Validation d'un modèle de souris de perturber CLIC complexes de façon spécifique à la cellule

Résumé

Les protéines de l’enveloppe nucléaire jouent un rôle central dans de nombreux processus biologiques de base et ont été impliquées dans diverses maladies humaines. Ce protocole décrit un nouveau modèle murin basé sur Cre/Lox qui permet le contrôle spatio-temporel de la perturbation des complexes LINC.

Résumé

La migration nucléaire et l’ancrage dans les tissus en développement et adultes dépendent fortement de grands assemblages de protéines macromoléculaires appelés complexes LINC du nucléosquelette et du cytosquelette. Ces échafaudages protéiques couvrent l’enveloppe nucléaire et relient l’intérieur du noyau aux composants du cytosquelette cytoplasmique environnant. Les complexes LINC se composent de deux familles de protéines conservées au cours de l’évolution, les protéines Sun et les Nesprins qui hébergent des motifs de signature moléculaire C-terminaux appelés domaines SUN et KASH, respectivement. Les protéines Sun sont des protéines transmembranaires de la membrane nucléaire interne dont le domaine nucléoplasmique N-terminal interagit avec la lame nucléaire tandis que leurs domaines SUN C-terminaux font saillie dans l’espace périnucléaire et interagissent avec le domaine KASH de Nesprins. Les isoformes canoniques de Nesprin ont un N-terminal de taille variable qui se projette dans le cytoplasme et interagit avec les composants du cytosquelette. Ce protocole décrit la validation d’une stratégie de souris transgénique dominante-négative qui perturbe les interactions endogènes SUN/KASH d’une manière spécifique au type de cellule. Notre approche est basée sur le système Cre/Lox qui contourne de nombreux inconvénients tels que la létalité périnatale et les phénotypes cellulaires non autonomes associés aux modèles germinaux d’inactivation du complexe LINC. Pour cette raison, ce modèle fournit un outil utile pour comprendre le rôle des complexes LINC au cours du développement et de l’homéostasie dans un large éventail de tissus.

Introduction

L'enveloppe nucléaire (NE) sépare le nucléoplasme à partir du cytoplasme. Il est composé d'une membrane nucléaire interne et externe (INM et ONM, respectivement) qui se connectent à des pores nucléaires. La lumière délimitée par deux membranes est appelé l'espace périnucléaire (PNS). L'ONM est une extension du réticulum endoplasmique rugueux (ER) et l'INM adhère à la lamina nucléaire, un maillage de l'énergie nucléaire de type V filaments intermédiaires représenté par A et de type B lamines ^1,2. Lieurs du cytosquelette et Nucleoskeleton (CLIC) sont des assemblages macromoléculaires complexes qui couvrent l'ensemble de l'enve....

Protocole

Déclaration éthique: procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Université de Washington à St. Louis.

1. élevage de souris et de génotypage

1. Race Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) souris avec Tg (PCP2-Cre) pour produire des souris Tg ^(PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) ^19,20. Note: Alors que le reste de ce protocole met l'accent sur l'utilisation de la ligne Tg (PCP2-Cre) de la souris pour restreindre EGFP-KASH2 expression aux cellules de Purkinje dans le cervelet, une procédure similaire peut être suivi avec....

Résultats

Ce protocole illustre l'utilité de la (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) Tg modèle de souris pour restreindre EGFP-KASH2 expression à l'aide de cellules cérébelleuses de Purkinje souris Tg (PCP2-Cre). Dans Tg ^(PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) progéniture, le cadre de lecture ouvert LacZ / V5 est excisée à P6 par la Cre recombinase ce qui conduit à l'expression de EGFP-KASH2 spécifiquement ciblées sur les cellules de Purkinje (figure 2A). Comme prévu, EGFP-KASH2 est destiné à l'enveloppe nucléaire, comme indiqu.......

Discussion

L'étape la plus critique pour étudier avec succès le rôle de complexes CLIC in vivo utilise le (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) modèle Tg est d'identifier une ligne appropriée de la souris Cre (s). En effet, si Cre est actif dans d'autres types cellulaires impliqués dans les voies similaires, il peut compliquer l'interprétation des résultats. Par conséquent, il est important d'examiner les cellules voisines, comme illustré ici dans les couches cellulaires et moléculaires granulaires du cervelet

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
10x PBS	Gibco	14200-075
16 % Paraformaldéhyde Solution	Microscopie électronique Sciences	15710
OCT Compound	Tissue-Tek	4583
Lames d’adhésion	StatLab	M1000W
Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9663
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
ImmuEdge Pen	Vector Laboratories	H-4000
Anticorps anti-Calbindin	Sigma Aldrich	C9848
Anticorps anti-EGFP	Abcam	ab13970
Anticorps			Précédemment décrit dans la réf. 21
Montage fluorescent Média	Dako	S3023
2-méthyl butane	Sigma Aldrich	O3551