Validation d'un modèle de souris de perturber CLIC complexes de façon spécifique à la cellule

Summary

Les protéines de l’enveloppe nucléaire jouent un rôle central dans de nombreux processus biologiques de base et ont été impliquées dans diverses maladies humaines. Ce protocole décrit un nouveau modèle murin basé sur Cre/Lox qui permet le contrôle spatio-temporel de la perturbation des complexes LINC.

Abstract

La migration nucléaire et l’ancrage dans les tissus en développement et adultes dépendent fortement de grands assemblages de protéines macromoléculaires appelés complexes LINC du nucléosquelette et du cytosquelette. Ces échafaudages protéiques couvrent l’enveloppe nucléaire et relient l’intérieur du noyau aux composants du cytosquelette cytoplasmique environnant. Les complexes LINC se composent de deux familles de protéines conservées au cours de l’évolution, les protéines Sun et les Nesprins qui hébergent des motifs de signature moléculaire C-terminaux appelés domaines SUN et KASH, respectivement. Les protéines Sun sont des protéines transmembranaires de la membrane nucléaire interne dont le domaine nucléoplasmique N-terminal interagit avec la lame nucléaire tandis que leurs domaines SUN C-terminaux font saillie dans l’espace périnucléaire et interagissent avec le domaine KASH de Nesprins. Les isoformes canoniques de Nesprin ont un N-terminal de taille variable qui se projette dans le cytoplasme et interagit avec les composants du cytosquelette. Ce protocole décrit la validation d’une stratégie de souris transgénique dominante-négative qui perturbe les interactions endogènes SUN/KASH d’une manière spécifique au type de cellule. Notre approche est basée sur le système Cre/Lox qui contourne de nombreux inconvénients tels que la létalité périnatale et les phénotypes cellulaires non autonomes associés aux modèles germinaux d’inactivation du complexe LINC. Pour cette raison, ce modèle fournit un outil utile pour comprendre le rôle des complexes LINC au cours du développement et de l’homéostasie dans un large éventail de tissus.

Introduction

L'enveloppe nucléaire (NE) sépare le nucléoplasme à partir du cytoplasme. Il est composé d'une membrane nucléaire interne et externe (INM et ONM, respectivement) qui se connectent à des pores nucléaires. La lumière délimitée par deux membranes est appelé l'espace périnucléaire (PNS). L'ONM est une extension du réticulum endoplasmique rugueux (ER) et l'INM adhère à la lamina nucléaire, un maillage de l'énergie nucléaire de type V filaments intermédiaires représenté par A et de type B lamines ^1,2. Lieurs du cytosquelette et Nucleoskeleton (CLIC) sont des assemblages macromoléculaires complexes qui couvrent l'ensemble de l'enveloppe nucléaire de se connecter physiquement à l'intérieur du noyau de filaments du cytosquelette et des moteurs moléculaires (Figure 1A). Ils se composent d'interactions entre les motifs conservés qui caractérisent l'évolution, deux familles de protéines transmembranaires intégrante du NE: Sun (SAD1 / Unc84) des protéines et des Nesprins (SPectRINS enveloppe nucléaire). Chez les mammifères, Sun1 et Sun2 are protéines transmembranaires de l'INM dont la région nucléoplasmique N-terminal interagit directement avec A et de type B lamines ^3-5. De l'autre côté de l'INM, dans le PNS, protéines Sun Harbor un tronçon évolutif conservé de ~ 150 acides aminés C-terminal appelé le domaine soleil. SUN domaines interagissent directement avec l'évolution conservé KASH (Klarsicht / Anc-1, Syne homologie) domaine, la signature moléculaire de Nesprins. KASH domaines sont constitués par un tronçon de ~ 30 acides aminés C-terminal qui fait saillie dans le PNS suivi d'un domaine transmembranaire ^6. Au moins quatre gènes distincts (Nesprin1-4 Nesprin) codent KASH contenant des protéines qui localisent au NE ^7. Les régions cytoplasmiques de Nesprins, dont les tailles varient de ~ 50 kDa (Nesprin4) à une étonnante 1.000 kDa (Nesprin1 géant), contiennent spectrine multiples répétitions ainsi que des motifs spécifiques permettant leur interaction avec les composants du cytosquelette tels que l'actine, plectine et moteurs moléculaires ^{8- 13.}

Études chez les vertébrés et les invertébrés ont montré que Lamin / moteurs moléculaires Sun / Nesprin / constituent un "axe" évolutif conservé le contrôle de la migration nucléaire et d'ancrage. Plusieurs modèles de souris knock-out (KO) de CLIC composants complexes ont été décrites et ont contribué à fournir un cadre pour comprendre le rôle des protéines Sun et Nesprin au cours du développement des mammifères NE ^9,14,15. Cependant, ces modèles présentent plusieurs inconvénients importants, et plus particulièrement: 1) difficulté à interpréter phénotypes dues à la cellule des effets non-autonomes, 2) la difficulté de distinguer les contributions phénotypiques de KASH contenant vs KASH-moins Nesprin isoformes ^16, 3) la redondance fonctionnelle des protéines Sun et Nesprin à la NE dans de nombreux types de cellules nécessite des programmes de sélection complexes pour inactiver toutes les interactions SUN-Kash chez la souris ^{17 et} 4) la létalité périnatale de souris déficientes pour le KASH-domaine à la foisNesprins1 et 2 se oppose à l'analyse des phénotypes adultes ^18.

Ce protocole décrit un nouveau modèle de souris conçu pour perturber toutes les interactions SUN-Kash in vivo, dans une cellule de façon autonome et régulée par le développement, contournant ainsi la plupart des inconvénients décrits ci-dessus. Ce modèle de souris Cre / sur la base de LOX-repose sur deux concepts importants: 1) le domaine KASH de toute protéine Nesprin connu est suffisante pour cibler EGFP vers NE dans les systèmes de culture de cellules et 2) les domaines de SUN interagir pêle-mêle avec des domaines KASH, ainsi surexpression de tout domaine KASH va saturer tous les domaines de SUN endogènes et inactiver complexes CLIC de manière dominante négative ¹⁷ (figure 1B). Ce protocole décrit la récolte des tissus et des étapes de traitement utilisées pour confirmer l'interruption de toutes les interactions SUN-Kash dans les cellules de Purkinje du cervelet.

Protocol

Déclaration éthique: procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Université de Washington à St. Louis.

1. élevage de souris et de génotypage

1. Race Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) souris avec Tg (PCP2-Cre) pour produire des souris Tg ^(PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) ^19,20. Note: Alors que le reste de ce protocole met l'accent sur l'utilisation de la ligne Tg (PCP2-Cre) de la souris pour restreindre EGFP-KASH2 expression aux cellules de Purkinje dans le cervelet, une procédure similaire peut être suivi avec un autre Tg (Cre) de la souris ( Figure 2A).
2. Effectuer génotypage pour identifier les chiots abritant deux transgènes EGFP et la CRE comme décrit précédemment ^19.

2. Préparation des matériaux pour la dissection et de tissus Collection

1. Préparez 100 ml de saccharose à 30% dans du PBS (30 g de saccharose / 100 ml de PBS 1x) et conserver à -20 ° C. Le jour de tissu harvesting, dégel et la charge ~ 30-35 ml de solution de saccharose dans une seringue de 35 ml pour les perfusions transcardial.
2. Préparer 40 ml de PFA à 4% dans du PBS (10 ml de 16% de paraformaldehyde et 30 ml de PBS). Charge ~ 30-35 ml de PFA à 4% dans une seringue de 35 ml pour les perfusions transcardial.
3. Remplir un tissu plaque de culture de 10 cm avec 10 ml de PBS pour la dissection de tissus.
4. Préparer un cocktail kétamine / xylazine constitué de 16 mg / ml de kétamine et de 3 mg / ml de xylazine.
5. Préparer une solution d'éthanol à 70% pour la dissection.

3. Dissection et collecte de tissus

1. En utilisant une seringue de 1 ml, 500 pi d'injecter le cocktail de kétamine / xylazine par 25 g de poids corporel et attendre ~ 15 min. Vous pouvez également utiliser une autre méthode de sédation institutionnel approuvé qui est approprié pour le système biologique d'intérêt.
2. Sur la sédation, pincez doucement la patte arrière pour confirmer l'absence de réponse de la douleur, épingler tous les pattes sur un plateau de styromousse avec la face dorsale de lasouris vers le bas.
3. Pulvériser l'abdomen avec 70% d'éthanol et de faire une incision de l'abdomen inférieur vers le haut de la cage thoracique pour avoir accès au cœur.
4. Faire une petite incision dans l'oreillette droite du cœur et insérer la seringue contenant la solution de saccharose à 30% dans le ventricule gauche du cœur.
5. Perfuser la solution à un débit de ~ 2-5 ml par min. Une fois vide, retirer la seringue et répéter avec la solution PFA 4%.
6. Détacher la souris à partir du plateau de styromousse et décapiter pour accéder au cerveau.
7. Retirer la peau autour de la tête de l'animal à l'aide de pinces et ciseaux. Percer un trou dans la partie postérieure du crâne avec une aiguille et retirer délicatement le crâne avec des ciseaux et des pinces à dissection.
8. Une fois que le cerveau est clairement accessible, utiliser une pince pour enlever le cervelet et le placer dans PBS. Couper en deux le cervelet dans le plan sagittal avec un scalpel et le transférer à la solution de saccharose à 30% pendant une nuit à 4 ° C. Remarque: Pour prépsont des coupes en paraffine, fixent le cervelet pendant une nuit à 4 ° C dans 4% de PFA avant l'incorporation de tissu et la coupe.

4. Traitement des tissus et la coupe

1. Préparer une suspension de glace sèche et le butane 2-méthyl. Laisser la température du bain à équilibrer pendant 5 min.
2. Remplissez un cryomoule avec le composé PTOM et placer une moitié du cervelet bissectée dans le moule.
3. En utilisant un microscope de dissection et d'une paire de pince de la position du cervelet de sorte que la surface coupée en deux (près de la ligne médiane du cervelet) est orientée vers le haut.
4. Transférer le cryomoule à la suspension de la glace sèche pendant 5 min jusqu'à ce que l'Ordre a formé composé d'une matrice solide blanc autour de l'échantillon de tissu. Remarque: Les spécimen congelé peuvent désormais être conservés à -20 ° C si nécessaire.
5. Étiquette pré-traitée diapositives de poly-lysine pour la collecte des coupes de tissus et de préparer le cryostat selon les instructions du fabricant afin de recueillir 15 um sections de la Cèrebellum. Pour collecter les sections, contactez attentivement la section PTOM à la face revêtue de la lame de poly-lysine. Afin de préserver l'orientation de la section, ne pas tourner la diapositive lors de cette étape.
6. Coupes de tissus de magasin -20 ° C à jusqu'à procéder à la coloration et l'imagerie.

5. Coloration et imagerie du cervelet Sections

1. Préparer les solutions suivantes avant la coloration de tissus:
   ~ 50 ml de PBS
   ~ 5-10 ml de PFA à 4% dans du PBS
   ~ 10-20 ml de 0,5% de Triton X-100 de sérum d'âne, à 10% dans du PBS
2. Sections cérébelleux dégel. Surtout, minimiser leur exposition à une source de lumière continue et intense pour éviter la décoloration de l'EGFP.
3. En utilisant un stylo de barrière hydrophobe, dessinez un rectangle autour des sections de tissus.
4. Post-fixer les sections avec PFA 4% pendant 5 min. Utilisez assez de liquide pour couvrir l'ensemble de la zone délimitée par la barrière hydrophobe (généralement ~ 500 pi). Aide d'un aspirateur ou d'une pipette, REdéplacer le fixateur en faisant particulièrement attention à ne pas déranger les coupes de tissus.
5. Avec une pipette, appliquer doucement PBS sur la diapositive sans déranger les coupes de tissus. Après 5 min utiliser l'aspirateur ou une pipette pour enlever avec précaution le liquide. Répétez la PBS rincer un total de trois fois.
6. En utilisant une pipette, appliquez soigneusement la dilution appropriée d'anticorps primaires (3 pi Calbindin et / ou d'anticorps Nesprin2 par 900 pi de solution) dans 0,5% de Triton X-100, le sérum de l'âne de 10% dans le PBS. Incuber pendant une heure à la température ambiante dans l'obscurité.
   Remarque: EGFP-KASH2 restera visible par microscopie à fluorescence directe sur des coupes congelées, sans qu'il soit nécessaire d'utiliser un anticorps anti-EGFP. Toutefois, si des sections de paraffine ont été préparés, l'imagerie de l'EGFP-KASH2 nécessite immunodétection avec un anticorps anti-EGFP.
7. Retirer la solution d'anticorps et rincer avec du PBS à trois reprises.
8. Préparation 1: 1000 d'anticorps secondaire dilutions Alexa Fluor-0,5 en% de Triton X-100,10% de sérum de âne dans PBS et de stocker dans l'obscurité.
9. Retirez délicatement le rinçage final PBS et appliquer la dilution d'anticorps secondaire pendant une heure dans l'obscurité.
10. Retirer la solution d'anticorps secondaire, rincer et laver la section trois fois. Si nécessaire, appliquer un colorant nucléaire, tels que le DAPI (~ 300 nM), au cours de la première application du PBS.
11. Supprimer complètement la solution de PBS à partir autour du tissu et le lieu ~ 5-7 pi de milieu de montage sur la section de tissu. Placez une lamelle de verre sur le dessus de la section de tissu et mettre de côté pour ~ 15-30 min à température ambiante dans l'obscurité.
12. Utilisation d'un microscope à fluorescence équipé des filtres appropriés pour visualiser EGFP ainsi que d'autres longueurs d'onde appropriées pour les anticorps secondaires utilisés dans les étapes 5.8 / 5.9. Dans tranches de cervelet, utilisez un objectif 20X pour voir jantes nucléaires EGFP-KASH2.

Results

Ce protocole illustre l'utilité de la (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) Tg modèle de souris pour restreindre EGFP-KASH2 expression à l'aide de cellules cérébelleuses de Purkinje souris Tg (PCP2-Cre). Dans Tg ^(PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) progéniture, le cadre de lecture ouvert LacZ / V5 est excisée à P6 par la Cre recombinase ce qui conduit à l'expression de EGFP-KASH2 spécifiquement ciblées sur les cellules de Purkinje (figure 2A). Comme prévu, EGFP-KASH2 est destiné à l'enveloppe nucléaire, comme indiqu...

Discussion

L'étape la plus critique pour étudier avec succès le rôle de complexes CLIC in vivo utilise le (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) modèle Tg est d'identifier une ligne appropriée de la souris Cre (s). En effet, si Cre est actif dans d'autres types cellulaires impliqués dans les voies similaires, il peut compliquer l'interprétation des résultats. Par conséquent, il est important d'examiner les cellules voisines, comme illustré ici dans les couches cellulaires et moléculaires granulaires du cervelet

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
10x PBS	Gibco	14200-075
16 % Paraformaldéhyde Solution	Microscopie électronique Sciences	15710
OCT Compound	Tissue-Tek	4583
Lames d’adhésion	StatLab	M1000W
Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9663
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
ImmuEdge Pen	Vector Laboratories	H-4000
Anticorps anti-Calbindin	Sigma Aldrich	C9848
Anticorps anti-EGFP	Abcam	ab13970
Anticorps			Précédemment décrit dans la réf. 21
Montage fluorescent Média	Dako	S3023
2-méthyl butane	Sigma Aldrich	O3551