Article de méthode

Électrotaxie l'étude des cellules du cancer du poumon à l'aide d'un double-Multichannel champ électrique microfluidique Chip

DOI :

10.3791/53340

⸱

29 décembre 2015

 ,  , 
1Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica, 2Institute of Biophotonics, National Yang-Ming University, 3Biophotonics & Molecular Imaging Research Center (BMIRC), National Yang-Ming University, 4Department of Mechanical and Mechatronic Engineering, National Taiwan Ocean University, 5Ph.D. Program in Microbial Genomics, National Chung Hsing University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De nombreux dispositifs microfluidiques ont été développés pour être utilisés dans l’étude de l’électrotaxie. Pourtant, aucune de ces puces ne permet d’étudier efficacement les effets simultanés des champs chimiques et électriques (FE) sur les cellules. Nous avons mis au point un dispositif à base de polyméthacrylate de méthyle qui offre une stimulation coexistante et chimique mieux contrôlée pour la recherche sur l’électrotaxie.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le comportement de la migration cellulaire directionnelle sous un champ électrique à courant continu (dCEF) est désigné comme électrotaxie. Le rôle physiologique important de dCEF à guider le mouvement des cellules pendant le développement embryonnaire, la différenciation cellulaire et la cicatrisation des plaies a été démontré dans de nombreuses études. En appliquant puces microfluidiques à un essai de électrotaxie, le processus d'enquête est raccourcie et les erreurs expérimentales sont minimisés. Ces dernières années, des dispositifs microfluidiques fabriqués avec des matériaux polymères (par exemple, le polyméthacrylate de méthyle, PMMA, acrylique ou) ou du polydiméthylsiloxane (PDMS) ont été largement utilisés dans l'étude des réponses des cellules à une stimulation électrique. Toutefois, contrairement aux nombreuses étapes nécessaires pour fabriquer un dispositif de PDMS, la construction simple et rapide des micro acryliques fl uidique puce rend approprié à la fois pour le prototypage et la production de l'appareil. Pourtant, aucun des appareils déclarés de faciliter l'étude efficace de la chimique et dcE simultanéeF effets sur les cellules. Dans ce rapport, nous décrivons notre conception et la fabrication d'un double champ électrique multicanaux à base d'acrylique (MDF) à puce pour étudier l'effet simultané de produits chimiques et la stimulation électrique sur des cellules de cancer du poumon. La puce MDF fournit huit combinaisons de stimulations électriques / chimiques dans un seul test. La puce non seulement raccourcit considérablement le temps nécessaire expérimentale, mais augmente également la précision dans électrotaxie études.

Introduction

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Le comportement des cellules adhérentes qui se déplacent en direction d'une anode ou de la cathode sous un champ électrique de courant continu (dCEF) est appelée électrotaxie. Le comportement electrotactic de cellules joue un rôle important dans l'embryogenèse, la régénération des nerfs, et la cicatrisation des plaies. 1 Des cellules tumorales telles que des cellules cancéreuses de la prostate de rat, des cellules cancéreuses deux mammaires, 3 et pulmonaires cellules d'adénocarcinome 4-8 ont montré mouvement electrotactic sous une dCEF appliqué . L'EF physiologique a été mesurée dans les tissus de la glande. 9,10 électrotaxie a également été signalé dans les cellules tumorales des glandes associées. 2,3 Pris ensemble, les électrotaxie de cellules cancéreuses est considéré comme un facteur de métastases. 11 Contrôle de la direction électrique les cellules cancéreuses sous dCEF peuvent être une approche potentielle pour le traitement futur du cancer. Cependant, aujourd'hui, le mécanisme moléculaire détaillé de électrotaxie reste controversée. Par conséquent, une enquête de l'influence de la stimulation électrique sur la migration des cellules cancéreuses peut faciliter le développement de stratégies pour le traitement du cancer.

Récemment, des dispositifs bio-microfluidique ont été fabriqués pour l'étude des réponses cellulaires à couler force de cisaillement, 12 gradients chimiques, 13 et électrique 4 stimuli in vitro. La fabrication de dispositifs de bio-microfluidique utilisant (PDMS) ou polyméthacrylate de méthyle (PMMA, aussi connu comme l'acrylique) a réussi à réduire le taux de ces expériences d'échec. En outre, en utilisant des dispositifs microfluidiques à base d'acrylique comme un prototype pour enquêter sur des sujets biologiques est plus simple que d'utiliser des copeaux de PDMS. Diverses fonctions dans les dispositifs à base d'acrylique ont été développés pour électrotaxie étude. Cependant, aucune des conceptions antérieures sont capables de tester simultanément les effets de diverses conditions chimiques et le champ électrique sur-cellules pour électrotaxie étude. Ainsi, nous avons développé un dispositif microfluidique mu-leltichannel double champ électrique (MDF) quatre canaux culturels indépendants et huit conditions expérimentales différentes dans une puce contenant puce.

La puce de MDF à base d'acrylique, d'abord rapporté par Hou et al., 8 intègre une stimulation électrique et plusieurs canaux isolés chimiquement. Ces canaux isolés chimiquement peuvent être utilisés pour la culture de différents types de cellules dans une expérience. Le dCEF dans les canaux est produite par une source d'alimentation électrique. Deux champs électriques indépendantes, l'une avec une force appliquée de champ électrique (EFS) et l'autre avec 0 EFS, sont menées dans chaque canal chimiquement isolé. De cette manière, la puce fournit EF coexistante mieux contrôlée et la stimulation chimique. En outre, les résultats de la simulation numérique de la diffusion de produits chimiques à l'intérieur de la puce MDF indiquent qu'aucune contamination croisée entre les canaux est survenue après une période expérimentale de 24 heures. 8

Par rapport à la DeviCE rapporté par Li et al., 14 la puce MDF fournit une zone de grande culture, qui permet une plus grande analyse biochimique des cellules stimulées électriquement. En outre, avec une plus grande zone d'observation de la puce MDF, plusieurs cellules peuvent être observées dans le test, si l'analyse de la vitesse de migration ou directedness des cellules stimulées électriquement est plus précis. Les monocanal puce conceptions d'études antérieures rapportés par Huang et al. 4 et Tsai et al. 15 ne permettent qu'un seul type de cellule ou chimique à tester. Cependant, la puce de MDF peut être utilisé pour étudier les effets de différents produits chimiques sur la électrotaxie, ainsi que les effets de la stimulation électrique sur différents types de cellules. En d'autres termes, la puce MDF permet l'étude efficace de dépendances de doses chimiques.

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Protocole

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1. Conception et fabrication de la puce MDF

  1. Dessiner un motif de couche acrylique individuelle en utilisant des logiciels commerciaux, tels que AutoCAD, et sauvegarder le motif.
    1. Revoir la conception du motif de feuille d'acrylique à quatre couches de la figure 1A et confirmer les connexions inter-couches.
  2. Fabriquer toutes les feuilles d'acrylique et de l'adhésif double-face par ablation laser en utilisant un Traceur laser CO 2 (figures 1B, 2A et 2B). 16
    1. Allumez le Traceur laser et raccorder l'appareil à l'ordinateur portable contrôle.
    2. Exécutez le logiciel commercial et ouvrir le modèle conçu à l'étape 1.1 en cliquant sur "fichier de signatures conçu."
    3. Placez un morceau de feuille d'acrylique blanc ou ruban adhésif double face sur la scène XYZ du Traceur laser.
    4. Réglez la focalisation du faisceau laser sur la surface de la feuille acrylique ou un adhésif double face avec une auto-alignmenT Stick fourni par le fabricant du Traceur laser.
    5. Envoyer le modèle conçu pour le Traceur laser pour l'usinage direct de la feuille acrylique ou un adhésif double face.
  3. Retirez le papier protecteur des plaques acryliques en utilisant une pince et souffler la surface avec de l'azote gazeux.
  4. Empiler les feuilles acryliques et les lier ensemble sous une pression de 2 kg / cm 2 dans un dispositif de liaison thermique pendant 45 minutes à 110 ° C pour former l'ensemble de canal d'écoulement stimulation / électrique.
  5. Préparer la lamelle de microscope en tant que substrat de culture de cellules dans la puce.
    1. Mettez le couvercle en verre dans un bocal de coloration et de remplir le pot avec une dilution de dix fois du détergent répertorié dans la liste des matériaux.
    2. Mettez le couvercle en verre et le bocal de coloration dans un Steri-nettoyeur ultrasonique et nettoyer le cache de verre pour 15 min.
    3. Verser le détergent dilué dans le pot de coloration, remplir le pot avec de l'eau distillée, et répétez l'étape 1.5.2 ou 3 fois.
    4. Sécher le couvercle en verre nettoyé en soufflant avec de l'azote gazeux avant d'adhérer à l'adhésif double face.
  6. Adhérer le couvercle en verre nettoyé à l'écoulement ensemble de canal de stimulation / électrique avec le ruban adhésif double face à motifs à l'étape 1.2.
  7. Adhérer 13 morceaux de adaptateurs acryliques aux ouvertures individuelles dans la couche 1 de l'assemblage de puce MDF avec la super glue. L'ensemble de puce MDF est alors terminée (figure 2D).
  8. Stériliser l'assemblage complet de la puce MDF avec 30 min d'irradiation UV avant de l'utiliser.

2. configuration du pont réseau Sel de la Chip MDF

  1. Avant utilisation, stériliser tous les tubes en plastique, noix de doigts serrés, et microtubes présentés dans la figure 3B en fixant un temps de maintien de 15 min à 121 ° C dans l'autoclave.
  2. Connecter les tubes en plastique fluoré (figure 3B-i) à l'Assemblée de la puce MDF par l'entrée moyenet des adaptateurs de sortie présentés dans la figure 1A.
  3. Branchez le cône Luer de l'entrée de fluide et la sortie des tubes en plastique dans la figure 3B-i à 3 voies robinets.
  4. Prendre 2,5 ml de CO 2 -equilibrated saline tamponnée au phosphate (PBS) en utilisant une seringue de 3 ml et relier la seringue au robinet d'arrêt à 3 voies d'entrée du tube en matière plastique. Connectez un vide 3 ml seringue au robinet à 3 voies du tube de sortie en plastique. Les deux seringues sont ainsi interconnectés via la puce MDF.
    REMARQUE: Incuber le PBS dans le 37 ° C 5% CO 2 incubateur de culture cellulaire O / N CO 2 pour obtenir -equilibrated PBS.
  5. Sceller les ouvertures du bleu et les adaptateurs verts (figure 1A) sur la feuille de PMMA couche 1 avec des noix blanches des doigts étanche solides (figure 3B-iii).
  6. Remplissez les canaux de pont de sel et chambres de culture avec le CO 2 -equilibrated PBS dans la seringue décrit dans étape de configuration 2.4. Éviterla formation de bulles.
  7. Ensuite, mettre le CO 2 -equilibrated PBS contenant puce MDF dans le 37 ° C 5% -CO 2 culture cellulaire incubateur pour O / N incubation. Cela permet à l'air dissous dans l'adhésif double face pour former des bulles dans les chambres.
  8. Évacuer les bulles dans les canaux par un écoulement rapide PBS dans le canal à l'aide des deux seringues. Pomper le PBS avant et en arrière si nécessaire.
  9. Égoutter le PBS dans les canaux par l'intermédiaire du robinet à 3 voies reliée à la tubulure de sortie moyenne.
  10. Grâce à un nouveau 3-ml seringue, prendre 2,5 ml de CO 2 -equilibrated milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) (voir l'étape 3.5), et de remplacer la seringue reliée à l'entrée par la nouvelle. Remplir les canaux avec le milieu.
  11. Préparation du réseau de pont de sel.
    1. Retirer temporairement les écrous solides (figure 3B-iii) sur les cartes vertes (figure 1A) et injecter 3% à chaud (> 70 ° C) agarose dans le bri de seldge canal à travers l'ouverture dans le vert des adaptateurs (figure 1A).
      REMARQUE: Préparation d'agarose chaude: Dissoudre 1,5 g de poudre d'agarose dans 50 ml de PBS. Stériliser par la fixation d'un temps de maintien de 20 min à 121 ° C dans l'autoclave.
    2. Arrêter l'injection de l'agarose lorsque le liquide remplit les trois quarts de la longueur du canal de pont salin.
    3. Sceller les pores sur les adaptateurs verts (figure 1A) en vissant les écrous solides (figure 3B-iii) après l'injection agarose.
    4. Remplacer les écrous solides sur les adaptateurs bleus (figure 1A) avec les écrous tubulaires translucides des doigts étanche (figure 3B).
    5. Chargez le 3% préchauffé agarose dans les écrous tubulaires (figure 3B-IV).
    6. Incluez les électrodes Ag / AgCl (figure 3B-V) dans les écrous tubulaires (figure 3B-iv) devant lasolidification de l'agarose.
  12. Après avoir terminé la mise en place du réseau de pont de sel, injecter les cellules de cancer du poumon CL1-5 dans les chambres de culture, une chambre à la fois.

3. Préparation des cellules cancéreuses et configuré pour Electrotactic Expérience

  1. La culture régulière de la lignée cellulaire de cancer du poumon CL1-5.
    1. Culture des cellules cancéreuses pulmonaires, CL1-5 obtenus à partir Prof. Pan-Chyr Yang, 17 dans le milieu complet dans un flacon de culture de cellules à 37 75T ° C dans une atmosphère de CO2 à 5%. Le milieu complet est composé de DMEM et 10% de sérum bovin fœtal (FBS). Sous-culture les cellules tous les 3 à 4 jours. Les cellules utilisées pour réaliser des expériences de électrotaxie sont inférieures à 25 passages à partir de la source d'origine.
  2. Ajouter 2 ml de tampon de trypsine à 0,25% pour les cellules en croissance exponentielle CL1-5 et incuber pendant 2 min dans le 37 ° C 5% CO 2 incubateur pour culture cellulaire de cellules detachment.
  3. Terminer le processus de détachement avec 6 ml de 10% de FBS DMEM et centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Ensuite éliminer le milieu et suspendre le culot de cellules avec 5 ml de PBS.
  4. Comptez le nombre de cellules dans le PBS. Ensuite, prendre 1 x 10 6 cellules et centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante.
  5. Rejeter le PBS. Suspendre les cellules avec préchauffé CO 2 -equilibrated DMEM et ajuster la densité de cellules à 1 x 10 être 6 cellules / ml.
    REMARQUE: Incuber le milieu complet dans le 37 ° C 5% -CO 2 cellule incubateur de culture O / N pour obtenir le CO 2 -equilibrated DMEM.

4. Mettre en place pour Electrotactic Expérience

  1. De la sortie de la puce MDF, injecter 0,3 ml, 1 x 10 6 / ml, les cellules dans de la puce.
  2. Incuber la puce MDF cellule tête de série dans l'incubateur de culture cellulaire (fixé à 37 ° C et 5% de CO 2) pour 2-4 heures.
  3. Configuration de MDF microsystème fluidique.
    1. Installez le système microfluidique MDF sur un transparent Indium Tin verre d'oxyde (ITO) chauffe. Mesurer la température de la puce MDF avec un thermocouple de type K coupé entre la puce MDF et le verre ITO. Contrôler le chauffage ITO avec un contrôleur proportionnel intégral-dérivé (PID). Réglez la microfluidique température d'incubation du système MDF à 37 ° C avec le régulateur PID.
      NOTE: La fabrication du chauffe-ITO et l'installation du système de chauffage de la cellule de la culture sont décrits dans les rapports précédents 18,19.
    2. Montez la puce de MDF ensemble à température contrôlée sur le XYZ platine motorisée contrôlée par ordinateur sur un microscope inversé. L'utilisation de la platine motorisée est décrite dans l'étape 5.1. Pomper le milieu complet dans des chambres de culture à travers les entrées avec une pompe à seringue à quatre canaux.
  4. Pomper le milieu complet dans la puce MDF à un taux de 20 ul / h débit. Les déchets de la culture du savoirlets est recueilli dans les microtubes (représentés comme des «déchets» dans la figure 3A).
  5. Incuber les cellules pour un autre 16-18 heures à 37 ° C dans la puce de MDF.
  6. Pour remplacer le milieu, le milieu contenant de la pompe 50, 25, 5 et 0 inhibiteur de la kinase uM, respectivement, dans chaque chambre de culture à un débit de 20 ul / min pendant 10 min.
    NOTE: Préparer une solution mère 10 mM de l'inhibiteur de la protéine kinase Y27632 Rho-associé en ajoutant 3 ml d'eau stérile pour l'inhibiteur de kinase de 10,6 mg. Diluer la solution mère de 10 mM à 50, 25 et 5 pm, respectivement, en utilisant 10% de milieu FBS DMEM.
  7. Incuber les cellules dans l'inhibiteur de kinase pendant encore 60 minutes à 37 ° C. Réglez le débit moyen de 20 ul / h. Utilisez la même température de la culture et le taux décrit ci-dessus dans les étapes ultérieures couler.
  8. Utilisez des fils électriques pour connecter une alimentation en courant continu à la puce MDF via les électrodes Ag / AgCl sur la puce.
  9. Série connecter un ampèremètre in le circuit électrique. Utilisez l'ampèremètre pour contrôler le courant électrique dans la puce MDF.
  10. Allumez l'alimentation DC et réglez l'ampèremètre actuelle à 86,94 uA en ajustant la tension d'alimentation comprise entre 15 et 19 V.
    NOTE: Compte tenu de la loi d'Ohm, E = I / (aA eff), où I est le courant électrique circulant à travers la matière en vrac, à savoir, le milieu de culture dans la chambre electrotactic, σ (= 1,38 Ω -1 m - 1) est le conductivité du milieu de culture, A eff (= 0,21 mm 2 pour une largeur de 3 mm x 0,07 mm de hauteur) est la surface en coupe transversale effective de la chambre electrotactic, et le courant électrique (I) nécessaire pour générer un 300 mV / mm EF dans la puce MDF est de 86,94 uA.

5. Acquisition et analyse de la cellule Images

  1. Contrôler la platine motorisée à l'aide d'un programme MATLAB GUI. Avec le système microfluidique MDF monté sur le microscoPE, déplacer la puce pour les régions d'observation en utilisant le platine motorisée.
  2. Images de cellules d'enregistrement à l'aide d'un appareil photo reflex mono-objectif numérique (SLR) montés sur le microscope.
  3. Prenez des images microscopiques en utilisant un objectif 4X à des intervalles de 15 minutes pendant 2 heures.
  4. Analyse de la migration cellulaire.
    1. Exécutez NIH ImageJ 1,47 V.
    2. Analyser la distance de la première à la position finale de la centroïde de la cellule.
    3. Allez dans "Fichier" → → "Importer" "séquence d'images", et importer neuf images pour l'analyse de la migration cellulaire. La première image est le résultat du temps zéro, et la dernière image est le résultat de 120 min.
    4. Allez sur "Analyser" → "Définir mesures" et cochez la case à côté de "Centre de gravité"
    5. Cliquez sur l'icône «main levée de sélections».
    6. Représenter le bord des cellules sélectionnées dans la première image.
    7. Allez sur "Edit" → "Sélection" → "Ajouter au Manager"
    8. Aller à la neuvième image et de représenter le bord des mêmes cellules sélectionnées sur la première image. Les positions de cellule peuvent être tracées en utilisant la deuxième à huitième images.
    9. Allez sur "Edit" → "Sélection" → "Ajouter au Manager"
    10. Répétez les étapes 5.4.5 à 5.4.9 de recueillir des données à partir de 90 à 100 cellules.
    11. Allez sur "Analyser" → "Measure" pour obtenir le résultat des positions initiales et finales des cellules sélectionnées.
      NOTE: La vitesse de migration est définie comme la durée moyenne de mouvement des cellules par heure. Le directedness est défini comme cosinus, où est l'angle entre le vecteur de la dCEF (de l'anode à la cathode) et le vecteur de point de départ d'une cellule dans sa position finale. Le directedness est -1 pour les cellules qui migrent vers l'anode et une pour les cellules qui migrent vers la cathode. Pour un groupe de manière aléatoire miréseau de cellules, le directedness est 0. 2

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Résultats

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Fabrication et l'assemblage de l'appareil MDF

Un diagramme schématique de la puce de MDF à base d'acrylique est représenté sur la Figure 1A. Quatre feuilles d'acrylique, d'un couvercle en verre, 13 adaptateurs acryliques, et un morceau de ruban adhésif double-face ont été utilisés dans l'assemblage de la puce MDF complété (figure 2D). Il ya seulement qu...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons trouvé le processus d'adhésion adaptateurs acryliques sur la couche 1 de la puce MDF à être difficile. L'application de seulement 1 à 2 pi de super glue est suffisante pour faire adhérer fermement l'adaptateur sur la puce MDF. De plus grandes quantités de colle ont abouti à une polymérisation incomplète de la super glue et l'échec à adhérer. Une fois que les adaptateurs acryliques ont été fermement collées sur la puce MDF, une fuite de liquide dans le système microfluidique rarement eu lieu. E...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail est soutenu financièrement par le Ministère de la Science et de la Technologie de Taïwan (Contrat n°. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) et le Programme de recherche sur les nanosciences et les nanotechnologies, Academia Sinica, Taïwan.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
réactif
DMEM moyenGibco,Invitrogen, USA12800-017
Sérum fœtal bovinGibco,Invitrogen, USA16000-044
TrypsineGibco,Invitrogen, USA25200-072
PBSBasic LifeBL2651
Y-27632 (chlorhydrate)Cayman Chemical Co10005583
agaroseLONZO, États-UnisSeaKem LE AGAROSE
seringueTerumo3 ml avec cône
robinet d’arrêt à 3 voiesNiproavec cône
PMMA (acrylique)HiShiRon Industries CO., Ltd, Taïwanépaisseur 1mm, adaptateur
acrylique 2mmKuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taïwan1/4-28 orifice, 10x10x6 mm
écrouThermo Fisher Scientific Inc.UPCHURCH :P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x
Verre de couverture de microscopeDeckglä ; ser, Allemagne24x60 mm
adhésif double face3MPET 8018
super colle3MScotch Liquid Plus Super Glue
TFD4 détergentFranklab, FranceTFD4
nettoyeur à ultrasons STERILEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan
Thermo bonderKuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwanscribe
groupe LTT, TaiwanISL-II
contrôleur proportionnel-intégral-dérivé (PID)JETEC Electronics Co., JapenTTM-J40-R-AB,
thermocouple de type KTECPELTPK-02A
seringue à 4 canauxKdScientific, États-UnisAlimentation DC 250P
GWInstek, Taïwan
Étage moteur X-Y-ZTanLian, E-O Co. Ltd., Taïwan
Olympus, JaponCKX41
Canon, Japon60D
LuerLuer personnalisé ruban laser CO2 personnalisé pompe microscope inversé personnalisé Appareil photo reflex numérique

Références

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Inhibiteurs de kinasesmigration cellulairepuce acryliquestimulation lectriquestimulation chimiquemigration des cellules canc reuses

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