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Article de méthode

Organoïdes de modèle pour les maladies infectieuses: la culture des droits humains et murins organoïdes d'estomac et microinjection de Helicobacter pylori

34.4K vues

⸱

DOI :

10.3791/53359

⸱

12 novembre 2015

 , 
1Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, University Medical Centre Utrecht

Dans cet article

Résumé

Les cultures dérivées de cellules souches recèlent un énorme potentiel pour modéliser les maladies infectieuses. Ici, la culture d’organoïdes gastriques de souris et d’humains dérivés de cellules souches adultes est décrite. Les organoïdes sont micro-injectés avec l’agent pathogène gastrique Helicobacter pylori.

Résumé

Récemment, des biologistes infectieux ont utilisé des cultures dérivées de cellules souches pour répondre au besoin de nouveaux modèles plus performants pour étudier les interactions hôte-pathogène. Trois sources cellulaires ont été utilisées : les cellules souches embryonnaires (CSE), les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) ou les cellules souches adultes. Ici, la culture d’organoïdes gastriques de souris et d’humains dérivés de cellules souches adultes est décrite et utilisée pour l’infection par l’agent pathogène gastrique Helicobacter pylori. Les glandes gastriques humaines sont isolées à partir de matériel de résection, enracinées dans une matrice basale et intégrées dans un milieu contenant des facteurs de croissance du facteur de croissance épidermique (EGF), de la R-spondine, de la Noggin, de Wnt, du facteur de croissance des fibroblastes (FGF) 10, de la gastrine et du bêta-inhibiteur du facteur de croissance transformant (TGF). Dans ces conditions, les glandes gastriques se transforment en organoïdes tridimensionnels contenant 4 lignées de l’estomac. Les organoïdes se dilatent indéfiniment et peuvent être congelés et décongelés de la même manière que les lignées cellulaires. Pour les études d’infection, les bactéries sont micro-injectées dans la lumière des organoïdes. Les organoïdes infectés sont traités pour l’imagerie. Les méthodes décrites peuvent être adaptées à d’autres organoïdes et à des infections par d’autres bactéries, virus ou parasites. Cela permet d’étudier les changements induits par l’infection dans les cellules primaires.

Introduction

L'étude des agents pathogènes repose sur des systèmes modèles adéquats pour imiter l'infection in vivo. Pour certains agents infectieux, des systèmes de modèles adéquats font défaut tandis que certains des systèmes utilisés sont loin d'être optimale. Un exemple est la bactérie gastrique Helicobacter pylori (H. pylori), qui est un lien de causalité liée au développement d'un cancer gastrique. Cependant, en l'absence d'un système de culture cellulaire approprié plus, de nombreuses études qui ont pour but d'analyser les mécanismes moléculaires sous-jacents des lignées cellulaires de cancer utilisation de développement de cancer, qui représentent le point d'extrémité de la cascade cancéreuse. Les cellules primaires, non-transformé serait un meilleur modèle pour ces études. Cependant, les cellules primaires sont disponibles uniquement à partir d'un petit nombre de donateurs et ne peuvent pas être cultivées sur des périodes de temps plus longues. Au cours des dernières années, la recherche sur les cellules souches a fait d'importants progrès pour fournir de nouvelles sources de cultures de cellules primaires pour l'étude de la biologie de l'infection.

Cultures detrois sources de cellules souches ont été utilisées: des cellules souches embryonnaires (ESC), des cellules pluripotentes induites souches (CISP) ou des cellules souches adultes. Ils ont été utilisés pour modéliser les infections par des virus, tels que le 1,2 cytomégalovirus ou le virus de l'hépatite C 3-7, des parasites tels que Plasmodium falciparum 8 ou 9 Toxoplasma gondii, et les bactéries, telles que Bacterioides thetaiotaomicron 10 ou 11 Salmonella enterica. Plus récemment, plusieurs approches ont été publiés pour modéliser infection à H. pylori avec organoïdes dérivées de cellules iPS ESC ou 12, les cellules souches adultes de souris 21,22 ou humaines cellules souches adultes 13 - 15.

Le développement des cultures organoïdes de cellules souches adultes est issue d'une étude, dans laquelle les cellules souches isolées à partir de simples épithélium intestinal murin ont été ensemencées dans une matrice en 3 dimensions etincorporé dans le milieu qui a imité environnement des cellules souches intestinales contenant EGF comme mitogene, R-spondine pour améliorer la signalisation Wnt et Noggin pour inhiber la protéine morphogénique osseuse (BMP) 16 signalisation. Notamment ces cultures ne nécessitent pas de co-culture avec des cellules mésenchymateuses. Dans ces conditions, les cellules souches prolifèrent et forment de petites structures avec des domaines hébergeant des cellules des cryptes intestinales, et les domaines qui contiennent les cellules de la villosité intestinale. Les organoïdes ainsi auto-organisent pour simuler la situation in vivo. Aujourd'hui, les cellules souches adultes de nombreux tissus murins et humains peut être cultivé in vitro et l'auto-organiser en organites qui ressemblent à leur homologue in vivo, tels que l'intestin grêle et le côlon 17, 13,18 estomac, le foie 19,20, du pancréas et 21 22 prostate.

Ici, nous fournissons un protocole de vidéo sur la souris de culture ou organoïdes gastriques humaines du cel souches adultesls et les micro-injection avec H. pylori. Ce protocole est basé sur les rapports précédents 13,18. Ce procédé peut être adapté pour la culture et infecter d'autres cultures telles que les organites organoïdes intestinaux.

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Protocole

1. Mise en place d'gastrique Organoid Culture

Remarque: Ce protocole peut être utilisé pour l'isolement des glandes gastriques de souris ou de tissus humains. Il est conseillé d'utiliser un tissu d'environ 1 cm². Tissu humain peut être obtenu à partir de biopsies ou de résections gastriques.

  1. Préparation du matériel
    Remarque: La matrice de sous-sol utilisé est Matrigel. Gardez la matrice de sous-sol sur la glace en tout temps. Stocker la matrice de sous-sol à -20 ° C et de dégel sur la glace avant utilisation. Milieu de base se réfère à avancée DMEM / F12 supplémenté avec HEPES; une source de glutamine approprié tel que Glutamax et des antibiotiques appropriés, tels que 1x Primocin. L'incubateur utilisé est un incubateur de culture cellulaire standard (37 ° C, une atmosphère humidifiée à 5% de CO 2)
    1. Stériliser les ustensiles de préparation par autoclavage ou en utilisant 100% d'alcool isopropylique: pinces acérées, des ciseaux, un scalpel et une lame de microscope en verre.
    2. Le jour avant l'isolement, placez un 24 welL cellule plaque de culture dans l'incubateur.
    3. Préparer la matrice de sous-sol selon les recommandations du constructeur. Préparer des aliquotes de 1 ml à éviter les cycles de gel-dégel.
    4. Préparer 500 ml chélateurs tampon et laisser refroidir sur glace. Préparer tampon 1x partir d'eau distillée stérile avec 5,6 mM de Na 2 HPO 4, 8,0 mM KH 2 PO 4, NaCl 96,2 mM, KCl 1,6, saccharose mM 43,4, 54,9 mM D-sorbitol, 0,5 mM DL-dithiothréitol (ATTENTION), pH 7. Si vous prévoyez plusieurs isolements, préparer une solution concentrée 5x sans DL-dithiothréitol. Filtre stérile du tampon. Avant l'isolement, diluer le tampon 5x avec de l'eau stérile pour 1x et ajouter DL-dithiothréitol juste avant l'isolement.
    5. Préparer et diluer tous les facteurs de croissance selon les recommandations du fabricant. Utilisez de petites aliquotes et éviter les cycles de gel-dégel. Facteurs de croissance fonctionnels sont cruciales pour les résultats.
    6. Milieu de base Laisser refroidir sur glace et refroidir la centrifugeuse à 46; C.
    7. Chauffez une autre aliquote de milieu de base à 37 ° C.
  2. Isolation des glandes
    1. Prélever environ 1 cm² de tissu dans la glace froide milieu de base. Garder sur la glace jusqu'à ce que la préparation. Bien qu'il soit préférable de traiter les tissus dès que possible, le tissu de magasin dans le milieu de la glace si nécessaire.
    2. Placez le tissu dans une boîte de 10 cm de Pétri et le couvrir avec un tampon de chélation de 1x froid. Laver en déplaçant doucement d'avant en arrière.
    3. Placez le tissu dans une boîte de 10 cm Petri sec. En utilisant une pince, retirer délicatement le mucus ainsi que la couche musculaire sous un stéréomicroscope. Laver le tissu dans un tampon chélateur de 1x à froid en déplaçant doucement d'avant en arrière.
    4. Placez 1 cm 2 de tissu sur un nouveau sèche de 10 cm, Petri. L'aide de ciseaux couper en petits morceaux de 20-50 environ 2-5 taille mm².
    5. En utilisant des pinces, placer tous les éléments dans un tube de 50 ml.
    6. Prenez 10 ml en plastique pipette stérile. Mouiller la pipette dans un tampon chélateur 1x. Gardermême en utilisant ces pipette pendant toute la procédure.
    7. Ajouter 10 ml de tampon froid 1x chélatant pour le tube de 50 ml. Lavez les morceaux par pipetage vigoureusement de haut en bas 10 fois. Laissez les morceaux installent. Retirer le surnageant.
    8. Recommencer le lavage (étape 1.2.7) jusqu'à ce que le surnageant est clair. Cela prend environ 50 à 100 ml de tampon chélatant 1x pour 1 cm² de tissu humain.
    9. Incuber les morceaux de tissu dans 20 ml de tampon 1 x chélatant supplémenté avec 10 mM d'EDTA à température ambiante pendant 10 min avec inversion douce toutes les 2 min.
      REMARQUE: Le temps et la température de cette incubation peuvent être optimisés soit pour la vitesse et / ou de préservation de l'architecture glandulaire. Ils peuvent aller de plusieurs heures d'incubation à 4 ° C sur une plate-forme de roulement à 5 min à 37 ° C dans un agitateur à 200 tours par minute. Quelques points de départ pour l'estomac de la souris sont 30 min à 4 ° C sur une plate-forme roulante et de l'estomac humain, 10 min à température ambiante.
    10. Pipette fois doucement monter et descendre l'aide de la pipette de 10 ml. Autoriser la PIEPE à régler. Jeter le surnageant.
    11. Aide de la pipette, transférer les morceaux pour un nettoyage 10 cm boîte de Petri. Retirer le liquide.
    12. Placer une lame de microscope en verre sur le dessus des morceaux de tissu. Observez le tissu intact sous un microscope inversé pour la culture cellulaire avec un grossissement de 10X.
    13. Appliquer une pression sur la lame de verre et de boîte de Pétri. Maintenez la fois dans la main (avec des gants stériles) et en appuyant sur le verre avec le pouce. La jante du tissu apparaît trouble indiquant que les glandes sont libérés sur le tissu.
    14. Respecter les glandes libérés sous un microscope inversé pour la culture cellulaire avec un grossissement de 10X.
    15. Recueillir les glandes et les tissus dans 30 ml froide milieu de base. Que de grands fragments de tissus installent.
    16. Recueillir le surnageant contenant glandes dans deux tubes de 15 ml.
    17. Centrifugeuse 5 min à 200 xg et 4 ° C. Surnageant défausse. Le culot contient des glandes isolées. Gardez-les sur de la glace.
  3. Ensemencement des glandes
    1. Pour l'ensemencement, garder matrice de sous-sol glacé, à tout moment, donc il va rester liquide.
    2. Alternative 1: Seed 6 puits d'une rangée de dilution.
      1. Suspendre le culot dans 60 ul de matrice de sous-sol.
      2. Préparer 5 stériles tubes de 1,5 ml sur glace avec chacun contenant 50 pi de matrice de sous-sol. 10 ul de transfert glandes / matrice sous-sol suspension dans le premier tube de 1,5 ml. Suspendre les glandes et transférer 10 pl de cette solution dans le tube 1,5 ml de la suivante. Répétez l'opération pour les prochaines tubes.
    3. Alternative 2: Graine une quantité calculée de glandes par puits. Commencez avec 100 glandes par 50 pi de matrice de sous-sol dans un puits d'une plaque à 24 puits.
      1. Doucement suspendez les glandes culot dans 10 ml de milieu basal. Placez 50 pi sur une surface propre de 10 ml boîte de Petri. Compter le nombre de glandes sous un microscope inversé pour la culture cellulaire avec un grossissement de 10X.
      2. Calculer la concentration de glandes dans la solution. Transférer le volume qui contains 400 glandes à un nouveau tube de 15 ml.
      3. Centrifugeuse 5 min à 200 xg et 4 ° C. Rejeter le surnageant et maintenir le tube sur la glace. Ajouter 200 ul matrice de sous-sol et soigneusement remettre en suspension. Garder sur la glace.
    4. Prendre la plaque C-24 de bien chaude 37 ° (voir l'étape 1.1.2) de l'incubateur. Placer une goutte de 50 ul dans les glandes sous-sol de matrice dans le centre du puits. La baisse sera de former un dôme.
    5. Soigneusement transférer la plaque arrière à l'incubateur de culture cellulaire. Laissez la matrice de sous-sol solidifier 10 min.
    6. Préparer le milieu chaud avec tous les facteurs de croissance.
      1. Pour glandes humains: Supplément au milieu de base avec les facteurs de croissance suivants pour organoïdes gastriques humaines: 50 ng / ml d'EGF, le milieu de caboche conditionné 10%, 10% moyen R-spondin1 conditionné, 50% moyen Wnt-conditionné, 200 ng / ml de facteur de croissance des fibroblastes (FGF) 10, 1 nM de la gastrine, et 2 uM de l'inhibiteur TGFbeta et 10 uM rho-associé superhélice formant protéine sérine / thréonine kinase inhibiteur (RHOKi).
      2. Pour glandes murins: Compléter le milieu de base avec les facteurs de croissance suivants pour organoïdes gastriques de souris: 50 ng / ml d'EGF, le milieu de caboche conditionné 10%, 10% moyen R-spondin1 conditionné, 50% moyen Wnt-conditionné, 100 ng / FGF10 ml, 10 nM gastrine, inhibiteur 0,5 mM et 10 uM TGFbeta RHOKi.
    7. Prenez la plaque de l'incubateur. Soigneusement ajouter 500 pi de milieu avec tous les facteurs de croissance (1.3.6) à chaque puits sans déranger la matrice de sous-sol. Placez-le revenir à l'incubateur.
    8. Actualiser le moyen 3 fois par semaine (tous les 2-3 jours). Pour rafraîchir moyen, retirez l'ancien milieu de laisser la chute de la matrice de sous-sol intact. Ajouter délicatement, milieu chaud frais avec tous les facteurs de croissance. Ne pas ajouter RHOKi. Seulement ajouter RHOKi directement après le semis des glandes ou après la séparation des organites (étape 2).

2. Passage de gastrique Organoid Culture Avant microinjection.

ove_content "> Remarque: Chaque type de culture organoïde a son propre temps de doublement de la souris intestinale ainsi que les cultures gastriques sont généralement divisés 1:. 5 tous les 5-7 jours cultures intestinales humaines sont divisées 1:.. 5 tous les 10-12 jours humain cultures gastriques sont divisés 1: 5 tous les 14 jours si elle est amorcée à partir de cellules simples, organoïdes gastriques humaines peuvent également prendre 20 jours pour former correctement, il est un bon signe si les structures naissantes entourent la lumière centrale Dans ce protocole, organites sont divisés en... 4 plaques à puits de micro-injection. Maintien de organites suit le même protocole, mais peuvent utiliser toute autre plaque de culture de cellules, telles que des plaques de culture cellulaire de 24 puits standard.

  1. Préparation du matériel
    1. Pipettes Pasteur autoclave.
    2. Le jour avant le passage, placez un 4 plaque de culture de cellules dans l'incubateur à 37 ° C. Les plaques ainsi 4 ont de faibles bords et permettent micromanipulation.
    3. Préparer la matrice de sous-sol selon les recommandations du constructeur. Le jour de passaging, dégeler matrice de sous-sol sur la glace.
    4. Préparer et diluer tous les facteurs de croissance selon les recommandations du fabricant.
    5. Milieu de base Laisser refroidir sur glace et refroidir la centrifugeuse à 4 ° C.
  2. Passage des cultures Organoid
    1. Prenez la plaque avec les organites de l'incubateur. Retirer moyen d'un puits.
    2. Ajouter 1 ml de milieu de base à froid de la matrice de sous-sol dans le puits. L'utilisation d'un 1 ml micropipette, Pipette vigoureusement de haut en bas jusqu'à ce que la matrice de sous-sol est divisé. Transférer dans un tube de 15 ml. Placez sur la glace.
    3. Prenez une pipette Pasteur en verre et une source d'incendie, comme un bec Bunsen.
      1. Maintenez la pointe de la pipette dans le feu jusqu'à l'ouverture de la pointe a diminué de 1,5 mm à environ 0,5 mm (figure 1). Laissez la pipette refroidir à TA.
      2. Mouiller la pipette en milieu de base. Une pipette de manière optimale réduit prendra le moyen visiblement plus lent que d'une pipette de non-rétréci, mais il faudra encore toutOW pipetage bien.
    4. Prenez organoïdes dans la pipette et la pipette vigoureusement 10x de haut en bas. La rupture des organites peut être observé à l'oeil nu.
    5. Ajouter 9 ml de milieu de base froid et centrifuger pendant 5 min à 200 xg et 4 ° C.
    6. Prenez soin de tout surnageant. Suspendre le culot dans 250 matrice de sous-sol ul. Garder sur la glace.
    7. Prenez le 4 plaque de culture chaud 37 ° C et déposer une goutte de la matrice 50 organoïdes ul / sous-sol dans chaque puits.
    8. Transférez avec précaution la plaque arrière à l'incubateur. Laissez la matrice de sous-sol solidifier à 37 ° C pendant 10 min.
    9. Préparer le milieu approprié pour souris ou humains organites comme indiqué dans l'étape 1.3.6.
    10. Prenez la plaque de l'incubateur et superposer chaque goutte de matrice de sous-sol avec 500 pi de milieu.
    11. Transférer la plaque dans l'incubateur.
    12. Actualiser le moyen 3 fois par semaine tous les 2-3 jours (voir 1.3.8.).
    13. Pour le gel des organites, Mechanperturber ment organites comme décrit pour la division dans ce protocole (étapes 2.2.1-2.2.5.). Suspendre les fragments organoïdes dans 500 ml de gel moyen et geler à -80 ° C en utilisant cryotubes et un récipient de congélation. Pour le stockage à long terme, transférer les tubes à l'azote liquide.
    14. Pour la décongélation des organites, préparer la plaque de la culture, de la matrice de sous-sol, facteurs de croissance, milieu froid et chaud comme indiqué dans les étapes 1.1.2, 1.1.3., 1.1.5., 1.1.6., 1.1.7. Réchauffez le flacon congelé en utilisant un bain d'eau, et les cellules de transfert immédiatement après la décongélation à un tube de 15 ml avec 10 ml froide milieu de base. Centrifugeuse et la plaque les cellules comme indiqué dans 2.2.5 à 2.2.12.
      Note: La micro-injection d'organites est laborieuse, mais offre la possibilité unique d'étudier l'interaction en 3D.
    15. Si les études 3D ne sont pas nécessaires, des semences organoïdes en deux dimensions. Pour cela, perturber les organites comme prévu dans les étapes 2.2.1 à 2.2.6. Ajouter moyen 2250 ul froid avec tous les facteurs de croissance à 250 pi-sol de maTrix avec des fragments organoïdes.
      1. Seed dans 5 puits d'une plaque à 24 puits avec 500 pi par puits. Changer le milieu de 3 fois par semaine, avec le remplacement attentivement les supérieurs 400 pi seulement, pour maintenir la matrice de sous-sol au bas de la plaque sans être dérangé.
        Remarque: organoïdes joindra à la plaque de culture cellulaire et d'élargir en 2D. La microscopie électronique a montré que le côté apical des cellules tournée vers le milieu du puits (données non présentées).
      2. Avant l'infection, échanger tout moyen, y compris matrice de sous-sol, pour permettre aux bactéries de se fixer aux cellules. Un protocole similaire a également été décrite pour une infection par H. pylori 14. Des couches de cellules 2D peuvent contenir tous les types de cellules qui sont présentes dans organites 3D.

3. microinjection de Organoid Culture.

Remarque: Ce protocole peut être utilisé pour micro-injection dans des bactéries organites. Il peut être utile de commencer l'injection avec organoïdesqui sont plus permissives à la micro-injection. Par exemple, organoïdes gastriques de souris peuvent se développer dans de très grandes organoïdes kystiques qui sont faciles à cibler.

  1. Préparation du matériel
    1. Tirez un capillaire de verre en deux aiguilles d'injection à l'aide d'un extracteur micropipette, selon les recommandations du constructeur. L'extracteur micropipette va chauffer le capillaire de verre au milieu et va tirer le capillaire en deux parties, générant ainsi deux aiguilles de verre. Il est pratique pour tirer plusieurs aiguilles et les stocker dans une boîte de Pétri propre.
    2. Pour permettre à l'infection bactérienne, les antibiotiques de retirer tous les médias pendant au moins 3 changements de milieu (= une semaine). Ce va diluer les antibiotiques de matrice de sous-sol. Si l'on utilise une souche bactérienne qui est résistante à un antibiotique spécifique, ajouter cet antibiotique spécifique pour minimiser les risques de contamination.
    3. Préparer le banc de travail pour micro-injections. Pour les travaux à différents niveaux de biosécurité, il peut être nécessaire de placer une chaîne stéréomicroscope dans un banc stérile. Dans ce protocole, injecter H. pylori sous le niveau de biosécurité 2 conditions sous un stéréomicroscope l'intérieur d'un banc stérile.
    4. Culture des bactéries selon des protocoles standard 13,23.
    5. Pour estimer la multiplicité d'infection (MOI), deux paramètres: estimer le nombre de bactéries et le nombre de cellules par organoïde comme décrit ci-dessous. La MOI peut mettre en corrélation avec les résultats, par exemple avec des hôtes IL-8 13 expression de l'ARNm.
      1. Pour calculer la densité bactérienne dans la solution de l'infection, d'abord établir la courbe standard des unités de densité et optiques formant colonies (UFC) selon des protocoles standard 24. Une densité optique de 0,1 à 550 nm devrait donner environ 10 7 UFC / ml.
      2. Pour estimer le nombre de cellules par organoïde, compter le nombre des organites dans 1 bien. Perturber organites comme indiqué dans les étapes 2.2.1-2.2.4. Après centrifugation 5 min à 200 x g et 4 ° C,ajouter 1 ml de solution de dissociation enzymatique et remettre en suspension.
        1. Incuber à 37 ° C avec des secousses répétées pendant 5-10 min. Déterminer si les cellules ont dissocié en cellules individuelles sous le microscope (microscope inversé telles que Leica DMIL au grossissement 10X). Si nécessaire de prolonger l'incubation.
        2. Compter les cellules par organoïde utilisant un hémocytomètre et calculer le nombre de cellules par organoïde. Organoïdes gastrique humaine avec un diamètre d'environ 200 um ont environ 4000 cellules. L'injection de 0,2 ul d'une solution bactérienne à 1 x 10 9 bactéries par ml résultats dans une MOI approximative de 50.
  2. L'injection d'organites.
    Remarque: Pour la micro-injection, l'aiguille de verre est stabilisé dans un support, qui peut être manoeuvré en 3 dimensions par un micromanipulateur. Organites restent dans la matrice de sous-sol à l'intérieur du puits. En raison de la taille et de positionnement dans le bien, pas tous les organites sont également unmENABLE à l'injection. Habituellement, les 30 plus grandes organoïdes dans un puits peuvent être ciblées en 5 min.
    1. Récolte bactéries et les laver dans un milieu de base selon des protocoles standard 24.
    2. Calculer le nombre de bactéries par ml selon la densité optique (voir l'étape 3.1.5.1). Diluer les bactéries à 1 x 10 9 bactéries par ml dans du milieu basal.
    3. Prenez une aiguille de verre. Aide d'une pince briser la pointe de sorte que l'ouverture sera d'environ 10 m de large.
    4. Insérez l'aiguille dans le support d'injection et le fixer au micromanipulateur.
    5. Prenez environ 10 ul solution bactérienne dans l'aiguille.
    6. Placez une plaque 4 de puits avec des bords bas contenant cultures organoïdes sous la loupe binoculaire.
    7. Navigation avec le micromanipulateur, visent une seule organoïdes avec l'aiguille. Placez l'aiguille à proximité de la organoïde puis insérer l'aiguille dans le organoïde avec un mouvement rapide. Injecter approximately 0,2 ul dans chaque solution bactérienne en utilisant le micro-injecteur organoïde.
  3. Récolte organoïdes pour toute analyse.
    1. A titre d'exemple, fixer organoïdes après 4 h. Retirer le surnageant et ajouter 1 ml de 2% de formaldéhyde et incuber 20 min à température ambiante ou O / N à 4 ° C. Organites peuvent être traitées pour l'immunohistochimie selon des procédures standard 25.

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Résultats

Ce protocole permet l'isolement des glandes gastriques (figure 2). Presse-étoupe sont ensemencées dans la matrice de sous-sol, qui se solidifie en tant que goutte à l'intérieur d'un puits, fournissant un cadre trois dimensions riche en collagène et la laminine pour permettre les glandes deviennent des organites (Figure 3). Organoïdes commencent généralement que de petits kystes et dans 12-16 jours, ils se dilatent dans des sphères d'un diamètre de 50-300 um (figu...

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Discussion

Ce protocole décrit l’utilisation d’organoïdes primaires non transformés en constante expansion à partir de cellules souches adultes pour la biologie des infections. Les étapes critiques sont i) l’isolement des glandes viables, ii) l’expansion des organoïdes et iii) la micro-injection. Vous trouverez ci-dessous quelques suggestions de modifications, de dépannage et de considérations techniques.

Par rapport à d’autres méthodes d’isolement, qui utilisent une agitation vigoureuse ou un pipetage ...

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Déclarations de divulgation

Hans Clevers est l’inventeur de plusieurs brevets pour la culture d’organoïdes. Sinon, les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la bourse Marie Curie de l’UE (EU/300686-InfO) à S.B. et un prix de recherche de la Fondation européenne unie de gastroentérologie à H.C. Nous tenons à remercier Harry Begthel, Jeroen Korving et le Centre d’imagerie Hubrecht pour leur assistance technique, Meritxell Huch pour son aide avec la culture initiale d’organoïdes et Yana Zavros pour la discussion.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Moyen
HEPESInvitrogen15630-056
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-028
Matrigel, DFG, sans phénolBD356231
GlutaMAXInvitrogen35050-079Concentration de matière 200 mM, concentration finale 2 mM
B27Invitrogen17504-044Concentration de matière 50 x, concentration finale 1x
N-AcétylcystéineSigma-AldrichA9165-5GConcentration de matière 500 mM, concentration finale 1 mM
de recombinaison MURINEEGF InvitrogenPMG8043Concentration de base 500 µ ; g/ml, concentration finale 50 ng/ml
Recombinant humain FGF10Peprotech100-26Concentration de base 100 µ ; g/ml, concentration finale 200 ng/ml
TGF&bêta ; i A-83-01Tocris2939Concentration de stock 500 µ ; M, concentration finale 2 & micro ; M  ;
NicotinamideSigma-AldrichN0636Concentration de stock 1 M, concentration finale 10 mM  ;
[Leu15]-GastrinSigma-AldrichG9145Concentration de stock 100 µ ; M, concentration finale 1 nM
RHOKi Y-27632Sigma-AldrichY0503Concentration de matière 10 mM, concentration finale 10 µ ; M
Wnt3A milieuLignée cellulaire stable générée dans le laboratoire Clevers. Concentration finale 50 %. Les cellules peuvent être obtenues auprès de Hans Clevers.
conditionné à la R-spondine1Lignée cellulaire stable générée dans le laboratoire Kuo. Concentration finale 10 %. La lignée cellulaire peut être obtenue auprès de Calvin Kuo, Stanford.
conditionné NogginLignée cellulaire stable générée dans le laboratoire Clevers. Concentration finale 10 %. Les cellules peuvent être obtenues auprès de Hans Clevers.
R-spondin3R& D3500-RS/CFAutre source de R-spondine. Cela a été testé sur des organoïdes intestinaux humains (1 & micro ; g/ml), mais pas encore sur organoïdes gastriques.
NogginPeprotech120-10Source alternative pour la caboche. Cela a été testé sur des organoïdes intestinaux humains (100 ng/ml), mais pas encore sur des organoïdes gastriques.
TrypLE expressLife Technologies12605036solution de dissociation enzymatique
CoolCell® ; Récipients de congélation cellulaire sans alcoolbiocisionBCS-405
Récupération Culture cellulaire Moyen de congélationInvitrogen12648-010
Antibiotiques
PrimocinInvivogenant-pm-1Une composition d’antibiotiques contre les bactéries et les champignons. Il est utile après l’initiation d’une culture. Pour une culture à long terme, vous pouvez passer à d’autres antibiotiques ou aucun.
Pénicilline/StreptomycineInvitrogen15140-122Concentration mère 10 000/10 000 U/ml, concentration finale 100/100 U/ml. Peut être utilisé en alternative à Primocin en culture à long terme.
Autre
Neolabs2-1033Les pinces à épiler à pointes fines sont utiles pour l’élimination de la couche musculaire du tissu.
Multiplats à 4 puitsThermo Scientific144444Vous pouvez utiliser d’autres paraboles. Ceux-ci étaient particulièrement utiles pour les micro-injections car ils ont un bord extérieur bas et permettent une plus grande mobilité pour le manipulateur.
MicromanipulateurNarishigeM-152
MicroinjecteurNarishigeIM-5B
StéréomicroscopeLeicaMZ75
ÉtabliClean AirFabriqué sur mesure pour s’adapter au stéréomicroscope en condition ML2
CapillairesHarvard AppareilGC100T-10mm de diamètre extérieur, 0,78 mm de diamètre intérieur.
Extracteur de micropipetteSutter InstrumentsFlaming Brown Extracteur
anti anticorps Cag ASanta Cruzsc-25766
conditionné Milieu Milieu Pince à épiler 1 de micropipette

Références

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