm de long, environ 5 cm de large avec ~ 5 cm de hauts murs.)
    1. Maintenez la souris doucement une main et appliquer de l'encre sur les membres postérieurs par une brosse.
    2. Placez la feuille absorbante sur le plancher d'une piste étroite.
    3. Laisser la souris pour marcher ou courir sur une feuille absorbante en ligne droite dans une piste d'un bout à l'autre.
    4. Répétez le processus deux fois de plus avec l'aide de la souris feuille absorbante frais.
    5. Mesurer la distance entre deux étapes consécutives dans le mouvement vers l'avant. Ne pas inclure les premiers et derniers quelques empreintes où l'animal est tout simplement lancer et terminer sa course, respectivement.

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Résultats

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En utilisant la procédure présentée ici, des complexes d'oligonucléotide 50microgram marqué par fluorescence (FLO) et ~ 850microgram RVG peptide de 1:15 rapport de charge molaire (FLO: peptide) ont été préparés et injectés qu'une seule fois par veine de la queue. Complexe de non-neurotrope virus de la rage Matrix (RVM) peptide et FLO a été utilisé comme un contrôle de livraison. Le jour suivant, les souris cerveau et le foie ont été isolés et des suspensions cellulaires simples ont été préparées. Les cellules ont été ob...

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Discussion

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Nous présentons ici une méthodologie largement accessible pour étudier les effets de la modulation des miARN. À l’heure actuelle, la plupart des tentatives de caractérisation in vivo des fonctions des miARN impliquent la création de souris knock-out ou d’un transgénique qui exprime une éponge à miARN. La plupart des miARN, même ceux spécifiques au type de cellule, sont exprimés dans plus d’un organe. Par exemple, les miARN que l’on pensait initialement spécifiques du système hématopoïétique sont également exp...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Nous remercions Souvik Maiti pour son aide dans la conception des antagomirs. Nous remercions également Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey et Bijay Pattnaik pour leur aide avec les méthodes expérimentales. Ces travaux ont été financés par le Conseil de la recherche scientifique et industrielle (BSC0123). HS, MV et RR reconnaissent la bourse du Conseil de la recherche scientifique et industrielle de l’Inde. MAS reconnaît la bourse de la Commission des subventions universitaires, Inde.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Vortex
Resrestraint ou Decapicone
Piste étroite ~70 cm de long, ~5 cm de large avec des murs de ~5 cm de haut.
Réactifs
Oligonucléotides marqués par fluorescence (siGLO)GE Healthcare Dharmacon INCD0016300120
10 % D-glucose
Antagomir-29Exiqonsynthèse personnalisée
Exiqonsynthèse
Neuropeptide RVGG.L.Biochem ( Shanghai) Ltd.synthèse sur mesure>Neuropeptide de pureté 98 %
RVMG.L.Biochem (Shanghai) Ltd.synthèse personnalisée>98 % de pureté
Autre
Coton
Seringues d’insuline
Feuilles absorbantes
Encre
Pinceau
Antiseptique
stérile Antagomir-control personnalisée Eau tiède

Références

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Mots-clés

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