Article de méthode

Mesure Phagosome pH par Ratiométrique microscopie à fluorescence

DOI :

10.3791/53402

⸱

7 décembre 2015

 ,  , 
1Department of Cellular Physiology and Metabolism, University of Geneva

Dans cet article

Résumé

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Le pH phagosomal influence la maturation des phagosomes, la production d’oxydants, la destruction des phagosomes ainsi que la présentation de l’antigène. Nous décrivons ici une méthode ratiométrique pour mesurer les changements de pH dans le temps et les paramètres finaux dans les phagosomes individuels des phagocytes vivants à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Résumé

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La phagocytose est un processus fondamental par lequel les cellules immunitaires innées engloutissent les bactéries, les cellules apoptotiques ou d'autres particules étrangères dans le but de tuer ou neutraliser la matière ingérée, ou de le présenter comme antigènes et d'initier des réponses immunitaires adaptatives. Le pH de phagosomes est un paramètre critique régulation de fission ou fusion avec endomembranes et l'activation des enzymes protéolytiques, des événements qui permettent à la vacuole phagocytaire à mûrir dans une organelle dégradable. En outre, la translocation des ions H + est requis pour la production de niveaux élevés d'espèces oxygénées réactives (ROS), qui sont essentiels pour la destruction efficace et signalisation à d'autres tissus de l'hôte. De nombreux agents pathogènes intracellulaires subvertissent assassinat phagocytaire en limitant l'acidification du phagosome, soulignant l'importance du pH dans phagosome biologie. Nous décrivons ici une méthode pour mesurer phagosomale quotientométrique pH dans les neutrophiles en utilisant l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) marqué au zymosan que phagocytaire targETS, et imagerie des cellules vivantes. Le dosage est basé sur les propriétés de fluorescence du FITC, qui est refroidi par un pH acide lorsqu'il est excité à 490 nm mais non lorsqu'il est excité à 440 nm, ce qui permet la quantification d'un rapport dépendant du pH, au lieu de fluorescence absolue, d'un seul colorant. Un protocole détaillé pour réaliser in situ colorant étalonnage et la conversion de rapport aux valeurs réelles de pH est également fourni. Simple-dye méthodes ratiométriques sont généralement considérés comme supérieurs à longueur d'onde unique ou protocoles de pseudo-ratiométrique double teinture, car ils sont moins sensibles aux perturbations telles que le blanchiment, les changements de focus, les variations de laser, et l'étiquetage inégale, qui faussent le signal mesuré. Ce procédé peut être facilement modifié pour mesurer le pH dans d'autres types de cellules phagocytaires, et zymosan peut être remplacée par toute autre particule contenant une amine, à partir de billes inertes à des micro-organismes vivants. Enfin, ce procédé peut être adapté pour utiliser d'autres sondes fluorescentes sensibles à des gammes de pH ou d'autres phagosomactivités al, ce qui en fait un protocole généralisé pour l'imagerie fonctionnelle de phagosomes.

Introduction

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Phagocytose, le processus par lequel les cellules immunitaires innées engloutissent de grosses particules, a évolué à partir du mécanisme alimentaire des organismes unicellulaires, et implique de se lier à une cible, de l’envelopper d’une membrane et de pincer la membrane pour former une vacuole dans le cytosol appelée phagosome. Alors que la membrane phagosomale est dérivée de la membrane plasmique, le tri actif des protéines et des lipides, ainsi que la fusion avec les endomembranes lors de la formation du phagosome, transforment le phagosome en un organite distinct au sein de la cellule avec des propriétés dégradantes qui permettent la destruction, la neutralisatio....

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Protocole

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Déclaration éthique: Toutes les manipulations d'animaux ont été effectuées en stricte conformité avec les directives du Comité de recherche animale de l'Université de Genève.

1. Préparation des cibles phagocytaires

  1. Ajouter 20 mg de zymosan séché à 10 ml de solution saline stérile de phosphate tamponnée (PBS). Vortex et à la chaleur dans un bain d'eau bouillante pendant 10 min. Refroidir et centrifuger à 2000 g pendant 5 min.
  2. Retirer le surnageant, remettre en suspension dans 1 ml de PBS et de traitement par ultrasons pendant 10 minutes dans un sonicateur à bain-marie. Transférer 500 ul de deux tu....

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Résultats

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Voici les résultats représentatifs pour une expérience où le phagosome pH de neutrophiles de souris primaires isolées de la moelle osseuse de type sauvage ou Hvcn1 - / - les souris ont été comparés. Pour une expérience réussie, il est important d'obtenir suffisamment phagosomes dans le champ de vision pendant toute la durée du film time-lapse, tout en évitant de trop nombreux phagosomes, qui sera ensuite plus difficile de segmenter lors de l'analyse d'image. La figure 1 montre

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Discussion

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Bien que plus de temps que d'autres méthodes, telles que la spectroscopie et FACS, qui emploient une stratégie similaire en utilisant un colorant sensible au pH couplé à des objectifs, mais mesurer le pH moyen d'une population de phagosomes, microscopie offre plusieurs avantages. La première est que interne et externe lié, mais pas intériorisé, les particules peuvent être aisément distingué sans avoir à ajouter d'autres produits chimiques, comme le bleu trypan ou des anticorps, pour étancher ou étiqueter par.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs sont soutenus financièrement par le Fonds national suisse de la recherche scientifique par le biais d’une subvention de fonctionnement N° 31003A-149566 (à N.D.), et par le Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust par le biais d’une subvention pour jeunes chercheurs (à P.N.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Poudre Zymosan ASigma-AldrichZ4250Il existe différents fournisseurs
Isothiocyanate de fluorescéineSigma-AldrichF7250Différents fournisseurs existent
Anticorps anti-zymosan (réactif d’opsonisation des bioparticules Zymosan A)Life TechnologiesZ2850Sigma-Aldrich O6637 est un produit équivalent. Alternativement, le sérum à 25 % peut être utilisé comme réactif d’opsonisation.
Hydrazide 4-aminobenzoïque (4-ABH)Santa Cruzsc-204107Toxique, utilisez des gants, il existe divers fournisseurs Chlorure
diphénylèneiodonium (DPI)Sigma-AldrichD2926Toxique, utilisez des gants, il existe plusieurs fournisseurs
Concanamycine A (ConcA)Sigma-Aldrich27689Toxique, utilisez des gants, divers fournisseurs existent
NigericinSigma-AldrichN7143Toxique, utilisez des gants, il existe plusieurs fournisseurs
MonensinEnzoALX-380-026-G001Toxique, utilisez des gants, divers fournisseurs existent
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Life Technologies14200-075Toxique, utilisez des gants, différents fournisseurs existent
Solution saline équilibrée de HankTechnologies14025092La solution saline équilibrée de Ringer ou d’autres tampons physiologiques clairs peuvent être substitué.
Carbonate de sodium (Na2CO3)Sigma-AldrichS7795Il existe différents fournisseurs
d’acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES)Sigma-AldrichM3671  ;Il existe différents fournisseurs
Acide 4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-éthanesulfonique (HEPES)Sigma-AldrichH3375Il existe différents fournisseurs
de N-méthyl-D-glucamine (NMDG)Sigma-AldrichM2004  ;Il existe différents fournisseurs
Éthylène glycol-bis(2-aminoéthylétre)-N,N,N&prime ;,N&prime ;,-acide tétraacétique (EGTA)Sigma-Aldrich3777Il existe différents fournisseurs
Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris)Sigma-AldrichT1503  ;Il existe différents fournisseurs
Chlorure de potassium (KCl)Sigma-AldrichP9333Il existe différents fournisseurs
Chlorure de sodium (NaCl)Sigma-AldrichS7653Il existe différents fournisseurs
Chlorure de magnésium (MgCl2)Sigma-AldrichM8266Il existe différents fournisseurs
Éthanol absolu (EtOH)Sigma-Aldrich2860existe
différents fournisseursBoîtes de Pétri à fond en verre de 35 mm (Fluorodish)World Precision InstrumentsFD35-100Ibidi µ ;-clear Boîtes ou lamelles avec chambres d’imagerie appropriées peuvent être remplacées
Bain-marie soniquantO. Kleiner AGUn sonicateur peut être utilisé à la place, il existe différents fournisseurs d’instruments
HéamocytomètreMarienfeld GmbHIl existe
différents fournisseurs d’instrumentsMicroscope d’imagerie en direct à grand champCarl Zeiss AGIl existe différents fournisseurs d’instruments, mais le microscope doit être capable d’imager respectivement 440/535 et 490/535 d’excitation/émission. Les configurations confocales à disque rotatif avec des capacités de fond clair peuvent être remplacées, mais le zymosan a tendance à se défocaliser plus souvent.   ;
Pompe péristaltique (Dynamax RP-1)Il existe différents fournisseursd’instruments
pH mètreSchott Geräte GmbHDifférents fournisseurs d’instruments existent
Manual CounterMilian SAexiste différents fournisseurs d’instruments
de Life Il Rainin Il

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yeung, T., Grinstein, S. Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis. Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).
  2. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
  3. Fairn, G. D., Grinstein, ....

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Mots-clés

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