Isolement et compositionnelle Analyse des plantes cuticules lipidiques polyester monomères

Summary

Les polyesters lipidiques constituent les composants structurels de deux modifications de la paroi cellulaire, la cuticule végétale et les barrières de diffusion contenant de la subérine. Dans cette vidéo, nous décrivons une méthode pour dépolymériser la cutine à partir de feuilles entières délipidées. La méthode peut être appliquée à l’étude de mutants compromis dans la biosynthèse de la cutine ou de la subérine.

Abstract

Les plantes terrestres produisent des biopolyesters aliphatiques extracellulaires qui modifient les parois cellulaires de tissus spécifiques. Les cellules épidermiques synthétisent la cutine, un polyester de glycérol et d’acides gras modifiés qui constitue la trame de la cuticule qui recouvre les surfaces aériennes des plantes. La subérine est un polyester lipidique apparenté qui se dépose sur les parois cellulaires de certains tissus, y compris l’endoderme racinaire et le périderme des tubercules, de l’écorce des arbres et des racines. Ces polymères lipidiques ont une composition très variable d’une espèce végétale à l’autre et diffèrent souvent d’un tissu à l’autre au sein d’une même espèce. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour étudier la composition monomère de la cutine dans les feuilles d’Arabidopsis thaliana par dépolymérisation catalysée par le méthoxyde de sodium (NaOMe), la dérivatisation et l’analyse ultérieure par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse (GC/MS). Cette méthode peut être utilisée pour étudier les monomères de polyesters insolubles isolés de tissus végétaux délipidés entiers portant soit de la cutine, soit de la subérine. La méthode peut être appliquée non seulement pour caractériser la composition des polymères lipidiques chez des espèces non analysées auparavant, mais aussi comme outil analytique dans les approches génétiques directes et inverses pour évaluer la fonction des gènes candidats.

Introduction

Les plantes vasculaires reposent sur des couches extracellulaires qui fonctionnent comme des barrières étanches entre les tissus végétaux et l'environnement externe. Ces structures de parois cellulaires associées à une infection pathogène lipophile limitent et régulent le transport passif de gaz, l'eau et les substances dissoutes dans et hors des tissus végétaux ^1. Ces obstacles sont la cuticule de la plante, une structure unique de plantes synapomorphes ^2, et les différentes barrières de diffusion contenant subérine. La cuticule est une couche oléophile synthétisé par les cellules épidermiques et lié à eux par l'intermédiaire d'une couche de pectine sur le côté extracellulaire de la paroi cellulaire ^5.3. Il enveloppe les organes aériens primaires de plantes supérieures, fonctionnant comme une interface vitale entre les tissus végétaux et l'environnement.

Cutin, la matrice de structure de la cuticule, et subérine sont deux polyesters glycérolipides insolubles associés avec des cires solvant extractibles ^2,4. Ces l polymèreipids sont constitués de dérivés saturés et insaturés et d'acides gras sont à la fois structurellement et fonctionnellement similaire. Toutefois, elles se distinguent par des différences dans les caractéristiques de composition et de dépôt des sites chimiques.

Subérine est un polyester aliphatique situé à l'intérieur des parois cellulaires de certains tissus externes et internes formant une paroi secondaire. Tissus subérisées comprennent péridermes de racines, de tubercules et de l'écorce d'arbre, endoderme profondes, couches de revêtement de semences, et les plaies guéries ^2. Contrairement à la cutine, la subérine de polyester contient typiquement des alcools, des acides dicarboxyliques saturés et mono-insaturés, et une grande proportion de monomères à très longue chaîne (C≥20).

Cutin polyester lipidique est le plus abondant dans les plantes vasculaires ^6, et est composé de glycérol et en C16-C18 dérivés d'acides gras interestérifié, tels que les acides gras hydroxy et ^hydroxy-4 époxy substitué. Bien que la composition de polymères cutinevarie selon les espèces de tracheophyte, les monomères principaux sont plus prédominants 10, 16-dihydroxy 16: 0, 18-hydroxy-9,10-époxy 18: 0, et 9,10,18-trihydroxy 18: 0 des acides gras. Fait intéressant, la feuille et la tige Arabidopsis cutine est composé principalement de 18: 2 acide dicarboxylique ^7,8.

Cuticules végétales présentent aussi une grande variabilité dans l'épaisseur, allant de quelques nanomètres à plusieurs micromètres ^9. Depuis l'isolement de la cuticule est une étape laborieuse et prend du temps, en particulier pour les très minces cuticules des feuilles tels que ceux d'Arabidopsis thaliana ^8, méthodes qui contournent l'isolement de la cuticule ont été développés et validés ^7,8. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour étudier la composition de monomères de cutine dans des feuilles d'Arabidopsis thaliana par le méthoxyde de sodium (NaOMe) et dépolymérisation catalysée par chromatographie en phase gazeuse subséquente / spectrométrie de masse (CG / SM) d'analyse. Ce protocole offre une méthode robuste pour le dosage de la composition de polyesters de lipides dans les tissus de la plante délipidés entiers, et a été adapté à partir de protocoles précédemment rapportés ^7,10,11. Des échantillons de tissus entiers sont d'abord homogénéisé et exhaustive délipidé, enlever les lipides solvant extractible y compris la cuticule et les cires épicuticulaires, lipides membranaires, et triglycérides. Des résidus de parois cellulaires sont enrichis ensuite dépolymérisés en leurs monomères constitutifs ester méthylique par du méthylate de sodium méthanolyse catalysée. Gras esters méthyliques d'acide sont extraites lors de l'acidification et dérivés pour obtenir leurs dérivés triméthylsilyle ou acétyle correspondantes. Résidus dérivés sont très volatiles et peuvent être éluées d'une colonne de chromatographie en phase gazeuse à une température raisonnable sans modification de leur conformation structurelle lors de l'analyse GC / MS.

Protocol

Remarque: Ce protocole a été adapté à partir de Bonaventure et al. (2004), Molina et al. (2006), Li et al. (2013) ^7,10,11. Les étapes 1-5 sont résumés dans la figure 1.

1. délipidation tissulaire

Remarque: Toujours rincer la verrerie et les bouchons avec du chloroforme, laissant à sec sous une hotte, avant de l'utiliser.

ATTENTION: Effectuer homogénéisation des tissus et toutes les étapes de transfert de solvant sous une hotte; toujours porter blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de sécurité anti-éclaboussures pour éviter le contact direct avec des produits chimiques et de protéger les échantillons de la contamination.

1. Préchauffer le bain d'eau et le bloc thermique à 85 ° C.
2. Peser environ 0,5 g de chaque échantillon de feuille en mm x 125 tubes à essai en verre de 20 mm avec pré-pesé polytétrafluoroéthylène (PTFE) -faced bouchons à vis. Inclure quatre répétitions par échantillon.
3. Placez 2-propanol dans un Erlenmeyer (environ 125 ml; 25 ml par g de sample). Ajouter 2,6-di-tert-butyl-4-méthylphénol (également connu comme l'hydroxytoluène butylé, le BHT) à une concentration finale de 0,01% (p / v).
   Remarque: Ajouter BHT à partir d'un 5% (p / v) solution stock dans le méthanol (BHT aide minimiser l'oxydation des acides gras insaturés).
4. Préchauffer la solution de 2-propanol à 85 ° C dans un bain d'eau.
5. Ajouter 12 ml chaude solvant 2-propanol à chaque tube de l'échantillon et de la chaleur pendant 15 min à 85 ° C dans le bloc thermique. Cette étape inactive lipases qui peuvent être émises à partir de cellules rompues.
6. Laissez tubes de refroidir à la température ambiante et broient les tissus soigneusement avec homogénéisateur jusqu'à obtenir une suspension homogène.
7. Placer les échantillons dans un agitateur orbital et agiter pendant 1-2 heures à 100 tours par minute et la température ambiante.
8. Centrifuger pendant 10 min à 800 xg et éliminer le surnageant.
9. Ajouter un volume égal de 2-propanol et agiter pendant 12 heures à température ambiante.
10. Centrifuger pendant 10 min à 800 xg et éliminer le surnageant.
11. Ajouter 12 ml CHCl _3: CH ₃ OH (2: 1, v / v) au résidu (25 ml par g de l'échantillon) et agiter une nuit à 100 tours par minute et la température ambiante.
12. Centrifuger pendant 10 min à 800 xg et éliminer le surnageant.
13. Ajouter 12 ml CHCl _3: CH ₃ OH (1: 2, v / v) au résidu et agiter une nuit à 100 tours par minute et la température ambiante.
14. Centrifuger pendant 10 min à 800 xg et éliminer le solvant.
15. Laissez sécher les échantillons sous une hotte pendant une nuit à température ambiante.
16. Air-sécher le résidu, puis placer dans un dessiccateur à vide sur _CaCl2 anhydre ou CaSO _{4 jusqu'à} poids constant (3-5 jours).

2. dépolymérisation: méthanolyse avec le méthylate de sodium (Figure 2)

ATTENTION: Effectuer les étapes 2.3 à 2.4, 2.7 à 2.8, 2.10 à 2.11, 2.13 à 2.15 et 2.17 à 2.18 sous une hotte; toujours porter blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection contre les éclaboussures.

1. Préchauffer le bloc de chauffage à 60 ° C.
2. Peser tubes à essai contenant le résidu sec (important pour d'autres calculs).
3. Ajouter normes internes à chaque tube: 25 ωL heptadécanoate de méthyle (1 mg / ml d'achat d'actions) et 25 ul ω-pentadécalactone (1 mg / ml d'achat d'actions).
4. Ajouter 0,9 ml d'acétate de méthyle, 1,5 ml de méthylate de sodium et 3,6 ml de methanol à chaque tube et les coiffer. En variante, préparer un mélange de réaction de ces trois réactifs et ajouter des aliquotes de 6 ml de chaque échantillon.
5. Des échantillons de la chaleur pendant 2 heures à 60 ° C et vortex périodiquement dans des intervalles de 15 min.
6. Laissez refroidir les échantillons à la température ambiante.
7. Ajouter 10 ml de dichlorure de méthylène (CH _{2 Cl} 2) et 1,5 ml d'acide acétique glacial pour extraire les esters méthyliques d'acides gras.
8. Ajouter une solution saline (NaCl 0,5 M) pour remplir chaque tube et bouchon.
9. Échantillons Vortex pendant 1 min et centrifuger pendant 10 min à 800 x g.
10. Transférer la phase organique (inférieure) pour nettoyer les tubes de taille moyenne (16 x 125 tubes à essai en verre mm avec polytétrafluoroéthylène (PTFE) de bouchon à vis -faced).
11. Ajouter une solution saline (NaCl 0,5 M) pour remplir chaque tube et bouchon.
12. Échantillons Vortex pendant 1 min et centrifuger pendant 10 min à 800 x g.
13. Retirer phase aqueuse (supérieure) et répétez les étapes 02.11 à 02.12.
14. Retirez tout phase aqueuse (supérieure).
15. Ajouter sulfate de sodium anhydre (Na _{2 SO} 4) pour le solvant, coiffer les tubes et les vortex pendant 1 min; échantillons peuvent maintenant être laissés jusqu'au lendemain. À ce point les échantillons peuvent être laissés toute la nuit sous la hotte.
16. Centrifuger pendant 2 min à 800 x g pour compacter le Na _{2 SO 4} dans le fond de sel.
17. Transférer la phase organique dans un tube jetable petit verre (13 x 100 mm des tubes à essai en verre avec de polytétrafluoroéthylène (PTFE) de bouchon à vis -faced).
18. Evaporer le solvant à siccité sous azote et passer à l'étape de dérivatisation. Si pas traités immédiatement, magasin évaporé échantillons à -20 ° C (échantillons peuvent être unlso stocké avant l'étape d'évaporation).

3. Préparation de dérivés pour chromatographie en phase gazeuse

ATTENTION: Effectuer les étapes 3.1.2 et 3.1.5 - 3.1.8 sous une hotte; toujours porter blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection contre les éclaboussures.

1. Dérivés triméthylsilyle
   1. Préchauffer le bloc de la chaleur à 100 ° C.
   2. Ajouter 100 ul de pyridine et 100 ul de BSTFA (N, O bis-triméthylsilyl-trifluoroacétamide) à chaque tube et les coiffer.
   3. Des échantillons de chaleur à 100 ° C pendant 10 min.
   4. Laissez refroidir les échantillons à la température ambiante.
   5. Évaporer échantillons sous azote à la température ambiante. Éviter l'application de chaleur à des échantillons, les monomères sont très volatiles à ce stade.
   6. Ajouter 500 ul de 1: 1 (v / v) d'heptane: toluène.
   7. Échantillons Vortex pendant 1 min et centrifuger 2 min à 800 x g.
   8. Ajouter échantillons dans des flacons de GC et de procéder à l'analyse GC / MS.
2. Acétyldérivés
   Remarque: Pour acétylation, modifier étapes 3.1.1-3.1.3 ci-dessus comme suit (non représenté sur la vidéo); 3.1.4-3.1.8 étapes sont les mêmes:
   1. Préchauffer le bloc de chauffage à 60 ° C.
   2. Ajouter 100 ul de pyridine et 100 ul d'anhydride acétique (Ac ₂ O) vers les tubes.
   3. Échantillons de chaleur de 1 heure à 60 ° C.

4. GC / MS Analysis

1. Utilisez une colonne (30 mx 0,25 mm x 0,25 um d'épaisseur de film) ou équivalent (ie., 5% diphényle, 95% diméthylpolysiloxane) HP-5 capillaire. Programme GC avec le flux de gaz porteur d'hélium fixé à 1,5 ml / min et la température du four programmée de 150 à 300 ° C à 3 ° C / min.
2. Utilisez injection split (rapport de division de 1:10) et définir spectromètre de masse en mode numériser sur 40-600 uma (ionisation par impact électronique).
3. Créer une table de séquence y compris des solvants (vierge), WT et répétitions mutantes, chacun utilisant la méthode d'analyse cutine indiqué.
4. Solvant de chargeet flacons d'échantillon sur le carrousel, ajoutent hexane dans des flacons de seringues-rinçage dans l'échantillonneur automatique si nécessaire, et de commencer la séquence. Après la séquence est terminée, le total des traces de chromatogramme d'ions sont disponibles pour tous les échantillons.

Analyse des données 5.

1. Identifier les monomères de polyester lipidique en comparant le spectre de masse de chaque pic de spectres de masse publié ou en recherchant une bibliothèque commerciale si disponible.
2. Pour chaque pic identifié dans le chromatogramme ionique total actuel, utiliser leurs temps de rétention respectifs de trouver les zones sur le tableau des résultats d'intégration à partir du logiciel GC / MS (Figure 1 supplémentaire).
3. Pour chaque monomère (colonnes AB), ajoutez les valeurs de la zone trouvés dans le tableau de l'intégration (figure supplémentaire 1, colonne D) à la colonne correspondante pour chaque répliquer échantillon dans le tableau Excel de monomères (Fichier supplémentaire 2, colonnes FC), qui est une feuille de calcul pour quantifier Arabidopsisdérivés cutine TMSi. Utilisez la commande Fichier supplémentaire 3 si dérivés acétylés sont préparés à la place.
4. Ajouter les domaines des normes internes (IS) à colonnes est (HK). Pour les monomères qui ne sont pas transformés en dérivés, les esters méthyliques savoir d'acides gras (EMAG), et esters de diméthyle d'acide dicarboxyliques (DCA PDEM), utiliser 17: 0 FAME (IS1) comme il est, pour la quantification (cellules violettes-ombragée dans le tableau de monomère; supplémentaire Fichiers 2/3). Pour les monomères hydroxylés, y compris les alcools primaires, l'acide férulique et des acides ω-hydroxy, utiliser 15: 0 FAME 15-hydroxy (IS2), tout comme de choix pour la quantification de composés (cellules vertes-parties ombragées dans le tableau de monomère; fichiers supplémentaires 2/3) .
5. Ajouter du poids à sec de la feuille pour chaque répliquer aux colonnes AX-BA (Fichier supplémentaire 2) ou AQ-AT (Fichier supplémentaire 3); alternativement, balayer les feuilles pour calculer les zones de surface et ajouter des valeurs de la zone à la table de monomère pour exprimer des charges par unité de monomèressurface.

Results

Le protocole décrit dans ce manuscrit est mis en place pour déterminer lipides monomères de polyester, de minimiser les apports de lipides non-cutine ¹⁰ la figure 1 présente un aperçu de l'analyse, qui prend au total entre 8 (c.-à-cutine ou subérine.) -. 10 jours (à partir de prélèvement de tissu initial pour obtenir des données de GC), en fonction du temps des échantillons sont mis à sécher.

La méthanolyse catalysée par une base choisie (figure 2) Procédé pour dépolymériser des polyesters a été préalablement validé pour les graines d'Arabidopsis, qui contiennent à la fois la cutine et subérine. Les tissus sont d'abord homogénéisés et exhaustive délipidées à éliminer les lipides solvant-extractibles. Le rendement de résidu après extraction, en pourcentage du poids frais initial, est habituellement de 6% pour A. thaliana Col-0 feuilles. Des résidus de parois cellulaires enrichies sont séchés dans un dessiccateur sous vide et ensuite dépolymérisés en leurs monomères d'ester méthylique constitutifs parcatalysée par une base transmethylation. Incubation de deux heures a été choisi comme le temps critique nécessaire pour la dépolymérisation et la récupération des composants de polyester lipidiques appropriée. De plus longs temps d'incubation conduit à augmentation des acides 2-hydroxy; ceux-ci proviennent de sphingolipides potentiellement à membrane ^10.

Un chromatogramme typique si Arabidopsis de type sauvage feuilles cutine est montré dans la figure 3, pour les dérivés O -TMSi éther (figure 3A) et dérivés de O-acétyl (figure 3B). Chaque pic a été identifié par comparaison de spectres de masse à partir de la littérature ^7,8 et une base de données publique ¹² .Our protocole vidéo montre comment préparer des dérivés TMSI, mais peut en variante être des échantillons acétylé pour dériver des groupes hydroxyle. Dérivés silylés sont bonnes pour des fins d'identification parce qu'ils donnent des spectres de masse de diagnostic. Cependant, les dérivés acétylés sont plus stables et une bonne alternative à Silylationmonomères fois ont été identifiés ^10. Pour aider à mettre en œuvre ce protocole dans les laboratoires qui ont seulement GC couplé à ionisation de flamme détecteur (FID), GC / FID traces correspondant à des dérivés acétylés de WT monomères feuille de cutine et à une série homologue des normes d'esters méthyliques gras d'acide sont également représentées (figure supplémentaire 4).

Cette méthode est qualitative et détecte des différences quantitatives entre les échantillons, d'où sa valeur pour l'analyse mutant. Les quantités de monomères individuels sont déterminées en utilisant la méthode standard interne de quantification, permettant des comparaisons d'abondance de monomère entre les échantillons. Il convient de préciser, cependant, que la taille maximale (compteurs d'ions totaux) peut ne pas refléter les rapports molaires des monomères dans le polyester. Nous incluons des tableaux modifiables de monomères pour calculer les montants de monomères dans Arabidopsis feuille cutine que les esters d'acides gras de méthyle et les dérivés TMSi (Fichier supplémentaire 1), ou ACE dérivés tyl (Fichier supplémentaire 2) d'alcools. Peuvent avoir besoin d'être adapté si les échantillons sont extraites de différents organes ou d'espèces végétales Ces tableaux.

A titre d'exemple, nous avons analysé Arabidopsis Thalia na-Britannique (Col-0) de feuilles de type sauvage et deux allèles nuls mutant précédemment caractérisés du gène CYP86A2 / ATT1, att1-1 (m-1) et att1-2 (m-2 ) ^13,14. Monooxygénases cytochrome P450 de la sous-famille de CYP86A codent oméga-oxydases putatifs et participent à la subérine et cutine biosynthèse de monomère. Les résultats (figure 4) montrent des réductions significatives de la charge de monomères trois principaux lipides dans les feuilles de mutants par rapport aux feuilles WT. En accord avec la fonction de l'enzyme prédite, 16: 0, 18: 2 et 18: 1 dicarboxylates ont été spécifiquement affectés à des mutants de att1.

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Figure 1. Aperçu de l'analyse de polyester lipidique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Mécanisme de la réaction de transméthylation NaOMe catalysée. Les anions méthoxyde nucléophile attaque le carbone cabonyl de polyesters de lipides pour former un instable intermédiaire tétraédrique (A), qui se dissocie facilement en esters méthyliques d'acides gras et les anions alcoolates (B). Ces alcoxydes sont des bases conjuguées, et de réagir avec le methanol, la régénération des anions méthoxyde catalytiquement actifs, soutenant ainsi les réactions de dépolymérisation supplémentaire (C). Si de l'eau est présent dans lesystème, il va réagir avec du méthylate de sodium pour former de l'hydroxyde de sodium, une base forte qui hydrolyse de manière irréversible pour produire des esters d'acides gras libres indésirables. L'acétate de méthyle est ajouté comme co-solvant ¹⁵ pour éliminer les petites quantités d'hydroxyde de sodium dans le système (D). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Représentant de chromatogramme ionique total de type sauvage monomères cutine Arabidopsis thaliana de feuilles. (A) O -trimethylsilyl (TMSi) éther et (B) des dérivés hydroxyles acétate. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Composition de monomère Cutin d'Arabidopsis thaliana WT et deux alleles mutants nuls du gène CYP86A2. (Mutant att1-1-1 =; = 2-mutant att1-2) barres d'erreur représentent l'écart type de la moyenne (n = 4) . Adapté ^à partir du 13, avec la permission de © Blackwell Publishing (2007). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure supplémentaire 1. Pic résultats d'intégration table à partir du logiciel GC / MS. Pics correspondant aux monomères identifiés et des normes internes sont identifiés par leur retenti sur le temps (colonne C) et les valeurs de la région sont indiquées dans la colonne D. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2. Table des Arabidopsis monomères cutine (dérivés d'éthers de triméthylsilyle de hydroxy esters méthyliques d'acides gras). S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau 3. Fichier supplémentaire de monomères Arabidopsis cutine (dérivés O-acétyl d'hydroxy esters méthyliques d'acide gras).com / files / ftp_upload / 53386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Supplement figure 4. GC / FID de traces (AB) ester gras méthylique de l'acide (FAME) des normes d'indice de rétention (pics sont marqués avec chaque FAME saturés de longueur de chaîne); et (C) acétyle A. thaliana WT feuilles monomères cutine. Numéros sur la visière correspondent à: 16: 0 FAME (1), férulate (2), 18: 3 FAME (3), 18: 1/18: 2 FAMEs (4), 18: 0 FAME (5), sinapate (6 ), 16: 0 DCA (7), 16-OH 16: 0 FAME (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DAC (10) 18: 0 DCA (11), 18-OH 18: 2 FAME (12), 18-OH 18: 1 FAME (13), 20: 0 FAME (14), 10,16 diOH-16: 0 FAME (15), 24: 0 FAME (16). DCA: ester diméthylique de l'acide dicarboxylique; FAME: ester méthylique d'acide gras; IS1: standard interne 1, 17: 0 FAME; IS2: st interneAndard 2, 15-OH 15: 0 FAME. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Contrairement à d'autres biopolymères tels que les protéines et l'ADN, des polyesters de lipides des plantes ne sont pas fabriquées à partir d'un modèle. Au lieu de cela, leurs compositions dépendent de la spécificité des enzymes présentes dans les tissus qui font de ces polymères extracellulaires. Comme de telles analyses, chimiques du constituant composants sont essentiels pour comprendre la composition de polyester lipidique.

Les méthodes chimiques pour couper des liaisons ester comprennent saponification, l'hydrogénolyse, transmethylation catalyse acide, et catalysée par une base transmethylation ^2. Chacun d'eux a ses avantages et ses inconvénients. Saponification produit des acides gras hydroxyles libres qui peuvent subir des réactions secondaires. L'hydrogénolyse avec de l'hydrure de lithium-aluminium (LiAlH ₄₎ ¹⁶ a été utilisé pour l'analyse de la cutine ^7. Hydrogénolyse réduit carbones fonctionnalisés d'alcools et les structures originales doivent être inférée par deuteriolysis de lithium-aluminium deutérure (LiAlD _4). Lainconvénient de cette approche est l'exigence de haute résolution GC / MS de comparer le degré de deuteriation des polyols gras obtenus à effectuer des affectations de leurs structures. Transestérification à catalyse acide avec méthanolique de trifluorure de bore _(BF3) a été fréquemment utilisé dans la cutine et subérine dépolymérisations ^8,17,18, mais le réactif a une durée de vie limitée et peut introduire des artefacts dus à des réactions secondaires ^15. L'acide sulfurique méthanolique donne aussi des esters méthyliques des monomères mais avec de plus grandes proportions d'acides gras 2-hydroxy, qui sont probablement pas de vrais composants de polyester de lipides, par rapport à ¹⁰ d'autres méthodes.

Le procédé de transestérification NaOMe catalysée décrit dans le présent protocole produit des esters méthyliques d'acides gras qui sont transformés en dérivés par silylation des groupes hydroxyle, en fournissant les spectres de masse caractéristique d'identification, ou par acétylation pour donner des dérivés plus stables de groupes hydroxyle for quantification. Un inconvénient de cette technique est que l'hydrolyse est en concurrence avec la transestérification en présence d'eau dans la réaction. L'eau réagit avec NaOMe (le catalyseur) et de NaOH produit, qui à son tour hydrolyse des esters gras méthyliques d'acide pour donner les acides libres (Figure 2D). Ceci est une réaction secondaire indésirable parce que deux pics sont présents pour chaque acide gras: un ester de méthyle et d'un dérivé d'ester TMSi, ce qui complique l'analyse. En utilisant des réactifs anhydres et en ajoutant de l'acétate de méthyle comme co-solvant de rivaliser avec saponification sont des étapes cruciales pour empêcher ainsi l'hydrolyse (figure 2D).

Cutine et subérine contiennent entre 1 et 26% de glycerol ^4. Toutefois, ce monomère ne sera pas détecté par les conditions expérimentales décrites dans ce protocole. Le glycérol est hautement hydrophile et, à la différence des monomères d'ester de méthyle d'acide gras, seront éliminées au cours des étapes solvant aqueux de lavage. Cette limitation a égalementpplies à d'autres méthodes de dépolymérisation cutine, mais glycerol peuvent être déterminées dans la couche aqueuse obtenue après la transestérification en utilisant une méthode enzymatique. En variante, il peut être quantifiée en utilisant des conditions plus douces (par exemple., 0,05 M de NaOMe) sans autre extraction à l'eau afin de détecter tous les monomères, y compris le glycérol ^19,20 .Bien utile à des fins de quantification glycérol, des conditions douces donnent généralement dépolymérisation incomplète de la cutine et subérine.

Si un GC couplée à un détecteur à ionisation de flamme (FID) est disponible, toutes les répétitions peuvent être analysés dans cet instrument à des fins quantitatives, après les pics d'un échantillon représentatif ont été identifiés par GC / MS. Alternativement, les monomères dans les GC / FID traces peuvent être identifiés si leurs indices de rétention sont connus. Le détecteur à ionisation de flamme a surtout une sensibilité élevée et une large gamme de proportionnalité, ce qui est essentiel pour la quantification des majeurs et mineurs composants de l'échantillondans les courses individuelles. En outre, il est robuste et facile à entretenir et exploiter ^15.

Le protocole décrit permet l'isolement fiable et reproductible, l'identification et la quantification des lipides des plantes monomères de polyester, ce qui permet la caractérisation chimique des mutants qui diffèrent par la composition d'un ou plusieurs monomères de polyester lipidiques. La procédure est évolutif, il peut être facilement adapté pour traiter à la fois les petites et les grosses quantités de diverses matières végétales, y compris les racines, graines, feuilles, tiges et fleurs. Données spectrales de masse de lipides polyester monomères de nombreuses espèces ont été publiés ^{par ex., 21-26} et constituent des ressources précieuses pour identifier les monomères inconnus lors de l'adaptation de ce protocole à d'autres tissus et / ou espèces. Cette méthode est applicable aux enquêtes de la biosynthèse, la réglementation, et la distribution de polyesters lipidiques chez les plantes supérieures.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Produits chimiques
2-propanol	Fisher Scientific	BPA451-4	Solvant pour la délipidation
Sulfate de sodium anhydre	Fisher Scientific	S421500
Anhydride acétique	Sigma Aldrich	320102	Agent de dérivation
BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide)	Sigma-Aldrich	15222	Agent de dérivation
Hydroxytoluène butylé (BHT)	Sigma-Aldrich	101162	Antioxydant
Chlorure de calcium anhydre	Fisher Scientific	C614-3	Agent de dessiccation
Suflate de calcium anhydre (DRIERITE- 8 MESH avec indicateur)	Acros Organics	219090020	Agent de dessiccation
Chloroforme (trichlorométhane)	Fisher Scientific	C6074	Solvant organique
Acide acétique glacial	Fisher Scientific	BP2401212	Agent d’acidification
Gaz vecteur d’hélium	Liquide	ALPHAGAZ1-UN1046	Gaz vecteur, GC/MS
Heptane	Fisher Scientific	H3501	Solvant organique
Hexanes	Fisher Scientific	H3024	Solvant organique
Méthanol	Fisher Scientific	A4124	Solvant organique, réactif à la transméthylation
Acétate de méthyle	Sigma-Aldrich	296996	Solvant organique
Heptadecanoate de méthyle	Sigma-Aldrich	H4515	Étalon interne (1mg/mL stock)
Dichlorure de méthylène (dichlorométhane)	Fisher Scientific	D374	Solvant organique
Azote, comprimé	Air Liquide	ALPHAGAZ1-UN1044	Gaz vecteur, GC-FID
Pentadécanolactone	Fluka	76530	Étalon interne (1 mg/ml de stock)
Pyridine	Sigma-Aldrich	270970	Co-solvant pour la dérivation
Chlorure de sodium	Fisher Scientific	BP358212	Solution saline
Méthoxyde de sodium (25 % en poids)	Sigma-Aldrich	156256	Nucléophile
Toluène	FIsher Scientific	T2904	Solvant organique
Fournitures
Pro-Mix PGX	Premier Tech Horticulture Ltd		Pro-Mix PGX est recommandé pour la culture des plantes d’Arabidopsis (Eddy, R. et Hahn, D.T., 2012,http ://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Purdue Methods for Arabidopsis Growth.  ;
Dôme d’humidité PermaNest  ;	Grower’s Solution, LLC, Cookeville, TN  ;	GD2211-24
Plateaux pour plantes Perma-Nest (22x11po)	Grower’s Solution, LLC, Cookeville, TN  ;	N/A
Pots de serre carrés, 3,5 pouces  ;	Grower’s Solution, LLC, Cookeville, TN  ;	P86
, Plant-Prod 20-20-20	Premier Tech Maison et jardin à, Brantford, ON	/A
Verrerie
Tube à essai en verre de 13 x 100 mm avec bouchon à vis à face en téflon	Kimble Chase Life Science and Research Products LLC	45066A-13100
Tube à essai en verre de 16 x 125 mm avec bouchon à vis à face en téflon	Kimble Chase Life Science and Research Products LLC	45066A-16125
Tubes à essai en verre de 20 x 125 mm avec bouchon à vis à face en téflon	Kimble Chase Life Science and Research Products LLC	45066A-20125
Bouchons de flacons GC	National Scientific	C400051A
Microinserts de flacons	Scientific	C4011631
flacons	GC National Scientific	C40001
Pipettes pasteur jetables	Fisher Scientific	1367820B
Flacons	Fisher Scientific
Equipment
Allegra X15R	centrifugeuse Beckman Coulter
Balance analytique	Fisher Scientific
Danseuse			orientaleUn shaker peut être utilisé à cet effet si Belly Dancer n’est pas disponible
DB-5 Colonne GC capillaire	J& W Scientific, CA, États-Unis ;   ;		30 m x 0,25 mm x 0,25 &mu ; m épaisseur du film
Dessiccateur
Isotemp 202 bain-marie	Fisher Scientific
ISQ LT spectromètre de masse à quadupôle unique Thermo	Scientific
Bloc thermique	Fisher Scientific
Évaporateur
Polytron homogénéisateur	Birkmann
Chromatographe en phase gazeuse Trace 1300	Thermo Scientific
Régulateur à deux étages	Air Liquide	Q1-318B-580
Dessiccateur sous vide	Fisher Scientific
Mélangeur vortex	Fisher Scientific