Stratégies expérimentales pour combler les lacunes de tissus grandes dans la moelle épinière lésée après aiguë et chronique Lésion

Résumé

Les lésions graves de la moelle épinière entraînent souvent des anomalies tissulaires. Deux possibilités sont décrites pour combler avec succès ces lacunes afin de promouvoir l’adaptation tissulaire, les réponses régénératives et l’amélioration fonctionnelle chez le rat via l’implantation d’un système de microconnecteur mécanique après une lésion aiguë et cinq semaines après une transsection complète de la moelle épinière.

Résumé

Après une lésion de la moelle épinière (SCI) se forme une cicatrice dans le noyau de la lésion qui empêche la régénération axonale. Combler le site de la lésion après une insulte à la moelle épinière, les résections tumorales, ou des défauts tissulaires résultant d'accidents traumatiques peuvent aider à faciliter la réparation des tissus en général, ainsi que la croissance de régénération des fibres nerveuses dans et au - delà de la zone touchée. Deux stratégies de traitement expérimentaux sont présentés: (1) l'implantation d'un nouveau dispositif de microconnecteur dans un rat thoracique de la moelle épinière aiguë et complètement sectionnée à READAPT sectionnée souches de tissus de la moelle épinière, et (2) le remplissage polyéthylène glycol du site SCI chez les rats chroniquement lésés après résection cicatrice. La lésion de la moelle épinière chronique dans ce modèle est une transection de la moelle épinière complète qui a été infligée à 5 semaines avant le traitement. Les deux méthodes ont récemment obtenu des résultats très prometteurs et repousse axonale promu, l'invasion cellulaire bénéfique et des améliorations fonctionnellesdans des modèles de rongeurs de la lésion de la moelle épinière.

Le système de microconnecteur mécanique (SMM) est un système multi-canaux, composé de polyméthylméthacrylate (PMMA) avec un système de tubulure de sortie pour appliquer une pression négative au SMM lumière tirant ainsi les souches de la moelle épinière dans les trous en nid d'abeilles structuré. Après son implantation dans l'espace tissulaire de 1 mm, le tissu est aspiré dans l'appareil. En outre, les parois intérieures des SMM sont microstructurée pour une meilleure adhérence des tissus.

Dans le cas de l'approche chronique de lésion de la moelle épinière, les tissus de la moelle épinière - y compris la zone de la lésion cicatrice remplie - est réséqué sur une superficie de 4 mm de longueur. Après la résection cicatrice microchirurgical la cavité résultante est remplie avec du polyéthylène glycol (PEG 600) qui a été trouvée pour fournir un excellent substrat pour l' invasion cellulaire, la revascularisation, la régénération axonale et même remyélinisation compact in vivo.

Introduction

Une lésion traumatique de la moelle épinière entraîne non seulement la perte des axones mais il d' autres résultats dans les défauts des tissus qui entravent les réponses régénératrices (pour revue , voir ^1,2). le tissu de la moelle épinière est souvent perdue par la dégénérescence secondaire conduisant à la formation ou des trous kyste dans et autour de la zone de la lésion. La plupart des interventions thérapeutiques expérimentales portent sur les dommages de la moelle épinière incomplètes comme transection, écrasement ou contusion blessures partielles avec un rebord restant de tissu sain. Pour les blessures complètes comme transections totales résultant d'accidents traumatiques ou des interventions chirurgicales, comme les résections tumorales, seules les options de traitement très limitées sont disponibles aujourd'hui ^3,4. Après transection complète, la tension mécanique des résultats de tissus dans la colonne vertébrale moignon retrait, laissant un petit espace dans la moelle épinière. La plupart des stratégies se concentrent sur ​​combler cette lacune avec des tissus, des cellules ou des matrices ^5,6.

Ici, une autre stratégieest présenté, à savoir re-adaptation des souches séparés en utilisant un nouveau dispositif de microconnecteur ^7. Afin de réadapter les deux souches, la force mécanique doit être appliquée comme une légère pression négative pour accomplir cette (Figure 1). Le système de microconnecteur mécanique (SMM) est un système à canaux multiples de polyméthacrylate de méthyle (PMMA) avec des trous en forme de nid d' abeilles (figure 1A) et muni d'un système de tuyaux de sortie. Il est implanté dans l'espace tissulaire résultant de la transsection complète de la moelle épinière chez le rat (figure 1C). Un tube peut être raccordé à une pompe à vide pour appliquer une pression négative au SMM (figure 1D). La pression tire les souches de la moelle épinière débranchés dans les trous en forme de nid d' abeille des mMS, qui ont des parois microstructurées pour maintenir le tissu en place lorsque la pression est relâchée (figure 1B). Le tube peut être laissée intacte après la chirurgie et attaché à une minipompe osmotique afinà injecter des substances dans le noyau de lésion (figure 1E-F).

Outre une transection aiguë de la moelle épinière un autre type de résultats complets des lésions de l'ablation chirurgicale d'une tumeur spinale ou une cicatrice d'une lésion chronique solide conduisant à des écarts importants de tissus de plusieurs millimètres, qui ne peuvent être surmontés par les mMS jusqu'à présent. La majorité des patients atteints de traumatisme de la moelle épinière souffrent de blessures chroniques. Chez ces patients, une cicatrice complètement développée occupe le noyau de la lésion. L'ablation chirurgicale de la cicatrice de la lésion est un concept pour le traitement qui est actuellement étudiée après expérimentale SCI ^8,9. Alors que la procédure de résection proprement dite peut être réalisée sans causer de dommages supplémentaires considérables, l'écart de tissu résultant doit être comblé avec une matrice appropriée qui permet et favorise la régénération des tissus et, dans le cas spécifique des lésions de la moelle épinière, la régénération des fibres nerveuses pour maintenir et promouvoir des fonctions locomotrices. c'étaita constaté que de bas poids moléculaire du polyéthylène glycol (PEG 600) est un matériau très approprié à cette fin. Son manque d'immunogénicité et de la très faible viscosité permet une intégration harmonieuse dans le tissu environnant. Insertion du biopolymère seul favorise l'invasion des cellules bénéfiques, y compris les cellules endothéliales, les cellules de Schwann périphériques, et les astrocytes, et - très important - la régénération et l' allongement des axones descendant et ascendant des faisceaux de fibres, ainsi que leur ensheathment par myéline compacte ^8. Ces réponses régénératrices ont été trouvés à être accompagné par de longue durée des améliorations fonctionnelles. La combinaison de la résection du tissu cicatriciel et l'implantation ultérieure de PEG 600 présente un moyen sûr et simple, mais très efficace de combler les défauts des tissus de la moelle épinière substantielles.

Protocole

Les directives institutionnelles pour la sécurité des animaux et le confort ont été respectées, et toutes les interventions chirurgicales et les soins des animaux pré et post-chirurgicale ont été fournis dans le respect de la loi allemande sur la protection des animaux (Office d'État, de l'environnement et de la protection des consommateurs de Rhénanie du Nord-Westphalie, LANUV NRW ).

1. Transection complète de la moelle épinière thoracique de rats Wistar (220-250 g)

1. Préparation de la moelle épinière
   1. Utiliser une anesthésie par inhalation d' isoflurane (2-3% d'isoflurane dans de l' O ₂ / NO ₂ dans un rapport de 1: 2) et injection d' un bol de carprofène (sous - cutanée [ms] 5 mg / kg). La combinaison de carprofen et la buprénorphine aux opiacés (0,02 mg / kg, sc) est recommandée. Lancer la chirurgie lorsque la paupière réflexe au toucher léger avec un coton tige et patte réflexe de retrait de pincement stimulus avec des pinces ne sont plus respectées.
   2. Placer l'animal sur une couverture chauffante à 37 ° C pour maintenir le corps tempérare pendant la chirurgie et la pommade oculaire mis sur les yeux pour éviter la sécheresse sous anesthésie.
   3. Rasez le dos de l'animal et de préparer la peau avec un désinfectant de la peau.
   4. Couper la peau au niveau de la ligne médiane le long des vertèbres thoraciques pour 4 cm avec une lame chirurgicale et l'ouvrir. A partir de cette étape, utilisez des instruments chirurgicaux stérilisés pour toutes les procédures (autoclavé ou stérilisé par immersion).
   5. Rentrez les muscles au-dessus des vertèbres thoraciques en utilisant une petite pince muscles.
   6. Retirez les apophyses épineuses au niveau thoracique 8 (Th8) et Th9 avec une gouge osseuse par clipsage prudemment petits morceaux d'os jusqu'à ce que les os vertébraux sont à plat.
   7. Utilisez une pince anatomique pour soulever la colonne vertébrale au processus épineux Th7 et utiliser une gouge pour couper des petits morceaux de l'os vertébral de caudale à rostre jusqu'à ce qu'une laminectomie est effectuée à Th8 et Th9. Exposer la dure-mère sans l'endommager en retirant soigneusement seulement quelques très petits morceaux d'os vertébral à la fois.
   8. Fixer le squelette par 2 pinces de stabilisation au processus épineux Th7 et Th10, soulever l'animal pour découpler les mouvements respiratoires des vertèbres.
2. Remplissez Spinal Cord Transection au Thoracic Niveau 8/9
   1. Soulevez la dure-mère avec une pince fine, couper la dure-mère avec des ciseaux oculaires fines dans le sens transversal.
   2. Maintenez l'extrémité latérale de coupe de la dure-mère avec une pince fine et insérez un crochet spinal dans l'espace subarachnoidic entre la dure-mère et arachnoïde. Evitez d'abîmer les meninges en ne piquant dans le pia ou la dure-mère soit avec une pince ou crochet de la moelle épinière.
   3. Tourner lentement le crochet pour placer tout le long de la moelle épinière, en prenant soin de ne pas piquer dans la dure-mère (pia est encore intact).
   4. Soulevez la moelle épinière pendant environ 1 - 2 mm vers le haut, jusqu'à ce qu'un écart est vu à la face ventrale entre le tissu de la moelle épinière et la dure.
   5. Insérez des ciseaux fins de l'oeil dans l'espace between-mère et pia et couper la moelle épinière tandis que le crochet vertébral est laissé en place.
   6. Soulevez les deux souches de la moelle épinière avec deux pinces et d'assurer visuellement transection complète.
   7. Pour les animaux de contrôle-lésés et les animaux avec une blessure chronique, fermer la dure par des sutures interrompues avec monofilament non adsorbables 9.0 threads.
   8. Pour les lésions chroniques suivre une partie 1.6.
3. mMS Implantation
   1. MMS placer au-dessus du site de la lésion avec les deux tubes se trouvant sur chaque côté latéral de la vertèbre et l'abaisser dans la cavité de lésion.
   2. tubes de suture aux muscles du côté de la vertèbre avec non résorbable 4-0 fil pour assurer la stabilisation des mMS. Veiller à une fixation des mMS en utilisant une pince lors de cette étape.
   3. Retirer la broche du connecteur mMS en coupant avec une paire de ciseaux fins.
   4. Fermez la dure au-dessus des mms et suturer avec 9.0 threads.
   5. Attacher un tube à la pompe à vide et scellerl'autre par serrage.
   6. Appliquer une pression négative douce aux mMS par une pompe à vide par l'intermédiaire du tube ouvert, suçant les souches de la moelle épinière dans la lumière mms. Appliquer la pression négative pendant plusieurs minutes (au maximum pour 10 min) et surveiller par des capteurs (250-350 mbar).
   7. Couper les tubes à proximité des mMS et retirer les tubes. Passez à l'étape 1.6.
4. Résection de la moelle épinière des tissus y compris la Scar Lésion chronique à la semaine 5 après une blessure initiale
   1. Suivez les étapes 1.1.1 - 1.1.5.
   2. Identifier tissu cicatriciel par aspect brun-jaune et tissu rigide sur le dessus de la moelle épinière. Retirez délicatement les couches superficielles de tissu cicatriciel en maintenant avec une pince fine et la coupe avec des ciseaux fins. Avec cette méthode, ré-ouvrir le site de laminectomie pour exposer le tissu contenant le cordon zone de lésion médullaire. Arrêtez la préparation lorsque la suture de la dure est identifié visuellement.
   3. Fixer le squelette par 2 pinces de stabilisation à rotationprocessus UO TH7 et TH10, puis élever l'animal pour découpler les mouvements respiratoires des vertèbres.
   4. Avec une petite règle en carton mesurer la surface de la moelle épinière qui doit être réséquée (longueur: 4 mm) et marquer les bords de cette zone de tissu respective avec des incisions transversales pour permettre l'élimination ultérieure du tissu.
   5. Retirer le tissu cicatriciel via une combinaison de coupe et d' aspiration. Faire sortir le tissu qui a été séparé de la moelle épinière, avec des incisions transversales. Utiliser une aspiration douce à chaque fois qu'il est suffisant pour permettre l'enlèvement du tissu. En outre, chaque fois que la texture rigide du tissu cicatriciel rend l'aspiration des tissus trop difficile, utilisez des ciseaux fins pour couper et enlever ce tissu.
   6. Insérez une pièce (environ 5 mm x 5 mm x 5 mm cube) de hémostatique éponge de gélatine dans la fente de tissu jusqu'à ce que les subventions de saignement. L'éponge de gélatine va diminuer en taille dès qu'il est imbibé de liquide.
5. Implantation de PEG 600
   1. Préparer 1 ml de pur non dilué PEG 600 pour l'injection par chauffage à 37 ° C.
   2. Retirer une éponge de gélatine.
   3. Introduire une quantité suffisante (environ 5 - 7 pi) de PEG dans l'espace en utilisant une seringue de 10 ul ou une pipette 10 ul.
   4. couvrir soigneusement la zone avec un morceau (environ 5 mm x 4 mm) de remplacement scellant / dure.
   5. Fixer le produit d'étanchéité entourant le tissu musculaire avec quelques gouttes de colle tissulaire. Placez le mastic sur le dessus de la fente de résection PEG-remplie. Pour empêcher un glissement du matériau d'étanchéité, en utilisant de petites gouttes de colle tissulaire pour fixer les coins du produit d'étanchéité pour le tissu musculaire environnant. Note: Eviter les fuites de la colle de tissu sur le tissu de la moelle épinière!
6. Clôture de tissus et Soins postopératoires
   1. muscles de suture et de la couche de la peau pour la couche avec des sutures interrompues avec tressées adsorbables 4-0 fils
   2. Injecter 2 x 2,5 ml de chlorure de sodium (NaCl[0,9%]) à 36 ° C sc pour la réhydratation après la chirurgie. Une seule injection de 5 ml de NaCl serait étirer la peau de l'animal et peut causer des dommages inutiles à l'animal. Ne pas laisser sans surveillance animal jusqu'à la pleine conscience est rétablie.
   3. Injecter carprofène par jour (sc 5 mg / kg) pendant au moins 2 jours après la chirurgie. Maison animal unique cage pendant les 2 premiers jours, ensuite dans des groupes de 2 - 3.
   4. Appliquer un traitement antibiotique (administration orale quotidienne de enrofloxacine) pour la première semaine post-opératoire.
   5. Faites la vessie manuelle miction à deux à trois fois par jour en caressant doucement sur le ventre de l'animal rostrale à caudale. Veillez à ne pas déplacer la colonne vertébrale de l'animal et ne pas soulever l'animal à la queue. annuler manuellement la vessie de l'animal complètement spinalisés par jour pendant toute la durée de survie. Il faut prendre soin de placer des boulettes de nourriture et des bouteilles d'eau dans une hauteur qui peut être atteinte par les animaux sansdebout sur leurs pattes arrière. Bien être altérée en fonction de quart arrière, les animaux se déplacent et d'explorer les cages activement immédiatement après la chirurgie. Il est recommandé de garder les rats dans les groupes sociables.
   6. Pour les lésions chroniques laisser un temps de survie des animaux de cinq semaines avant la cicatrice résection. Suivez les étapes 1.4.

Résultats

Préservation de tissus, axonale Regrowth et de prestations fonctionnelle de mMS Implantation après aiguë Transection complète de la moelle épinière
Il est démontré que l'implantation aiguë des mMS stabilisé les souches de la moelle épinière complètement sectionnés et une diminution de retrait du tissu (figure 2A par rapport B). Comme visualisé par coloration au trichrome dans les sections sagittales, ...

Discussion

Voici deux approches chirurgicales différentes sont présentées pour combler les lacunes des tissus dans la moelle épinière après (1) transection complète aiguë et mMS implantation et (2) une lésion de la moelle épinière chronique et le retrait fibreux de cicatrice, plus PEG matrice implantation. Les deux stratégies conduisent à la préservation des tissus et la régénération axonale, ainsi que pour l'amélioration fonctionnelle significative locomotrice des animaux traités. Pour mMS implantation d'une fixation adéq...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
PEG 600 Ph Eur  ;	Merck/VWR ;	8,170,041,000
Éponge gélatine Gelastypt  ;   ;	sanofi Aventis	PZN-8789582
Nescofilm Sealant  ;	Roth	2569.1
Baytril Bayer
Rimadyl (carpofen)	Pfizer
Forene (isoflurane)	Abbvie
Kodan (désinfectant pour la peau)
Histoacryl (colle pour tissus)
Friedman-Pearson Rongeur, tasse de 1 mm, droit  ;	Fine Science Tools	16020-14
Micro spatule deux-en-un - 12 cm  ;	Outils scientifiques fins	10091-12
Pince Dumont #7 - Inox Medical  ;	Outils de Fine Science	11273-20
Dumont #5/45 Forceps - Inox Medical  ;	Fine Science Tools	11253-25
Crochet pour moelle épinière	Outils scientifiques fins	10162-12
Ciseaux  ;	Outils scientifiques fins	14078-10
Pince  ;	Aesculap	EA016R
Ethicon Vicryl 4-0
Bepanthen Augen- und Nasensalbe	Bayer
Pince anatomique  ;	Fine Science Tools	11000-13
Enrouleur auto-retentissant  ;	Fine Science Tools	17008-07
Pince à peau  ;	Outils de science fine	13008-12
Aluspray  ;	Selectavet