Article de méthode

Génération et de la Culture du sang excroissance des cellules endothéliales de sang périphérique humain

20K vues

⸱

DOI :

10.3791/53384

⸱

23 décembre 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Cambridge, 2Papworth Hospital

Dans cet article

Résumé

Ce protocole permet la génération et la caractérisation fiables de cellules endothéliales de croissance sanguine (BOEC) à partir d’un petit volume de sang périphérique adulte. Les BOEC peuvent être utilisés comme substitut des cellules endothéliales de patients atteints de troubles vasculaires et comme substrat pour la génération de cellules souches pluripotentes induites.

Résumé

Historiquement, la disponibilité limitée de cellules endothéliales primaires chez les patients atteints de troubles vasculaires a entravé l’étude des mécanismes moléculaires sous-jacents à la dysfonction endothéliale chez ces individus. Cependant, l’identification récente de cellules endothéliales de croissance sanguine (BOEC), générées à partir de progéniteurs endothéliales circulants dans le sang périphérique adulte, pourrait contourner cette limitation en offrant un substitut cellulaire primaire de type endothélial pour les cellules endothéliales dérivées du patient. Au-delà de leur valeur pour la compréhension de la biologie endothéliale et de la modélisation des maladies, les BOEC ont des utilisations potentielles dans les thérapies de transplantation de cellules endothéliales. Ils constituent également un substrat cellulaire approprié pour la génération de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) par reprogrammation nucléaire, offrant un certain nombre d’avantages par rapport aux autres types de cellules. Nous décrivons une méthode pour la génération, la culture et la caractérisation fiables de BOEC à partir de sang périphérique adulte pour une utilisation dans ces applications et d’autres. Cette approche (i) permet de générer des cellules endothéliales spécifiques au patient à partir d’un volume relativement faible de sang périphérique adulte et (ii) produit des cellules très similaires aux cellules endothéliales primaires en termes de morphologie, de signalisation cellulaire et d’expression génique.

Introduction

Jusqu'à récemment, la génération post-natal de nouveaux vaisseaux sanguins était censé se produire exclusivement par l'entremise d'un processus appelé angiogenèse, définie comme la germination de nouveaux vaisseaux à partir des cellules endothéliales des vaisseaux préexistants. 1 Ce processus contraste de la vasculogenèse, ou la formation de novo de vaisseaux sanguins à partir de progéniteurs endotheliales, qui a été supposée se produire exclusivement pendant l'embryogenèse. 2 Cependant, des études plus récentes ont identifié et isolé circulant cellules progénitrices endothéliales (EPCs) dans le sang périphérique des adultes. Ces cellules ont la capacité de se différencier en cellules endothéliales matures en culture et sont soupçonnés de participer à la vasculogenèse postnatale. 3,4

Les protocoles pour l'isolement et l'expansion de ces EPC impliquent généralement la culture de cellules périphériques mononucléaires de sang (les PBMNCs) dans des milieux contenant des facteurs de croissance endothéliaux, y compris vascular facteur de croissance endothelial (VEGF) et le facteur de croissance des fibroblastes-2. 8/5 cultures EPC produisent une variété de types de cellules très différents. Les cultures initiales (<7 jours) sont dominées par un type de cellule monocytaire, connu dans la littérature comme «précoces» EPC. Malgré leur nom, ces cellules expriment le CD14 marqueur de monocyte, sont négatives pour le CD34 de marqueur de cellules progénitrices et expriment des niveaux minimes de la classique marqueurs endothéliaux CD31 et récepteur de VEGF 2 (VEGFR2). 5 culture continue donne lieu à une population secondaire de cellules, connu comme EPC fin excroissance ou cellules endothéliales excroissance de sang (BOECs), qui apparaissent comme des colonies discrètes de cellules endothéliales-like. Contrairement aux premiers EPC monocytaires, BOECs, qui ont également été appelé formant des colonies des cellules endotheliales (les CPEF), des cellules endotheliales excroissance ou des cellules endothéliales de fin de excroissance, présentent la morphologie pavée qui est typique des monocouches de cellules endotheliales et sont hautement similaires en marqueur de surface5 et l'expression du gène 9 à mûrir les cellules endothéliales.

La génération de cellules endotheliales en forme à partir de sang périphérique offre plusieurs avantages, en particulier pour l'étude de la dysfonction des cellules endotheliales associées à des troubles vasculaires tels que l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) 10 ou maladie de von Willebrand. 11 Avant la disponibilité de BOECs, endothelial cellules ne pouvaient être obtenues à partir d'organes explantées au moment du décès ou de la transplantation d'organes, ou isolés à partir de la veine ombilicale à la naissance. Cette disponibilité réduite représentée une sérieuse limitation à comprendre la biologie des cellules endotheliales à partir de patients souffrant de troubles cardio-vasculaires, ainsi que les interactions entre les cellules endothéliales et soit des cellules de sang ou de cellules murales. En outre, isolement et de culture une population pure de cellules endothéliales à partir de ces sources est techniquement difficile et les cellules obtenus par ces méthodes présentent seulement une limited capacité proliférative. BOECs offrent donc un substitut précieux pour l'isolement et la culture de cellules endothéliales primaires provenant de patients.

En plus de leurs applications in vitro, BOECs sont également potentiellement utiles dans des thérapies de transplantation autologue de cellules. Ces applications comprennent à la fois la transplantation de cellules endotheliales, de promouvoir la néovascularisation (voir 12 et les références qui y sont citées), ainsi que la génération de cellules souches pluripotentes induites (CSPi). 13 iPSCs BOEC dérivés peuvent être utilisés pour la modélisation de la maladie et offrent un immense potentiel que le départ matériel pour les thérapies cellulaires autologues. BOECs reprogrammer plus rapidement et avec une plus grande efficacité que les fibroblastes de la peau. En outre, BOECs permettent également pour la génération des CSPi qui sont exempts d'anomalies du caryotype, ce qui est une caractéristique essentielle de toute technologie qui sera adapté pour les applications de translation. La capacité de générer iPSCs partir d'un échantillon de sang du patient unLSO élimine la nécessité d'une biopsie de la peau et la génération de fibroblastes de la peau, facilitant ainsi la génération de cellules de patients atteints de troubles cicatrisation ou les très jeunes enfants.

Le protocole détaillé ci-dessous, approuvé par et menées en conformité avec les directives du Comité Service d'éthique national de recherches (Est de l'Angleterre), fournit une méthode simple et fiable pour la génération de BOECs avec plus de 90% d'efficacité à partir d'un volume relativement faible (60 ml) de sang périphérique. Ces cellules sont hautement prolifératifs et peuvent être soumises à des passages à plusieurs reprises, ce qui permet la production de centaines de millions de cellules à partir d'un seul échantillon de sang.

Protocole

Un schéma du protocole BOEC de production est représenté sur la Figure 1.

1. prélèvement sanguin et gradient de densité centrifugation

  1. Pour chaque donneur, ajouter 3 ml de citrate de sodium pour chacun des deux tubes de 50 ml à centrifuger coniques. Recueillir 60 ml de sang par ponction veineuse et ajouter 30 ml dans chaque tube. Retourner doucement 2-3 fois pour mélanger. Utilisez aussi peu que 40 ml de sang dans le protocole, avec des volumes de citrate ajusté en conséquence.
    NOTE: Il est essentiel que les échantillons de sang sont traitées dans un délai de 2 heures de la collecte. Traitement des résultats sanguins retardé une réduction marquée du rendement de la colonie excroissance.
  2. Préparer de nouveaux tubes coniques contenant un milieu de centrifugation en gradient de densité selon la première inversion de la bouteille plusieurs fois pour mélanger. Dans une hotte stérile, ajouter 15 ml de milieu de centrifugation en gradient de densité de 50 ml par tube conique (1 tube pour 10 ml de sang, 6 tubes par donneur).
  3. Diluer sang 1: 1 avec le phosphate de Dulbecco-Buffered Saline (DPBS). Incliner le tube contenant le milieu de centrifugation à gradient de densité à un angle de 20 ° avec la surface de travail. Utilisation d'une aide de la pipette et une pipette de 25 ml sérologique, la couche lentement 21 ml de sang dilué sur le dessus de la moyenne en ajoutant progressivement le sang en bas de la paroi du tube incliné.
    REMARQUE: Faire ainsi minimiser le mélange du sang avec la couche de gradient de densité et produira un buffy coat serré, ainsi que l'amélioration des rendements.
  4. Centrifuger les échantillons à 400 xg pendant 35 min à température ambiante avec l'accélérateur et le frein hors tension.
  5. Au cours de cette période de centrifugation, commencer le revêtement de collagène décrit dans les étapes 2.1 - 2.4. Assurer que ces mesures ont été réalisées avant de procéder à l'étape 3.1.

2. Collagène Revêtement de T-75 Flacon et préparation de milieu de culture

REMARQUE: Effectuer les étapes suivantes dans une hotte de culture cellulaire.

  1. Préparer une solution de collagène / ml de 50 pg par dilution de stock TyPE collagène dans 10 ml de 0,02 M d'acide acétique. Exemple: pour le collagène mère à une concentration de 4,05 mg / ml, ajouter 123,5 pi de collagène à 10 ml d'acide acétique 0,02 M. Filtre stérile collagène suspension avant de l'utiliser.
  2. En utilisant une pipette sérologique, ajouter 7,5 ml de solution de collagène à une culture de cellules flacon T-75. Ce volume donne 5 ug de collagène / cm 2 (ou 375 ug / flacon). Flacon de Coat pendant 1 heure à température ambiante.
  3. Préparation du milieu de croissance utilisé pour la production endothéliale BOEC en la complétant basal endothelial moyen avec des suppléments de facteurs de croissance fournies par le fabricant. Ajouter tous les suppléments, mais ne pas ajouter de sérum. Pour préparer 15 ml de milieu de production BOEC, ajouter 2,5 ml de sérum de veau fœtal défini (FBS) à 12,5 ml de milieu de croissance de l'endothélium contenant les suppléments de facteurs de croissance.
  4. Suivez les étapes décrites dans la section 3. Après la période de revêtement de 1 h, aspirer la solution de collagène et laver l'acide acétique résiduel par pipetagedans 10 ml de DPBS. Aspirer le DPBS et répétez cette étape de lavage une fois de plus. Si la suspension cellulaire obtenue lors de l'étape 3.3 est prêt pour le placage pas à l'heure actuelle, ajouter 5 ml de milieu de production BOEC dans le flacon pour maintenir le revêtement de collagène de dessèchement.

3. Collecte et Placage de PBMNCs

  1. Suite à la centrifugation à gradient de densité indiqué à l'étape 1.4, recueillir soigneusement la couche leuco-plaquettaire en utilisant un transfert en plastique pipette stérile. Collection de la couche leucocyto-plaquettaire devrait donner environ 20 ml de suspension de cellules et de plasma à partir de chaque tube. Éviter de transférer le milieu de gradient de densité.
  2. Diluer la suspension cellules mononucléées 1: 1 dans du DPBS et mélanger par inversion. Centrifuger à température ambiante pendant 20 min à 300 g avec le frein et l'accélérateur au maximum.
  3. Après la centrifugation, aspirer les cellules du surnageant et remettre en ajoutant 1 ml de milieu de production BOEC de chaque pastille et à plusieurs reprises pipetage de haut en bas. Cellule de la piscine une suspensionsd appoint volume total à 10 ml avec le milieu restant.
  4. Pour obtenir une estimation du nombre total de cellules, échantillon de 10 pi de suspension cellulaire et diluer 50x avec 490 pi de la solution de Turk, qui lyser les globules rouges. Compter un échantillon de 10 ul de la suspension cellulaire diluée en utilisant un hémocytomètre.
    REMARQUE: 60mL de sang devrait produire environ 100-150 x 10 6 globules blancs pour le placage.
  5. Plaque de cellule entière suspension en un seul, le collagène revêtues flacon T-75, complémentaire du volume moyen de 15 ml / flacon et de la culture à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO 2. Cellules étalées à cette époque représentent passage 0.
    NOTE: Il est possible de geler les PBMNCs isolés avant l'isolement BOEC afin d'en tirer les BOECs à une date ultérieure ou afin de transporter les PBMNCs à un laboratoire différent où les BOECs peuvent être générés. Cependant, il est important de noter que le gel PBMNCs pourraient réduire l'efficacité de l'isolement BOEC. See section 8 ci-dessous pour la méthode.

4. à long terme de culture cellulaire

  1. Changer milieu tous les 2 jours par l'addition de 15 ml de milieu de production BOEC frais (5: 1 mélange de milieu de croissance des cellules endotheliales et défini FBS). Pour le week-end, les modifications moyennes peuvent être retardés à tous les 3 jours.
    REMARQUE: colonies excroissance devraient apparaître entre 7 et 14 jours de culture.
  2. Surveiller le flacon de culture BOEC les jours 7-14 pour l'apparition de colonies excroissance. Identifier les colonies comme des groupes circulaires de cellules présentant un pavé endothéliale morphologie classique.
  3. Une fois qu'une colonie ou plusieurs colonies sont identifiées dans le flacon, continuer avec changements de milieu et permettent colonies se développer à environ 1000 à 2000 cellules par colonie avant repiquage. Déterminer le nombre de cellules par colonie par une estimation visuelle approximative.
    NOTE: Comme un guide, il est habituel de passage colonies excroissance initiales Une semaine après l'identification de la première colonie de l'excroissance.
  4. Les cellules Passage par le rinçage des flacons à deux reprises avec 10 ml de DPBS. Ajouter 5 ml de trypsine-EDTA 1X et incuber dans un incubateur à 37 ° C pendant 5 min. Après 5 min, neutraliser la trypsine avec 10 ml de milieu (contenant FBS) et mettre en suspension les cellules avec un pipetage répété.
  5. Centrifugeuse suspension à 300 g pendant 5 min, remettre en suspension dans 15 ml de milieu frais de génération BOEC et plaque entière suspension de cellules dans un nouveau flacon T-75 (représentant passage 1, P1). Aucun revêtement de collagène est nécessaire.
  6. Continuer changements milieu tel que décrit ci-dessus jusqu'à ce que les cellules sont confluentes (environ 3-5 x 10 6 cellules par flacon). Une fois confluentes, les cellules de passage comme décrit dans l'étape 4.3.
    NOTE: De passage 2 et suivantes, les cellules ne nécessitent plus BOEC moyen de génération et peut être cultivé dans un milieu de croissance des cellules endothéliales et 10% la norme de FBS inactivé à la chaleur. Revêtement de collagène peut être utilisé comme une étape facultative aller de l'avant, comme il existe des preuves pour suggérer que la présence de collagène peut améliorer prolifer BOECtaux d'ation.
  7. Pour passages continue, plaque pas moins de 750 000 cellules par flacon T-75 que de faibles densités cellulaires peuvent causer les BOECs pour arrêter la prolifération.

5. congélation et décongélation Cultures BOEC

  1. Trypsiniser cellules telles que décrites à la section 4.3 et centrifuger à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 10 ml de milieu. Cela ne nécessite pas un milieu de croissance des cellules endotheliales; DMEM avec 10% de FBS standards sera suffisant. Prélever un échantillon de 10 ul de la suspension de cellules pour effectuer un comptage manuel des cellules en utilisant un hémocytomètre.
  2. Centrifuger de nouveau et remettre en suspension à 2x10 6 cellules / ml dans un milieu de cryoconservation glacé (DMEM 40% FBS à 50% et 10% de DMSO). Ajouter 0,5 ml (10 6 cellules) dans chaque flacon, Placer les flacons dans un isopropanol froid navire et le lieu de cryoconservation de la glace dans un congélateur à -80 ° C pendant au moins 2 heures avant le transfert à l'azote liquide. Ne laissez pas les cellules à -80 ° C pendant plus de 24 h.
  3. Pour décongeler les cellules, ajouter 10 ml de milieu préchauffé à un tube de centrifugation conique de 15 ml.
    Remarque: Lors de la décongélation des cellules passage 1, décongeler dans un milieu de croissance des cellules endotheliales supplémenté avec 20% de FBS défini pour les 2 premiers jours après la décongélation. Cela conduit à un isolement cellulaire plus stable à l'avenir.
  4. Éliminer les cellules de l'azote liquide et décongélation dans un bain d'eau à 37 ° avec agitation douce jusqu'à ce que seul un petit cristal de glace est laissé dans le flacon. Ajouter le contenu du flacon goutte à goutte sur le tube de centrifugeuse conique et centrifuger à 300 g pendant 5 min.
  5. Aspirer le surnageant et remettre en suspension culot cellulaire dans 10 ml EGM-2MV + 10% de FBS. Ajouter à T-75 flacon et remplir moyenne à 15 ml.

6. Caractérisation des BOECs par cytométrie en flux

  1. Une fois que les colonies BOEC décrits à la section 4 ont été autorisés à se développer, Trypsiniser cellules telles que décrites à la section 4.4 et remettre en suspension à une concentration de 10 6 cellules par ml dans un tampon de coloration (DPBS esprith 2% de FBS et 2 mM d'EDTA).
  2. Combinez 10 5 cellules avec des anticorps conjugués au fluorochrome dirigés contre CD45, CD14, CD34, CD31 (utilisation tout à la dilution 1:20) ou VEGFR2 (dilution 1:10) (voir le tableau 1 pour plus de détails). Incuber pendant 30 min à 4 ° C dans l'obscurité.
  3. Laver les cellules avec 1 ml coloration tampon et centrifuger à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 400 pi de tampon de coloration pour l'analyse. Gardez les cellules à 4 ° C et protégé de la lumière avant l'analyse.
  4. Effectuer l'analyse cytométrique sur un cytomètre équipé pour détecter les anticorps conjugués utilisés par fluorescence dans l'essai.
  5. Utiliser un échantillon non coloré BOEC pour identifier la population de cellules sur le cytomètre en ajustant vers l'avant et des tensions de dispersion latérale, ainsi que les tensions pour les canaux de FITC et de l'APC.
  6. Déterminer gating seuils utilisant des cellules d'isotype teinté pour chaque fluorochrome. Évaluer la positivité pour chaque marqueur de surface cellulaire sur la base de la presence d'un décalage du pic d'intensité de fluorescence par rapport au témoin isotypique pour le fluorochrome en cours d'analyse.

7. Caractérisation de microscopie immunofluorescente par BOECs

  1. BOECs de plaque dans une 24 puits, à fond plat plaque de culture de tissu sans lamelles à une densité de 5 x 10 4 cellules dans 500 pi de milieu de croissance des cellules endothéliales + 10% inactivé par la chaleur FBS par puits et laisser adhérer et de grandir à 37 ° C, 5% de CO2 jusqu'à ce que les cellules couvrir au moins 70 à 80% de la surface de chaque puits (estimation de confluence par examen visuel sous un microsope lumière).
  2. Laver les cellules dans chaque puits pendant 5 minutes avec 1 ml de DPBS.
  3. Fixer les cellules O / N à 4 ° C avec 500 ul d'une solution de paraformaldehyde à 4% dans du DPBS.
  4. Laver les cellules de 3 x 5 min avec 1 ml de DPBS par puits. Ajouter et supprimer les DPBS aide d'une pipette et un aspirateur, respectivement.
  5. Perméabiliser les cellules pour 3 x 10 min avec 0,2% de polysorbate 20 dans du DPBS.
  6. Incuber les cellules pendant 1 heure à température ambiante dans du tampon de blocage contenant 10% de FBS dans du DPBS.
  7. Des cellules de taches à 4 ° CO / N dans 300 ul de tampon de dilution d'anticorps (0,1% d'albumine de sérum bovin dans du DPBS) contenant des anticorps primaires dirigés contre CD34 (10 ng / ml), CD144 (1: 300) ou du vWF (1: 250) . Voir le tableau 1 pour plus de détails.
  8. Laver les anticorps primaires non liés pour 5 x 10 min avec du DPBS.
  9. Incuber les cellules pendant 1 heure à température ambiante avec l'anticorps secondaire marqué par fluorescence approprié, tel que détaillé dans le tableau 1 (tous à 1: 200).
  10. Laver anticorps secondaire non lié pour 5 x 10 min avec DPBS.
  11. Incuber les cellules avec 1 ug / ml de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans du DPBS pendant 10 minutes à température ambiante.
  12. Laver les cellules avec DPBS pour un autre 3 x 5 min.
  13. Cellules image au grossissement de 100x en utilisant un microscope inversé équipé d'une source de lumière externe pour l'excitation de fluorescence, et de capturer des images en utilisant un rattachementappareil photo numérique ED pour la suite déconnecté d'analyse.

8. gel et de dégel PBMNCs

  1. A l'issue de l'étape 3.2, après centrifugation, aspirer le milieu et manuellement perturber le culot cellulaire avec pipetage de haut en bas répété en utilisant une pointe de pipette P1000. Ajouter 1 ml de milieu de congélation, 90% de sérum et 10% de DMSO, en veillant à mélanger délicatement pour obtenir une suspension de cellules. Transférer la suspension cellulaire à un cryovial et gel et de dégel, comme décrit dans la section 5.

Résultats

Isolement des cellules leucocytaires manteau mononucléaires provenant de 60 ml de sang donne généralement 100-150x10 6 globules blancs totaux. Lorsque plaqué dans un seul flacon T-75, le grand nombre de cellules dans la suspension de cellules non lysé, il est difficile de résoudre les cellules adhérentes individuels en utilisant la microscopie en fond clair. Changements de milieu répétées entraînent la clairance des cellules non adhérentes et permettent la visualisation de la population monocytaire adhérent de "début" EPC. Au jour 7, le T-75 contiendra environ 7x10 6 de ces cellules adhérentes allongées. De 7 à 14 jours, des colonies de BOECs devraient apparaître dans le flacon (figure 2A). Colonies apparaissent d'abord comme de 3 à 5 cellules adjacentes. Nombre de colonies excroissance peut varier de 1 à 10 colonies par 60 ml de sang. Généralement, les donateurs les plus jeunes (c.-à-vieille 20-25 ans) ont tendance à produire un plus grand nombre de colonies excroissance, qui apparaissent également plus tôt dans la culture.BOECs prolifèrent central de ce groupe de cellules à former des colonies circulaires constitués de plusieurs centaines de cellules. Les cellules dans ces colonies présentent une morphologie classique pavé endothéliale.

Il est préférable de passage colonies initiales quand ils contiennent environ 1000 cellules par colonie. Colonies excroissance typiquement atteindre cette taille 7 jours après leur aspect d'origine dans la culture. Une fois que les colonies sont soumises à des passages d'origine dans un nouveau flacon T-75, il convient de proliférer pour former une monocouche confluente (3-5x10 6 cellules par flacon) dans les 5 jours ou moins (Figure 2B). Dans un petit pourcentage des isolements (<10%), les colonies excroissance ne parviennent pas à apparaître, ou ne prolifèrent pas suffisamment après cette étape de repiquage initial. BOECs qui présentent une faible prolifération après leur première passages vont rarement à devenir isolements BOEC stables et souvent arrêter la prolifération dans les deux à trois passages. Le monocytiquedébut EPC contenus dans les cultures BOEC sont non-prolifération et sont généralement éliminées des cultures au sein de 1-2 passages. Dégagement de ces cellules au début est due à la mort cellulaire, l'échec des premières cellules de ré-adhérer après repiquage et la dilution des premiers EPC non-prolifération avec des passages répétés.

Passage cellules 1 peuvent être soit des passages en outre en culture ou congelées pour une utilisation ultérieure. Une fois une isolation stable est généré, les cellules peuvent être soumises à des passages à une vitesse de 1 confluentes ballon jusqu'à 3-5 nouveaux flacons T-75 jusqu'au passage 8 ou 9, avant de devenir repos. Encore une fois, la densité cellulaire est essentiel dans toute culture. Dans notre expérience, pas moins de 750 000 cellules devraient être étalées dans un flacon T-75, que les densités cellulaires plus faibles peuvent provoquer un arrêt de la croissance. Malgré le fort potentiel de prolifération de BOECs, les cellules devraient également pas être autorisés à devenir overconfluent (ie.,> 5x10 6 cellules par flacon), car cela peut causer des convers ion de BOECs à un phénotype non proliférative.

Nous proposons que toute cellule étant étiqueté comme un BOEC devrait afficher surface cellulaire appropriée et coloration intracellulaire de marqueurs endothéliaux. Caractérisation des BOECs peut être réalisée par cytométrie de flux (Figure 3) ou la microscopie à fluorescence (Figure 4), après coloration pour des marqueurs de cellules endotheliales typiques. BOECs sont positifs pour les marqueurs de surface CD31 endothéliale et VEGFR2 et sont négatifs pour le marqueur CD14 de monocytes et de la pan-leucocytaire marqueur CD45. BOECs possédons aussi des corps de Weibel-Palade et ainsi exprimer facteur Von Willebrand (FvW) que discrète, ponctuée coloration cytoplasmique. Contrairement à d'autres types de cellules endothéliales matures, tels que l'artère pulmonaire ou cellules endotheliales aortiques, BOECs progénitrices expriment également le marqueur CD34 activation et sur leur surface.

ftp_upload / 53384 / 53384fig1.jpg "/>
Figure 1. Représentation schématique du protocole BOEC génération. Des cellules mononucléaires du sang périphérique sont isolées à partir de sang veineux par centrifugation en gradient de densité et on les cultive sur des plaques revêtues de collagène dans un milieu de croissance de l'endothélium définis additionnés de FBS. BOEC colonies apparaissent dans les 7-14 jours de culture. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-1
Figure 2. images fond clair de cultures BOEC représentatifs. (A) colonies excroissance apparaissent dans les cultures entre les jours 7 et 14. colonies présentes comme des collections de cellules endothéliales-like, qui sont disposés dans une monocouche pavée et prolifèrent radialement à partir d'un point central. Entourant les colonies excroissance sont les mono adhérentecytic cellules qui constituent la grande majorité des cellules dans les cultures précoces. Ces cellules, précédemment décrites comme «précoce» des cellules progénitrices endothéliales, ont une morphologie de broche-like et expriment le marqueur CD14 monocytaire. (B) Après des passages, les BOECs hautement prolifératives prendre sur les cultures, que les cellules monocytes non-prolifération soit meurent ou ne parviennent pas à ré-attacher après repiquage. Barre d'échelle 250 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-2
Figure 3. Caractérisation de BOECs par cytométrie de flux. BOECs ont été trypsinisées et colorées avec des anticorps d'isotype de contrôle par fluorescence conjugués (pic rempli gris) ou des anticorps dirigés contre des marqueurs de surface spécifiques (ligne rouge). Marqueurs de surface pour la caractérisation cytométrieInclure les marqueurs hématopoïétiques CD45 et CD14, les marqueurs endothéliaux CD31 et VEGFR2 et l'progentior et marqueur d'activation endothéliale CD34. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-3
Figure 4. La coloration par immunofluorescence de BOECs pour les marqueurs des cellules endothéliales. Des images d'immunofluorescence représentatifs de BOECs immunocolorée avec des anticorps dirigés contre le marqueur de surface des cellules endothéliales CD144 (VE-cadhérine, en haut à droite) et la glycoprotéine de sang facteur de von Willebrand (FvW, panneau en bas à droite) . Panneaux correspondants montrant la coloration DAPI nucléaire sont indiqués à gauche. Barre d'échelle 50 microns. pour CD144. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grandeversion de ce chiffre.

Discussion

Nous présentons un protocole détaillé qui permet de dériver de manière robuste et efficace des BOEC à partir de cellules mononucléées de sang périphérique adulte (PBMNC). Notre protocole comprend deux améliorations importantes qui représentent des avancées par rapport aux méthodes précédentes d’isolement des BOEC. 14-16 Il s’agit notamment de l’absence d’héparine dans le milieu de culture initial de PBMNC et de l’utilisation d’un sérum défini et qualifié pour les cellules souches embryonnaires. Ce dernier raffinement revêt une importance particulière. Le sérum qualifié pour les cellules souches embryonnaires (CSE) est un grade sérique plus constant et, bien que l’on ne sache pas encore quel(s) composant(s) est (sont) enrichi(s) dans le sérum qui bénéficie de l’isolation du BOEC, l’impact de ce sérum défini sur l’efficacité de la génération de BOEC est clair entre nos mains. De plus, nous avons également réussi à isoler les BOEC à l’aide de sérum humain, permettant ainsi la génération de BOEC pour la traduction clinique. Entre nos mains, ce protocole perfectionné permet d’isoler avec succès des cultures de BOEC stables de plus de 90 % des donneurs, ce qui en fait l’une des méthodes de génération de BOEC les plus fiables signalées à ce jour. Bien que l’utilisation de sérums particuliers soit essentielle à la production de BOEC, elle représente également une limitation primaire du protocole actuel. Les améliorations futures de la technique pourraient inclure la génération de ces cellules dans des conditions de culture définies et sans sérum.

Les étapes critiques du protocole comprennent le traitement des échantillons de sang le plus tôt possible après le prélèvement, la récolte complète des cellules de la couche leucocytaire après la centrifugation par gradient de densité et le passage en temps opportun des colonies initiales de P0 à P1. Cette étape de passage est essentielle à l’établissement d’un isolement stable. Comme d’autres cellules endothéliales, les BOEC semblent être très sensibles à la densité de placage. Si la densité de placage après passage est trop faible, les BOEC ne proliféreront pas. À l’inverse, si l’on laisse les colonies devenir trop confluentes avant de passer, les cellules cesseront également de proliférer et auront tendance à se convertir en un phénotype cellulaire mésenchymateux allongé. Si peu de colonies apparaissent entre le 7e et le 14e jour, ou si les colonies sont de petite taille, le dépannage peut inclure l’augmentation de la densité cellulaire en passant les colonies P0 dans un flacon T-25 au lieu d’un T-75.

Une fois la technique maîtrisée, les BOEC résultants peuvent être utilisés dans plusieurs applications, notamment les études in vitro de la biologie des cellules endothéliales, la modélisation de maladies et le criblage de médicaments, ainsi que les thérapies de transplantation cellulaire in vivo . Une considération importante pour le développement de tout processus de thérapie cellulaire est d’utiliser des cellules exemptes de mutations pathogènes. Nous avons précédemment montré que les BOEC isolés à l’aide de notre protocole possèdent des génomes exempts de variations du nombre de copies et sont donc représentatifs de l’individu sur lequel ils ont été collectés. De plus, nous avons également démontré que la majorité des lignées iPSC dérivées de BOEC sont exemptes de variations du nombre de copies. 13 Cela contraste avec les rapports précédents sur la variation du nombre de copies dans les iPSC dérivées de fibroblastes. À ce jour, ces cellules restent les seules iPSC pour lesquelles ce degré de fidélité génomique a été rapporté. Cette caractéristique est importante pour le domaine de la biologie des iPSC et l’utilisation des iPSC dans la modélisation des maladies, le criblage de médicaments et les futures thérapies de transplantation cellulaire.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions financées par la British Heart Foundation (BHF), le Dinosaur Trust, la McAlpine Foundation, la Fondation Leducq, Fight for Sight, le Cambridge Biomedical Research Centre, le National Institute of Health Research, y compris (i) le BHF Oxbridge Centre of Regenerative Medicine [RM/13/3/30159], (ii) le BHF Cambridge Centre of Research Excellence, (iii) Addenbrooke’s Hospital, Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust et (iv) Papworth Hospital NHS Foundation Trust, et a soutenu le Cambridge NIHR BRC Cell Phenotyping Hub. MLO est financé par une bourse intermédiaire BHF. FNK est financé par une bourse de doctorat BHF.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Pour le prélèvement sanguin
Seringue de 60 ml avec embout luer-lokBD309653
19G Surflo Winged Infusion SetTerumoSV-19BL
50 ml Tube à centrifuger coniqueStarLabE14502 par donneur
Citrate de sodiumMartindale Pharmaceuticals270541
NameCompanyNuméro de catalogueComments
Pour l’isolation du pelage leucocytaire
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-03
Dulbecco' s PBS (sans Ca2+ et Mg2+)Sigma-AldrichD8537
Pipettes de transfert en plastique enveloppéesstériles Appleton WoodsKC231
Turk' s SolutionMillipore1.093E+09
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
Pour la culture cellulaire, le passage et la congélation des cellules
Collagène de type 1 (dérivé de la queue de rat)BD Biosciences35-4236
Dulbecco' s PBS (sans Ca2+ et Mg2+)Sigma-AldrichD8537
0,02M Acide acétique  ;Sigma-AldrichA6283préparé dans de l’eau de qualité réactif
Milieu de croissance endothéliale-2MV
(contenant le kit Bullet, mais pas le sérum)		LonzaCC-3202Remarque : Il est essentiel que le milieu ne contienne pas d’héparine.   ;
Ne pas utiliser EGM-2.
Sérum fœtal de bovin (États-Unis), DefinedHycloneSH30070
10x Trypsine EDTAGibcoT4174Diluer à 1x dans PBS avant utilisation
Heat Inactivated FBSGibco10500-064
DMEMGibco41965-039
DMSOSigma-Aldrich276855
Nalgene Mr. Frosty Conteneurde congélationSigma-AldrichC1562
NameCompanyNuméro de catalogueComments
Pour la caractérisation par cytométrie en flux
FITC-conjugual mouse anti-human CD14BDBiosciences 555397Souris IgG1k, Clone : WM59
Dilution : 1:20
Souris conjuguée FITC anti-humaine CD31BD Biosciences555445Souris IgG1k, Clone : WM59
Dilution : 1:20
Souris conjuguée APC anti-humaine CD34BD Biosciences555824Souris IgG1k, Clone : 581/CD34
Dilution : 1:20
Souris conjuguée FITC anti-humaine CD45BD Biosciences560976Souris IgG1k, Clone : HI30
Dilution : 1:20
  ; souris conjuguée APC anti-humaine VEGFR2R& D SystemsFAB357ASouris IgG1, Clone : 89106
Dilution : 1:10
IgG1k Contrôle d’isotypeBiosciences555748Clone : MOPC-21
Dilution : 1:20
IgG1k Contrôle d’isotypeBD Biosciences555751Clone : MOPC-21
Dilution : 1:20
IgG1k contrôle d’isotypeR& D SystemsIC002A
Dilution : 1:10		Clone : 11711
EDTA, solution 0,5MSigma-AldrichE7889
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
>Pour la microscopie immunofluorescente  ;
Corning Costar Plaque de culture tissulaire à 24 puitsSigma-AldrichCLS3527
ParaformaldéhydeSigma-Aldrich158127
BSASigma-AldrichA7906
Polysorbate 20Sigma-AldrichP2287
Souris monoclonale anticorps CD34 anti-humainR& D SystemsMAB72271Clone 756510, IgG1, utilisation à 10 &mu ; g/ml
Polyclonal de chèvre anti-cadhérine VE-humaine (CD144)R& D SystemsAF938IgG purifiées par affinité d’antigène, utilisation à 1:300
Facteur de Von Willebrand monoclonal de lapin (vWF)Abcamab154193Clone EPSISR15, utilisation à 1:250
Anticorps secondaire anti-souris IgG (H+L) Donkey, conjugué Alexa Fluor 488TechnologiesA-21202Polyclonal, 2 mg/ml, utilisation à 1:200
Anticorps secondaire IgG anti-chèvre Donkey, conjuguéAlexa Fluor 488Life TechnologiesA-11055Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200
Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) Donkey, conjugué Alexa Fluor 568TechnologiesA-10042Polyclonal,  ; 2 mg/ml, 1:200
DAPI (4&prime ;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)Sigma-AldrichD9542à 1 &mu ; g/ml
BD Life Life

Références

  1. Yancopoulos, G. D., Klagsbrun, M., Folkman, J. Vasculogenesis, angiogenesis, and growth factors: ephrins enter the fray at the border. Cell. 93, 661-664 (1998).
  2. Flamme, I., Frölich, T., Risau, W. Molecular mechanisms of vasculogenesis and embryonic angiogenesis. J Cell Physiol. 173, 206-210 (1997).
  3. Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
  4. Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92, 362-367 (1998).
  5. Ormiston, M. L., Deng, Y., Stewart, D. J., Courtman, D. W. Innate immunity in the therapeutic actions of endothelial progenitor cells in pulmonary hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 546-554 (2010).
  6. Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 288-293 (2004).
  7. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).
  8. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
  9. Toshner, M., et al. Transcript analysis reveals a specific HOX signature associated with positional identity of human endothelial cells. PLOS ONE. 9, e91334(2014).
  10. Toshner, M., et al. Evidence of dysfunction of endothelial progenitors in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 180, 780-787 (2009).
  11. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121, 2762-2772 (2013).
  12. O'Neill, C. L., et al. Therapeutic revascularisation of ischaemic tissue: the opportunities and challenges for therapy using vascular stem/progenitor cells. Stem Cell Res & Ther. 3, 31(2012).
  13. Geti, I., et al. A Practical and Efficient Cellular Substrate for the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Adults: Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells. Stem Cells TM. 1, 855-865 (2012).
  14. Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and functional characterization of endothelial colony forming cells derived from human umbilical cord blood. Journal of Vis Exp: JoVE. , (2012).
  15. Martin-Ramirez, J., Hofman, M., van den Biggelaar, M., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nat Prot. 7, 1709-1715 (2012).
  16. Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and large scale expansion of adult human endothelial colony forming progenitor cells. Journal of Vis Exp: JoVE. , (2009).

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Isolement du sang périphériqueCentrifugation sur gradient de densitéRevêtement au collagèneMilieu de génération de BOECProtocole de culture cellulaireMarqueurs des cellules endothélialesImmunofluorescence CD144Marquage du facteur von WillebrandMéthode de cryopréservation
Génération et de la Culture du sang excroissance des cellules endothéliales de sang périphérique humain
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.