Cette méthode évalue l’invasion des cellules cancéreuses des sphéroïdes dans une matrice 3D environnante. Les sphéroïdes sont générés par la méthode de culture de gouttes suspendues, puis intégrés dans une matrice composée de matériaux de membrane basale et de collagène de type I. L’invasion des sphéroïdes est ensuite surveillée.
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Article de méthode
Une cellule cancéreuse Spheroid test pour évaluer Invasion dans un Cadre 3D
Dans cet article
Résumé
Résumé
La nature invasive des lignées cellulaires cancéreuses est censée être corrélée à leur potentiel métastatique. Cependant, la plupart des tests traditionnels n’examinent pas ces caractéristiques invasives dans un environnement tridimensionnel et les données qui en résultent souffrent d’une applicabilité biologique réduite. Ici, une approche est présentée pour visualiser la capacité invasive des lignées cellulaires dans un cadre physiologiquement pertinent. Le test d’invasion de sphéroïdes de cellules cancéreuses utilise d’abord la gravité pour générer des sphéroïdes dans des gouttes de milieu suspendues au couvercle d’une boîte de culture cellulaire. Ensuite, ces sphéroïdes sont intégrés dans une matrice 3D composée d’un mélange de matériaux de membrane basale et de collagène de type I. La sortie des cellules cancéreuses des sphéroïdes vers la matrice environnante est ensuite surveillée au fil du temps. La méthode décrite ici peut être modifiée pour examiner l’invasion après coculture de différents types de cellules, l’inclusion de médicaments/inhibiteurs ou l’altération des constituants de la matrice extracellulaire (MEC).
Introduction
Il est établi que la motilité des cellules cancéreuses est un facteur prédictif de potentiel métastatique, étant donné qu'un tel comportement facilite invasion à travers la membrane basale et l'entrée dans le système circulatoire 1. La plupart des recherches sur la motilité a mis l'accent sur la façon dont les cellules se comportent dans un (2D) paramètre à deux dimensions, mais il est en plus largement reconnu que le mouvement des cellules dans une matrice tridimensionnelle (3D) est plus représentatif de la façon dont ces mêmes cellules seront effectivement se comporter deux in vivo. Des systèmes de culture 3D de plus en plus utilisées pour étudier les comportements cellulaires qui vont de la morphologie cellulaire, de la cinétique de croissance et la sensibilité aux médicaments 3. Le désir de contrôler l'invasion de cellules cancéreuses dans le cadre d'un milieu 3D a conduit à la synthèse des techniques précédemment établies impliquant la génération d'agrégats de cellules 3D (sphéroïdes) via le procédé de culture de goutte suspendue 4, suivie de l'incorporation de ces sphéroïdes dans un extracellulaire 3D matrice (ECM), composée de collagène et de la membrane basale matériaux 5. Cette méthode vise à améliorer ces techniques précédemment établies en fournissant une approche simplifiée qui peut être facilement utilisé pour comparer l'invasion sous une variété de conditions expérimentales.
Plus méthodes traditionnelles pour évaluer la motilité cellulaire in vitro comprennent le dosage d'anti-enroulé et le dosage de 6 Transwell. Le premier essai montre la motilité des cellules dans un milieu en 2D, et est donc indépendante d'une variété de caractéristiques critiques pour l'invasion in vivo, par exemple une activité de protease 7. Le dosage Transwell peut mieux modèle invasion cellulaire lorsque les inserts de puits sont revêtues avec des substrats de ECM, mais, seulement un seul paramètre, à savoir l'apparition de cellules sur la surface opposée de la membrane est mesurée, et de nombreuses nuances de l'invasion des cellules ne sont donc pas facilement observable. Contrairement à ces techniques, le dosage cellulaire de cancer du sphéroïde invasion (figure 1 </ strong>) permet la surveillance en temps réel de l'invasion des cellules dans un cadre qui est non seulement physiologiquement pertinente, mais permet également des caractéristiques importantes de cellules spécifiques aux lignes à visualiser, tels que la migration de cellule individuelle vs 8 collective. Cette méthode offre également des avantages sur les essais de croissance de la culture 3D standard. La production d'agrégats cellulaires par la méthode de la goutte suspendue contraint initialement le mouvement des cellules, de sorte que les cellules sont incités à envahir après cette contrainte est levée. En outre, une fois que la contrainte est levée, la sortie de la cellule se déroulera dans une direction uniforme qui peuvent ensuite être facilement quantifiée.
Les matériaux d'ECM les plus populaires utilisés pour cellulaires de cancer sphéroïdes dosages sont Matrigel et collagène de type I, où chacune de ces composantes a des rôles importants et distincts à influencer le comportement métastatique. Matrigel est un mélange sécrétée de protéines produites par des cellules de sarcome Engelbreth-Holm Swarm souris, et est enrichie en améprotéines membranaires nt comme la laminine, entactine et collagène de type IV 9. Pour cette raison Matrigel est désormais appelé «matériaux de la membrane basale." Ces matériaux de la membrane basale fournissent ligands essentiels nécessaires pour intégrine adhérence lors de cancer invasion de la cellule 10, en plus de nombreuses autres protéines qui exercent une gamme d'effets sur le comportement de la cellule 11. En comparaison, collagène de type I, couramment préparé à partir de produits de digestion acide de tendons et d'autres structures de collagène dense 12, est un matériau de matrice beaucoup plus simple qui sert en tant qu'élément structurel principal de tissus tissulaires et du stroma de support conjonctifs et organes du corps. Il a été démontré que les caractéristiques physiques du collagène peuvent réguler un certain nombre de caractéristiques de la motilité des cellules; par exemple, l'alignement des fibrilles de collagène à l'interface de la tumeur du stroma permet aux cellules cancéreuses de migrer par la suite le long de ces fibrilles lors de l'invasion dans le stroma 13. Dans l'essai présenté ici, à la fois du collagène de type I et les matériaux de la membrane basale sont utilisés comme outils pour étudier les interactions cellule-cancer du stroma 3D.
L'effet de l'inhibition ou la stimulation des voies qui contrôlent l'invasion peut être surveillée après que les cellules ont été noyées dans la matrice 3D. Les cellules peuvent être prétraitées pendant la croissance dans les gouttes de suspension ou lors du transfert de la culture 3D, selon que le traitement de longue durée sera nécessaire pour moduler invasion. Pour les traitements plus courts, il est recommandé que le médicament est mélangé à la suspension de sphéroïde après la collecte, ainsi que le support qui entourent les cultures 3D, afin de faciliter l'exposition au médicament adéquat pour les cellules. Ensuite, les cellules stromales normales ou associés à une tumeur peuvent être mélangés avec le matériau de matrice afin d'évaluer leur rôle dans la modulation de l'invasion des cellules tumorales, ou pour déterminer le comportement des cellules influences de signalisation autocrine et paracrine. Cette idée a été montré dans une étude où la co-culture de colsur le cancer et les cellules endothéliales dans des gouttes suspendues conduit à un réseau vasculaire dans les sphéroïdes 14. Enfin, les constituants de l'ECM peuvent aussi être modifiées, comme l'invasion des cellules cancéreuses est influencée par différents substrats 15. La méthode présentée ci-dessous sera donc de fournir un cadre pour évaluer l'invasion des cellules cancéreuses dans une variété de conditions. En général, il a été trouvé que toutes les lignées de cellules vont créer des sphéroïdes dans les gouttes suspendues et des lignées de cellules epitheliales d'aspect forment typiquement des sphères régulières.
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Protocole
1. Génération de Sphéroïdes
- Préparer une suspension de cellules isolées pour accrocher des cultures de goutte à détacher des cultures de cellules adhérentes cancer de ~ 70% de confluence en utilisant un WASH PBS suivi par l'exposition à la solution de trypsine-EDTA à 0,05%.
- Neutraliser la solution de trypsine avec des milieux de culture de cellules et compter les cellules en utilisant une aliquote de la suspension cellulaire. Remarque: Les milieux de culture cellulaire spécifique dépendra de la lignée cellulaire testée. Suivre ATCC recommandations de média, où le milieu de culture cellulaire est généralement DMEM + 10% de FBS. Plus d'informations peuvent être trouvées dans le tableau des matériaux.
- Effectuer une dilution pour permettre l'ensemencement de 500-1000 cellules par goutte 20 ul de milieu de culture cellulaire.
- Acquérir de 10 cm et ajouter 5 ml de PBS stérile vers le bas. Remarque: Cette étape protège la pendaison chute de l'évaporation. Basse-coût »bactériologiques de qualité" plats peut être utilisé à la place de plats de qualité de culture de cellules, comme les cellules ne sera pas suiteagir la surface de culture.
- Utiliser une pipette à canaux multiples pour transférer 20 pi de gouttelettes de la suspension cellulaire diluée à la surface intérieure du couvercle.
- Pipet 40 gouttes (5 rangées de 8 gouttes) sur le couvercle de la boîte de 10 cm.
- Inversez le couvercle et la placer sur la boîte de culture. Incuber les cultures de goutte suspendue à 37 ° C pendant 72 heures pour générer sphéroïdes.
- Retournez le couvercle d'une manière confiante, mais contrôlée. Remarque: L'inversion du couvercle trop rapide ou trop lent peut causer des gouttelettes pour décaler. Certaines lignées de cellules peuvent former des sphéroïdes 48 h ou moins, tandis que d'autres peuvent nécessiter plus de 72 heures pour produire des agrégats compacts.
2. Embedding de Sphéroïdes en 3D Matrix
- Décongeler une aliquote de sous-sol matériaux membranaires facteur réduit la croissance à 4 ° C pendant la nuit avant de l'intégrer sphéroïdes.
- Facultatif: puits de couche avec ECM à l'avance pour éviter l'interaction sphéroïde potentiel avec le tissu de culture surface.
- Pipet 200 pi de ECM par puits sur une plaque de 24 puits.
- Incliner la plaque pour que le ECM couvre la surface du puits tout entier.
- Retirez délicatement l'excès ECM avec une pipette.
- Incuber la plaque jusqu'à ce que les puits sont à sec: 3 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
- Facultatif: puits de couche avec ECM à l'avance pour éviter l'interaction sphéroïde potentiel avec le tissu de culture surface.
- Recueillir les sphéroïdes en inclinant le couvercle de la boîte de culture de tissus et de mutualiser les médias. Transférer les médias avec les sphéroïdes dans un tube de 1,5 ml.
- Autoriser 10 min pour les sphéroïdes à se déposent au fond du tube à centrifuger. Sphéroïdes devraient être visibles à l'œil nu.
- Mélanger 100 pi des matériaux de la membrane basale avec 100 pi de froid (4 ° C) collagène de type I dans un tube pré-réfrigéré séparé. Gardez le mélange à 4 ° C pour éviter la gel de se solidifier prématurément.
- Utilisez les embouts de pipettes pré-réfrigérées si le transfert de petits volumes.
- Donner des soins quandmélanger les matières de la membrane basale et de collagène de type I pour empêcher la formation de bulles d'air. Remarque: Les bulles d'air peuvent entraver imagerie plus tard dans le protocole si elles deviennent intégrés dans le gel.
- Aspirer les sphéroïdes de la partie inférieure de 40 ul du tube de microcentrifugeuse, et de combiner avec les matériaux de la membrane basale / collagène de type I mélange. Soyez prudent pour éviter la formation de bulles d'air lors du mélange. Remarque: La solution contenant des matières de la membrane basale 100 pi, 100 pi de collagène de type I, ainsi que 40 ul de sphéroïdes vais créer suffisamment de matière pour 4 3D cultures indépendantes. Cela peut être agrandie ou réduite.
- Pipet 40 Les gouttes ul du mélange visqueux dans les centres de puits sur une plaque de 24 puits. Maintenir le niveau de la plaque pour empêcher le mélange de courir dans le côté du puits. Remarque: Une seule colonne sur la plaque de 24 puits - 4 puits - est recommandé pour chaque condition à tester.
- Placer la plaque into 37 ° C incubateur et laisser reposer pendant 30 min. La culture 3D va polymériser pendant cette période.
- Plonger lentement les cultures 3D dans 1 ml de milieu de culture cellulaire.
- Assurez-vous que les médias est chaud quand l'ajouter dans les puits afin de promouvoir davantage la polymérisation de gel.
- Étape critique: Ajouter délicatement les médias aux cultures 3D. Pipetage des médias trop vite dans les puits peut conduire au détachement des cultures 3D de la surface de culture de tissus.
3. Suivi et analyse de Spheroid Invasion
- L'invasion de l'image dans les sphéroïdes dans la matrice 3D environnante aux points de contrôle décidées par l'enquêteur. Acquérir des photos en utilisant un microscope inversé avec l'objectif 20x. Remarque: points de temps Idéal diffèrent en fonction de la lignée cellulaire testée. Lignées cellulaires plus invasives vont commencer leur sortie des sphéroïdes peu après placage et, par conséquent, de prendre la photo initiales au sein d'un couple d'heures après placage. Généralement, les photos sont prises à 0 h (après le placage), 24 h et 48 h. Invasion conclut généralement 24 à 48 heures après l'étalement.
- Quantifier la capacité invasive en utilisant un logiciel d'analyse d'image comme J. Image
- Analyser invasion comme étant la distance de la cellule à partir du bord de la sphéroïde.
- Utilisez l'outil Dessiner droite pour marquer le rayon et / ou de la distance maximale invasive.
- Cliquez sur "Analyser" dans le menu du haut, puis cliquez sur "mesure" pour afficher la mesure de longueur.
- Analyser invasion comme la superficie totale invasive en dehors de la sphéroïde.
- Utilisez l'outil de dessiner à main levée pour tracer la frontière du sphéroïde et / ou de la zone invasive totale.
- Cliquez sur "Analyser" dans le menu du haut, puis cliquez sur "mesure" pour afficher la mesure de la superficie.
- Utilisez un plugin comme Manager Tools ROI pour créer des mesures pour une pile d'images.
- Analyser invasion comme étant la distance de la cellule à partir du bord de la sphéroïde.
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Résultats
En utilisant le dosage d'invasion sphéroïde (figure 1), un panel de lignées cellulaires du cancer a été testé pour leur aptitude à former des sphéroïdes, ainsi que pour la quantité de sortie de la cellule exposée après l'implantation dans une matrice 3D constitué de matériaux de membrane de sous-sol et de collagène de type I (Tableau 1). Ces résultats démontrent que chaque lignée cellulaire de cancer va créer sphéroïdes bien formés, où les lignes de cellules possédant une morpho...
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Discussion
Cette étude a évalué la performance d'un panel de lignées cellulaires cancéreuses dans un test d'invasion sphéroïde (tableau 1). En règle générale, nous constatons que la formation sphéroïde est renforcée dans les plus lignées de cellules épithéliales prospectifs, où la présence de jonctions cellule-cellule favorise la formation d'une architecture sphéroïde-like. Connus lignes de cellules qui ont subi une transition épithélio-mésenchymateuse, comme MDA-MB-231 cellules ne forment pas des sphé...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Pris en charge par le NIH subventions P30 CA051008 et CA009686 T32 (ATR).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Matrigel Facteur de croissance réduit | Corning | CB-40234 | |
| Collagène de type I, queue de rat, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Moyen ; | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0,05 % Trypsine-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Sérum fœtal de bovin, inactivé à la chaleur | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100 mm Plats traités TC | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24 puits TC Plaques traitées | NEST Biotechnlologie | 702001 | |
| inversé Olympus IX-71 | |||
| Les lignées cellulaires ont été maintenues en DMEM + 10 % FBS, avec l’attente de cellules BT-474 et LNCaP, qui ont été maintenues en RPMI + 10 % FBS. |
Références
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 51, (2011).
- Del Duca,, Werbowetski, D., T,, Del Maestro,, F, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 88, (2014).
- Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion. J Bio Chem. 274 (19), Forthcoming.
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor. Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), (2006).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), (2006).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
- Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).
- Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 147 (3), Forthcoming.
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), (2013).
- Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix. J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).
- Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).
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Réimpressions et autorisations
