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Article de méthode

Le bm12 inductible modèle du lupus érythémateux disséminé (SLE) dans C57BL / 6

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DOI :

10.3791/53319

⸱

1 novembre 2015

 , 
1Division of Immunobiology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center and University of Cincinnati College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Le transfert de lymphocytes bm12 chez un receveur C57BL/6 est un modèle établi de lupus érythémateux disséminé. Nous décrivons ici comment initier une maladie à l’aide de ce modèle et comment caractériser les cellules auxiliaires folliculaires T, les cellules B du centre germinatif et les plasmocytes par cytométrie en flux.

Résumé

Le lupus érythémateux disséminé (LED) est une maladie auto-immune aux manifestations cliniques et immunologiques diverses. Plusieurs modèles animaux spontanés et inductibles reflètent des composantes communes de la maladie humaine, y compris le modèle de transfert bm12. Lors du transfert de splénocytes bm12 ou de lymphocytes T CD4 purifiés, les souris C57BL/6 développent rapidement de grandes fréquences de cellules T auxiliaires folliculaires (Tfh), de lymphocytes B du centre germinatif (GC) et de plasmocytes suivis de niveaux élevés d’anticorps antinucléaires circulants. Étant donné que ce modèle utilise des souris sur un fond C57BL/6 pur, les chercheurs peuvent rapidement et facilement étudier la progression de la maladie chez les souches de souris transgéniques ou knock-out dans un laps de temps relativement court. Nous décrivons ici des protocoles pour l’induction du modèle et la quantification des cellules Tfh, des cellules B GC et des cellules plasmatiques par cytométrie en flux multicolore. Il est important de noter que ces protocoles peuvent également être utilisés pour caractériser la maladie dans la plupart des modèles murins de LED et identifier les lymphocytes Tfh, les lymphocytes B GC et les plasmocytes dans d’autres modèles de maladies.

Introduction

Le lupus érythémateux disséminé (SLE) est une maladie auto-immune complexe caractérisé prototypiquement par l'anticorps anti-nucléaire (ANA) et de la production glomérulonéphrite. De nombreux autres séquelles, y compris dermique, cardio-pulmonaire, et des lésions hépatiques sont associés à la maladie chez certains individus. Les estimations de prévalence aux États-Unis varient considérablement, de 1,2 150,000-1,500,000, avec incidence particulièrement élevée chez les femmes et les minorités 3. Bien que l'étiologie de la SLE a été difficile à discerner, il est pensé pour résulter de l'interaction de divers facteurs génétiques et environnementaux, qui culminent dans l'auto-immunité systémique.

De nombreux modèles animaux ont été utilisés pour étudier les facteurs menant à l'apparition et la progression de la maladie. Des modèles de souris classiques de SLE comprennent des souches de souris génétiquement prédisposées, y compris le modèle NZB x NZW F1 et ses dérivés NZM, la souche / lpr MLR, et la souche BXSB / Yaa et systèmes inductibles, tels que le pristane et la maladie chronique du greffon contre l'hôte (cGVHD) 4 modèles. Les premiers rapports de la production d'auto-anticorps dans des modèles de GVHD utilisés souches de souris différentes souches ou de hamster pour parent dans les transferts de F1 5 - 8; méthodes les plus courantes utilisées pour étudier la maladie lupique comprennent actuellement les DBA / 2 → parent (C57BL / 6 x DBA / 2) F1, et le modèle de transfert de bm12 décrit ici. Chaque modèle a ses propres mises en garde, mais ils partagent en général un ensemble commun de caractéristiques qui sont en corrélation avec des caractéristiques cliniques de la maladie humaine. Les paramètres les plus souvent rapportés chez les souris modèles comprennent une splénomégalie, lymphadénopathie, la néphrite, la production ANA, et au niveau cellulaire, l'expansion des cellules T folliculaires auxiliaires (TFH), germinales cellules centre (GC) de B et les cellules plasmatiques.

Le modèle BM12 inductible est réalisé par le transfert adoptif de lymphocytes à partir de IA BM12 B6 (C) - H2 - Ab1 BM12 / KhEgJ (BM12) chez la souris, une souche identical de souris C57BL / 6 à l'exception de 3 substitutions d'acides aminés sur le CMH de classe II, en IA b / 6 (B6) des souris C57BL. Alloactivation des donateurs cellules T CD4 par bénéficiaire APC conduit à cGVHD avec des symptômes ressemblant étroitement SLE. Plus précisément, ils comprennent l'expansion de Tfh donateurs dérivés, l'expansion des cellules B GC bénéficiaires dérivés et les cellules plasmatiques, et la production d'Anas y compris les anti-ADN double brin, anti-ADNsb, anti-chromatine, et des anticorps anti-RBC 9. Au fil du temps, les souris receveuses développent glomérulonéphrite associée à des dépôts d'IgG dans le glomérulaire, interstitielle, et les régions vasculaires des reins 10. Nous avons récemment montré que, comme dans la maladie humaine, il y a également un rôle critique pour les IFN de type I dans 11 ce modèle. Notamment, les critères de définition des SLE humaine incluent le développement de la néphrite compatible avec SLE en présence d'anticorps anti-ADN anticorps 12, qui sont tous deux traits saillants de ce modèle de souris.

Il n'y a en soisieurs avantages du modèle de bm12 sur les modèles spontanés. Modèles classiques qui développent des signes SLE spontanément reposent sur soit des souches de souris hybrides, des souches de souris consanguines pas sur le fond de B6, ou grande loci génétiques sur le fond de B6, qui font traversant au coup de grâce ou de souris autrement génétiquement modifié difficile et fastidieux. Avec le modèle inductible de bm12, des souris génétiquement modifiées peuvent servir soit donneur ou du receveur, qui permet une identification plus rapide du compartiment cellulaire dans lequel des gènes particuliers peuvent être importants pour la maladie. En outre, le développement de la maladie dans le modèle de bm12 est beaucoup plus rapide, ne nécessitant que deux semaines jusqu'à l'apparition d'Anas, contre plusieurs mois pour les modèles les plus spontanées. En outre, à la différence des modèles spontanés qui développent la maladie à différents points dans le temps, le début et la progression de la maladie dans le modèle d'→ B6 BM12 est fortement synchronisés. Cela permet la génération de cohortes de taille appropriée qui peut Be utilisé pour les stratégies d'intervention ou thérapeutiques à tout stade de développement de la maladie.

Ce qui suit est un protocole détaillé pour initier SLE auto-immunité par le transfert adoptif de lymphocytes BM12 dans souris C57BL / 6, ou des variantes génétiques sur le fond de B6. En outre, nous décrivons un protocole de coloration par cytométrie de flux pour dénombrer Tfh, GC cellules B, les cellules plasmatiques et les types de cellules associées à la maladie humaine. Fait important, ces protocoles peuvent également être utilisés pour caractériser la plupart des maladies dans les modèles murins de lupus et identifier Tfh, les cellules B GC et les cellules plasmatiques dans d'autres modèles de maladie.

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Protocole

Travaux d'animaux a été réalisée dans des conditions exemptes d'organismes pathogènes spécifiques conformément aux lignes directrices établies par l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des animaux de laboratoire Care International et notre institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC).

NOTE: Incorporer des souris exprimant un marqueur congéniques CD45.1 tels que le donateur ou animaux receveurs si possible, car cela permet à la surveillance de l'efficacité de greffon du donneur et l'expansion spécifique de la population T CD4 de la cellule donneuse. Si vous envisagez l'utilisation de souris génétiquement modifiées autrement que donneurs ou des receveurs, assurer la souche est correctement rétrocroisé à l'arrière-plan de B6, ou cellules transférées peut être rejetée-ce sera abordée plus en détail dans les sections des résultats représentatifs et de discussion.

REMARQUE: Les procédures volumes suivants de détail pour la récolte 4 donateurs bm12 souris, qui devrait produire suffisamment de cellules pour injecter 12-16 souris. Sixà douze souris BM12 semaine-vieille produirait environ 100 à 140000000 lymphocytes avec environ 25% des cellules T CD4. Si le démarrage avec des nombres différents de souris, ou des souches de souris différentes, les volumes à l'échelle vers le haut ou vers le bas en conséquence. C57BL / 6 donnent généralement des rendements similaires avec près de 20% seulement des cellules T CD4.

REMARQUE: Effectuez toutes les étapes à la température ambiante et utiliser les médias RT pour éviter un choc de chaleur et de froid, qui peut nuire à la viabilité des lymphocytes à long terme. Effectuer tissu-récolte et des mesures de traitement des tissus dans une hotte de culture tissulaire en utilisant une technique aseptique. Tous les médias de ce protocole est IMDM avec 10% de FBS inactivé à la chaleur, sauf indication contraire, et sera appelée simplement "des milieux complets."

1. nouvelle méthode pour le génotypage bm12 Souris

REMARQUE: Un protocole basé sur digest brève restriction pour le génotypage est fourni ici, comme une alternative simple et peu coûteux de séquençage, qui est actuellement la seule méthode de génotypage publiépour ces souris.

  1. Isoler l'ADN génomique à partir de queues de souris. S'il vous plaît se référer à un article précédent JoVE pour les protocoles détaillés sur queue de souris écrêtage et la génération de l'ADNc de la queue digère 13.
  2. Effectuer une réaction en chaîne de polymérisation de la transcriptase inverse (PCR) 14 pour amplifier un fragment d'ADN de 474 pb commune du CMH-II b IA et IA bm12 utilisant des amorces et des conditions de thermocyclage énumérés dans le tableau 1.
  3. Effectuer digestion de restriction sur ~ 7 pl du produit PCR en utilisant l'enzyme PsuI, ou un de ses isoschizomères (BstX2I, BstYI, MflI ou XhoII), qui coupe IA b type sauvage, mais pas IA bm12 mutant. Suivre digérer protocole fourni par le fabricant, qui détermine un mélange d'eau, un tampon et de l'enzyme, et une incubation de 5 min. à plusieurs heures à 37 15 ° C.
  4. Chargez digérer produit et courir sur gel de polyacrylamide de 1% avec du bromure d'éthidium 14 pendant 30-45 min. au 150V-si paramètres de tension et de temps optimales varient en fonction de l'appareil de PCR gel utilisé. Visualiser les bandes d'ADN avec un illuminateur UV. Les résultats représentatifs sont présentés sur la figure 1.

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Figure 1. Représentant bm12 résultats du génotypage.
Pour identifier les souris homozygotes pour IA bm12 / BM12, l'ADN de queue a été criblée pour bm12 par PCR / restriction digérer génotypage (étape 1). Type sauvage homozygote (IA b / b) l'ADN donne deux bandes à 227 et 247 pb (visualisés comme une bande épaisse à ~ 250 pb); bm12 homozygote (IA bm12 / BM12) rendements d'ADN d'une bande à 474 pb; et hétérozygote (IA bm12 / b) l'ADN donne deux bandes à ~ 250 et 474 pb. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. récolte donateursCellules

  1. Souris Sacrifice donateurs utilisant institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC) CSEh méthodes d'euthanasie primaires et secondaires. Par exemple, des souris euthanasie par asphyxie au CO2, suivie par dislocation cervicale.
  2. En utilisant une technique aseptique, les rates de récolte et les ganglions lymphatiques (cervical superficiel, mandibulaire, brachiale, axillaires, mésentériques, et inguinal) en tubes de 15 ml contenant 10 ml de milieu complet en tant que 11 à 13.
    REMARQUE: Se reporter aux rapports précédents pour les protocoles noeud de dissection lymphatiques détaillée 16 - 18. Ce modèle est également réussie en utilisant des splénocytes de souris seulement pour le transfert, mais l'ajout de ganglions lymphatiques réduit de manière significative le nombre requis de souris donneuses.
  3. Générer une suspension monocellulaire en écrasant les tissus lymphoïdes collectés à l'étape 2.2 à 70 um tamis de cellules en utilisant le piston d'une seringue. Pour de meilleurs rendements, ne surchargez pas les crépines d'utilisation ~ 6 passoires pour toutes les 4souris traitées, et rincer crépines fréquemment pendant le traitement. Combinez les tissus à partir de 4 souris en deux tubes de 50 ml coniques, puis centrifuger les cellules pendant 5 min à 400 g et décanter le surnageant.
  4. Resuspendre les cellules des deux tubes coniques de 50 ml de médias complètes et transfert à nouveau tube conique. Gardez ce tube à température ambiante.
    REMARQUE: Fat adhère aux parois du tube, et si le tube est pas remplacé, les rendements cellulaires finales peut souffrir.

3. donateurs Décompte Cellulaire

NOTE: Pour préserver la viabilité lyse plus élevé, de globules rouges (RBC) de l'ensemble de l'échantillon est déconseillée.

  1. Mélanger suspension cellulaire unique de l'étape 2.4 ainsi, retirer 1 ml et le transférer à un 50 ml conique séparée. Mettez de côté restant, des cellules intactes (49 ml) à la température ambiante tout en comptant.
  2. Ajouter 3 ml d'un tampon de lyse des cellules de sang rouge à base de chlorure d'ammonium dans l'échantillon de 1 ml de cellules du donneur. Mélanger doucement pendant 1 min. en basculant, puis remplissez à 50 ml avec un milieu complet, une centrifuger pendant 5 min. à 400 g et le surnageant décanter.
  3. Resuspendre les cellules RBC-lysée dans 10 ml de médias complètes et compter (par exemple, avec du bleu trypan en utilisant un hémocytomètre). Multiplier le résultat par 49, tel est le nombre total de cellules restantes dans l'échantillon non-lysées qui a été mis de côté. Jeter cellules RBC-lysée.

4. donateurs cellulaire étiquetage et / ou de cellules T CD4 Purification

  1. Si vous le souhaitez, de purifier les cellules T CD4 à ce stade, bien que ce soit pas nécessaire. En outre, si on le souhaite, les cellules de l'étiquette avec CFSE, comme en 19, ou d'autres colorants de repérage de la cellule, dont un exemple est représenté sur la Figure 4 de la section des résultats représentatifs.
    NOTE: Pour la purification de cellules T CD4, la sélection magnétique négatif est recommandée, car elle peut atteindre une haute pureté et laisse intactes les cellules avec une viabilité élevée comme décrit dans 20. Il est important que les tampons exempt d'endotoxine sont utilisés; Par conséquent, au lieu de BSA, faire la séparation esprit tamponh 2% de FBS et de la concentration recommandée de l'EDTA.

5. L'injection de cellules de donneurs BM12

  1. Après avoir compté les lymphocytes du donneur à l'étape 3 (et purifiés ou étiquetés comme à l'étape 4, comme on le souhaite), les cellules de centrifugation pendant 5 min à 400 x g. Décanter cellules surnageant et remettre en PBS à 120 millions de lymphocytes par ml (ou 30 millions de cellules T CD4 purifiés par ml). Cellules de transfert à un stériles 5 ml de tubes à fond rond, ou autre tube stérile qui peut accueillir facilement une seringue de 1 ml munie d'une aiguille 13 x 27,5 mm. G
  2. Avant l'injection, mis de côté un petit échantillon de cellules du donneur de l'étape 5.1 à 4 ° C pour la coloration de flux pour déterminer le pourcentage de cellules T CD4 dans les échantillons de donneurs. Colorer ces échantillons comme décrit dans l'étape 8 à l'aide du panneau d'anticorps minimal (tableau 2).
    NOTE: Si les cellules de différentes souches de souris sont utilisés comme donneurs distincts, cela est une considération importante, et si les pourcentages de cellules T CD4 varient sensiblement, PURification peut être nécessaire.
  3. Mélanger doucement les cellules, mais complètement. Cela peut être fait par pipetage de haut en bas des cellules en utilisant une seringue de 1 ml sans aiguille attachée. Après le mélange, aspirez cellules dans la seringue de 1 ml. Fixer l'aiguille après avoir enlevé les bulles d'air. Garder l'aiguille hors tout en amorçant la seringue permet de maintenir la viabilité des cellules.
  4. Injecter 250 ul par souris (qui est égale à 30 millions de lymphocytes, ou de 7,5 million de cellules T CD4 purifiés par souris) par voie intraperitoneale, comme décrit dans 21.
    NOTE: Dans les expériences présentées ici et dans notre travail avant 11, chaque souris est injecté avec 30 millions de lymphocytes totaux de BM12 donateurs, plutôt que les 100 millions de splénocytes totaux traditionnellement utilisés. En données non publiées de notre laboratoire, aucune différence n'a été observée dans le sérum anti-ADN double brin au jour 14 après des injections de 30 ou 100 millions de lymphocytes par souris. Bien que cela réduit considérablement le nombre de souris nécessaires pour des expériences, le développement de la néphrite esprith ce nombre de cellules n'a pas été évaluée.

6. Déterminer efficacité de greffage

NOTE 1: Cette section décrit comment déterminer le degré de greffage de cellule donneuse chez le receveur au jour 3 afin d'identifier toutes les souris qui peuvent avoir reçu des injections sous-optimales (par exemple, la greffe chez une souris est <10% de celle observée dans toutes les autres souris du même groupe). Ces données peuvent également aider à déterminer si des cellules d'une souche de souris génétiquement modifiées sont rejetés aux points de temps plus tard (pour plus de détails, voir la section des résultats représentatifs, figure 6).

NOTE 2: Cette section est seulement possible si les donateurs et les bénéficiaires sont de souris sur les différents milieux congéniques, par exemple, lorsque vous utilisez les donateurs CD45.1 BM12 et CD45.2 C57BL / 6 destinataires, ou lorsque les cellules du donneur sont marqués avec un colorant de suivi de la cellule. Surtout, à 3 jours après l'injection, les cellules T CD4 ont connu une expansion minime (SEe représentant la section des résultats, Figure 4), de sorte différences observées dans les taux de greffage sont dues à la variabilité des injections, sans expansion.

  1. Anesthésier la souris avec 4% d'isoflurane ou autre méthode IACUC approuvé. Testez réflexes du pied arrière pour assurer la souris est correctement anesthésiés avant de procéder à la prise de sang.
  2. Récolte sang 100-200 pi en utilisant une méthode IACUC approuvé, comme la ponction rétro-orbitaire comme dans 22. Prélever le sang dans individuels 0,5 ml microtubes contenant un anti-coagulant, tels que les tubes de collecte de plasma référencés dans la table des matières, qui contiennent dipotassique lyophilisé EDTA. Après la collecte de sang, appliquer une légère pression à l'œil de la souris en utilisant une serviette stérile ou de gaze pour assurer l'arrêt du saignement, puis placez la souris en arrière dans sa cage où il restera jusqu'à la récolte finale de tissu (étape 7).
    REMARQUE: Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu'à ce que les souris ont repris conscience suffisante pourdécubitus ventral maintenir, et ne pas remettre les souris à la compagnie des autres jusqu'à guérison complète.
  3. Amener le volume de sang à 500 ul avec 21 ° C PBS et transfert à microtube conique-bas, puis underlay lentement 200 pi de 21 ° C la solution de séparation de cellules à haute densité avec un pl pipette 200, en prenant soin de minimiser le mélange entre les deux phases ( voir le tableau des matériaux pour les solutions recommandées). Centrifuger les cellules à 700 g pendant 20 min à 20-25 ° C avec frein de la centrifugeuse réglé trop bas.
  4. Retirer la couche supérieure contenant des lymphocytes avec une pipette de 1 ml et transférer dans un nouveau tube contenant 800 ul milieu complet froid. Vortexer doucement pour mélanger les cellules. Centrifuger les cellules à 700 g pendant 5 min à 4 ° C et le surnageant décanter.
  5. Resuspendre les cellules dans 200 pi de milieu complet, transfert à une plaque de 96 puits à fond en U, et détachants pour cytométrie de flux comme décrit à l'étape 8 en utilisant un panel d'anticorps minime (tableau 2) pour déterminer til abondance relative de la greffe de lymphocytes T CD4 en tant que pourcentage de cellules PBMC.

7. Récolte finale en tissu

REMARQUE: Les expériences décrites dans la section des résultats ont été récoltées 14 jours après l'injection de cellules du donneur (ou dans certains cas, moins de temps), car ils se concentrent sur le développement initial de cellules TFH et les cellules plasmatiques; Toutefois, étant donné que ce modèle est un modèle de GVHD chronique du SLE, de la maladie peut être contrôlée à des instants plus tard. Le délai optimal dépendra de la question de recherche posée dans chaque expérience.

  1. A un moment prédéterminé après l'injection de cellules du donneur BM12 (étape 5.4), sacrifier la souris utilisant un méthode d'euthanasie IACUC approuvé. Asphyxie au CO 2 suivie par exsanguination est recommandé. La dislocation cervicale peut fonctionner comme une méthode secondaire de l'euthanasie, mais cela peut réduire le rendement de prélèvement de sang.
  2. Mouillez l'abdomen de la souris légèrement avec un vaporisateur contenant 70%l'éthanol. Faire une petite incision superficielle avec des ciseaux chirurgicaux environ 1 cm au-dessus des organes génitaux. Reculer la peau de l'abdomen vers le sternum, en prenant soin de garder le fascia péritonéale intacte.
    REMARQUE: les souris malades présentent habituellement 0,5-3 ml ascite au jour 14, qui, même si elle n'a pas encore été bien caractérisée, peuvent être mesurés et analysés en tant que paramètre de la maladie supplémentaire.
  3. Monter une seringue de 5 ml avec une aiguille de 18 G. Insérez l'aiguille dans le quadrant inférieur droit de l'abdomen avec l'aiguille dirigée vers le haut vers la tête de l'animal et à l'angle de 15 ° par rapport au plan de l'aponévrose. Positionner la pointe de l'aiguille à proximité du cæcum pour aider à prévenir l'aiguille ne se bouche intestin tout en aspirant ascite.
  4. Tournez délicatement la souris sur le côté, puis dessiner lentement ascite dans la seringue. Une fois que l'ascite a été récupéré, enlever la seringue et d'enregistrer le volume d'aspiration, sur la base des marquages ​​de volumétrie sur le côté de la SyriESN.
  5. Ascite de rejet dans un tube à fond rond de 5 ml et conserver dans la glace pour un traitement ultérieur.
  6. Récolte par tirage au sang de la veine cave inférieure (VCI) essentiellement comme dans 22. En utilisant des pinces ternes, déplacez doucement les intestins sur le côté gauche de la souris, en découvrant la VCI. Insérez une aiguille de 27,5 G monté sur une seringue de 1 ml dans la veine cave inférieure et tirer lentement 400-500 pi de sang.
  7. Pour minimiser l'hémolyse, injecter lentement sang dans un tube de 0,5 ml de sérum à centrifuger ou collecte de plasma. Pour l'analyse du sérum tard d'Anas par ELISA, empêcher le sang sur la glace.
  8. Disséquer et d'obtenir plus pertinents tissus (rate et, si désiré, les ganglions lymphatiques et les reins, en particulier si la collecte des points et glomérulonéphrite de temps plus tard, sera marqué). Retirer la rate en plaçant délicatement les intestins en arrière vers le côté droit de l'animal, et en tirant sur le pancréas, qui est le tissu conjonctif primaire de la rate.
  9. Retirez tout le pancréas restant, puis peserrates sur une balance de haute précision immédiatement après la dissection, comme splénomégalie brute est un paramètre fréquemment rapportés dans des modèles murins de lupus érythémateux disséminé. Placez les tissus lymphoïdes dans individuels 1,5 ml tubes remplis avec 1 ml milieu complet sur la glace. Fixer reins dans 10% du formol tamponné neutre ou snap geler les reins pour l'histologie tard que dans 23.
  10. Centrifugeuse de sang dans les 2 heures de la collecte pendant 3 min. 10 000 xg à 4 ° C (). Retirer le sérum et conserver à -80 ° C pour une analyse ultérieure de l'ANA par ELISA. Reportez-vous aux rapports précédents pour les protocoles détaillés Ana Elisa 24,25. Conserver le sérum dans de multiples 10-20 aliquotes pour minimiser les cycles de gel / dégel, et permettre à un plus grand nombre de tests futurs.
  11. Centrifugeuse ascite 400 xg pendant 5 min. Retirer le surnageant avec une pipette de 1 ml et aliquote dans plusieurs tubes 0,5 ml. Congeler le surnageant à -80 ° C pour des analyses ultérieures d'anticorps anti-nucléaires (Anas) ou d'autres médiateurs inflammatoires solubles.
  12. Fract cellulaire Resuspendre ION à environ 1 ml de milieu complet et transférer 200 pl sur une plaque à 96 puits à fond en U pour la coloration d'écoulement (comme à l'étape 8).
  13. Écraser chaque rate à travers 70 um crépines de cellules dans des tubes séparés et rincer avec les médias complets. Remettre en suspension les splénocytes avec 1 ml de tampon de lyse RBC froid pendant 1 min. et mélanger doucement à bascule. Amener le volume à 10 ml avec un milieu complet froid et centrifuger pendant 5 min à 400 g et décanter le surnageant.
  14. Culot cellulaire Remettre en suspension dans 5 ml de milieu complet et compte en utilisant un hémocytomètre. Régler le volume de telle sorte que 200 pi de milieu complet contient 1-3 millions de cellules. Commencer la coloration pour la cytométrie de flux (étape 8) au moyen d'un panneau d'extension (tableau 2) pour quantifier la différenciation des donateurs CD4 des cellules T et des cellules B et destinataire expansion.
    REMARQUE: Selon ce laser, tubes photomultiplicateurs (PMT), et de jeux de filtres combinaisons sont disponibles, en séparant le panneau d'analyse de cellules T et B en plusieurs panneaux peut être nécessaire.
ve_title "> 8. La coloration de débit

  1. Transfert 1-3 millions splénocytes dans 200 pi milieu complet dans différents tubes de 5 ml à fond rond, ou dans des puits individuels d'une plaque de 96 puits à fond en U.
    NOTE: L'utilisation d'une plaque de 96 puits est un moyen efficace pour colorer plusieurs échantillons, mais prenez garde à l'assiette des échantillons dans tous les autres puits afin de prévenir la contamination croisée. Une plaque de 96 puits peut donc contenir 24 échantillons.
  2. Plaque de centrifuger à 500 g pendant 3 min., Puis surnageant film de plaque dans (Biohazard) récipient approprié.
  3. Remettre en suspension les culots cellulaires avec 100 ul de tampon d'écoulement (1% de FBS dans du PBS) contenant un colorant de viabilité peut être fixé à la concentration recommandée par le fabricant et purifié anti-CD16 / anti-CD32 antibody cocktail à 1 ug / ml. Incuber pendant 10 min à 20-25 ° C, puis ajouter 100 pi de milieu complet froides pour étancher la viabilité colorant.
    REMARQUE: splénocytes de souris malades contiennent généralement un nombre relativement élevé de cellules mortes ou mourantes;Par conséquent, l'inclusion d'un colorant de viabilité est recommandé d'éviter l'étiquetage des anticorps non-spécifique de cellules qui meurent, entraînant propres données, plus fiables. De même, le cocktail anti-CD16 / anti-CD32 est inclus pour bloquer anticorps marqué par fluorescence liaison non spécifique par les récepteurs Fc.
  4. Plaque de centrifuger à 500 g pendant 3 min., Puis surnageant film de la plaque en container prévu. Resuspendre les cellules dans 200 pi de tampon de flux. Plaque de centrifuger à 500 g pendant 3 min., Puis surnageant film de la plaque en container prévu.
  5. Resuspendre les cellules dans du tampon de flux 50 ul contenant un cocktail d'anticorps (Tableau 2). Incuber pendant 20 min à 4 ° C, puis ajouter 150 tampon de flux de pi. Répétez l'étape de lavage 8.4.
  6. Resuspendre les cellules avec 100 pi de paraformaldehyde à 2% dans du PBS. Incuber pendant 30 min à 4 ° C, puis ajouter tampon de 100 flux de pl. Plaque de centrifuger à 500 g pendant 3 min., Puis surnageant film de la plaque en container prévu.
  7. Resuspee dans 200 tampon de flux ul, transférer à l'écoulement des inserts ou des tubes d'écoulement standard, ajouter un tampon de flux 100-200 pi supplémentaires, et conserver à 4 ° C dans l'obscurité jusqu'à l'acquisition sur cytomètre de flux.
  8. Acquérir sur un cytomètre de flux équipé avec les lasers et PMT appropriées pour les panneaux d'anticorps choisis au sein de plusieurs jours de coloration. Enregistrement Avance largeur et / ou la hauteur de dispersion, en plus de transmettre la zone de dispersion, zone de dispersion latérale, et la surface des paramètres fluorescentes utilisées. Pour des résultats fiables, acquérir ≥1,000 cellules du donneur dans chaque échantillon WT, ou un nombre équivalent de lymphocytes totaux chez les souris manipulées génétiquement modifiés ou non qui montrent l'expansion minimale de cellules du donneur, où la collecte de tant d'événements peut ne pas être faisable.
    NOTE: La cytométrie en flux analyses sont décrits en détail dans la section des résultats représentatifs (figures 3 - 6).

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Résultats

Souris malades développent une splénomégalie en aussi peu que 14 jours, présentant les rates 2-3 fois la taille de souris saines en termes de masse et de la cellularité (Figure 2).

Les splénocytes sont séquentiellement débloqué diffusion de la lumière (FSC-A par SSC-A), l'élimination des doublets (FSC-W ou -H par le FSC-A), les cellules viables (faible coloration de la viabilité colorant) et CD4 + TCRβ + (Figure 3A). Les cellules do...

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Discussion

Le modèle inductible de BM12 est un moyen relativement simple et efficace pour étudier les processus cellulaires et moléculaires de SLE. L'activation chronique des cellules T CD4 par transfert adoptif dirigés contre les antigènes du soi conduit à l'accumulation de Tfh, GC cellules B, les cellules plasmatiques et qui peut être mesurée par cytométrie en flux, comme décrit ici. Les futures études utilisant ce modèle peut rapidement et facilement interroger le rôle des gènes candidats et de nouvelles thérapies dans ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu en partie par l’Institut de recherche sur le lupus, la subvention CA138617 du NCI, la subvention NIDDK DK090978, le prix Charlotte Schmidlapp (à E.M.J.) et la bourse Albert J. Ryan (à J.K.). Nous sommes reconnaissants du soutien et de l’instrumentation fournis par le Research Flow Cytometry Core de la division de rhumatologie du Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, soutenu en partie par NIH AR-47363, NIH DK78392 et NIH DK90971.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
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N° B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJThe Jackson Laboratory001162CD45.1+ BoyJ souris souche
B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJThe Jackson Laboratory001162Bm12 souche de souris
FastDigest PsuILife TechnologiesFD1554Restriction digest enzyme pour le génotypage
1X RBC Lysis BuffereBioscience00-4333-57
IMDMGE HealthcareSH30228.01
Tube de séparation du plasma (PST)Tubedeprélèvement sanguin BD 365974 avec EDTA dipotassique
Tube de séparation du sérum (SST)Tubedeprélèvement sanguin BD 365967 avec activateur de caillot / Gel SST
FicollGE Healthcare17-1440-02  ;Solution de séparation de cellules à haute densité
Lympholyte-MCedarlaneCL5030Solution de séparation cellulaire haute densité
GL-7-biotineeBioscience13-5902-82  ;
Streptavidin-BUV395BD564176
CD138-BV421BioLegend142508
CD4-BV510BioLegend100559
TCR&beta ;-BV605BD562840
CD45.1-BV711BioLegend110739
CD45.2-FITCBioLegend109806
-1-PEBioLegend135206
CD19-PerCPBioLegend115532
Fas-PE-Cy7BD557653
CXCR5-APCBioLegend145506
Fixable Viability Dye ef780eBioscience65-0865-18
CD4-BV421BioLegend100443
inserts de tube FACS de 1,2 ml, rackUSA Scientific1412-1400
BD Falcon&trade ; Tubes à fond rondBD352017

Références

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