Immunoprécipitation de la chromatine test pour l&#39;identification de Arabidopsis interactions protéine-ADN<em&gt; In Vivo</em

Résumé

Immunoprécipitation de la chromatine est une technique puissante pour l'identification des sites d'ADN d'Arabidopsis protéines de liaison in vivo. Cette procédure comprend la réticulation de la chromatine et la fragmentation, une immunoprécipitation avec des anticorps sélectifs contre la protéine d'intérêt, et l'analyse qPCR de l'ADN lié. Nous décrivons un test simple de ChIP optimisé pour les plantes d'Arabidopsis.

Résumé

Des réseaux complexes de régulation des gènes orchestrent les processus biologiques et les transitions de développement chez les plantes. L’activation transcriptionnelle sélective et le silençage des gènes médient la réponse des plantes aux signaux environnementaux et aux signaux de développement. Par conséquent, il est essentiel de mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent l’expression des gènes des plantes pour mieux comprendre comment les processus biologiques sont régulés chez les plantes. La technique d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) décrite ici est une procédure permettant d’identifier les sites de liaison à l’ADN des protéines dans les gènes ou les régions génomiques de l’espèce modèle Arabidopsis thaliana. Les interactions avec l’ADN de protéines d’intérêt telles que les facteurs de transcription, les protéines de la chromatine ou les versions modifiées post-traductionnellement des histones peuvent être analysées efficacement avec le protocole ChIP. Cette méthode est basée sur la fixation des interactions protéine-ADN in vivo, la fragmentation aléatoire de la chromatine, l’immunoprécipitation de complexes protéine-ADN avec des anticorps spécifiques, et la quantification de l’ADN associé à la protéine d’intérêt par des techniques de PCR. L’utilisation de cette méthodologie chez Arabidopsis a contribué de manière significative à dévoiler des mécanismes de régulation transcriptionnelle qui contrôlent une variété de processus biologiques végétaux. Cette approche a permis d’identifier les sites de liaison de la protéine chromatineuse EBS d’Arabidopsis aux régions régulatrices du gène maître de la floraison FT. L’impact de cette protéine dans l’accumulation de marques d’histones particulières dans la région génomique de la FT a également été révélé par l’analyse ChIP.

Introduction

Au cours des dernières années, un large éventail d'outils génétiques, moléculaires et génomiques ont été développés dans le espèce modèle Arabidopsis thaliana. Cette technologie a facilité énormément le progrès dans la compréhension comment le développement de la plante est réglementé. Parmi les processus développementaux étudiés en utilisant Arabidopsis comme un modèle, le contrôle génétique de la période de floraison a été largement analysé. Ces études ont montré que les plantes modulent très précisément le moment de la floraison, en réponse à des signaux endogènes tels que les hormones et l'âge de la plante, et également à des signaux environnemen....

Protocole

1. réticulation du matériel végétal (1 h)

1. Cultiver les lignées d'Arabidopsis utilisés dans l'expérience (de type sauvage - WT - contre les mutants, et / ou lignées exprimant la version étiqueté de votre protéine d'intérêt par rapport lignées exprimant la balise pas fusionnés à toute protéine) pendant 12-18 jours sur de grandes boîtes de Pétri (150 mm) avec du milieu MS-agar (1 L: sels de Murashige & Skoog 1x, 10 g de saccharose, 0,5 g de MES, pH 5,7 (KOH), 1% de gélose). Alternativement, cultiver des plantes sur des pots contenant 3: 1 mélange de terre et de vermiculite.
   ATTENTION! Le formaldéhyde est toxique par inhalat....

Résultats

Huit principales étapes peuvent être distinguées dans ce protocole de puce pour l'identification d'interactions in vivo protéine-ADN, y compris culture et la récolte de la matière végétale, la réticulation de la chromatine, l'isolement de la chromatine, la fragmentation de la chromatine, isolement sélectif des complexes entre l'ADN et la protéine d'intérêt par immunoprécipitation, la digestion des protéines, purification de l'ADN, et l'analyse qPCR (figure 1). Une ét.......

Discussion

Le protocole décrit ci-ChIP est une technique reproductible et puissant pour analyser les interactions entre les protéines et les séquences d'ADN spécifiques in vivo dans des plantes Arabidopsis. Une identification réussie des sites de liaison pour les protéines d'intérêt exige une sélection adéquate des organes de la plante ou des stades de développement où les interactions pertinentes ont effectivement lieu. En outre, il est essentiel d'obtenir une fixation appropriée de la matière végétale et un .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
MES	Sigma	M8250
MS (mélange de sels de base Murashige et Skoog)	Sigma	M5524
Formaldéhyde 37 %  ;	Sigma	F8775-25	Utilisation sous la hotte Mélange d’inhibiteurs
protéase cOmplete ULTRA Tablets, Mini, sans EDTA, EASYpack	Roche	5892791001
Bioruptor Dispositif de sonication standard	Diagenode	B01010002 (UCD200TO)
Glycine	Sigma	50046
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
Billes magnétiques Dynabeads couplées à la protéine A ou à la protéine G	Life Technologies	10003D/10001D	Vérifier le fabricant' s manuel pour l’affinité d’anticorps
Miracloth Merck	Millipore	475855
Triton X-100 Surfact-Amps Détergent Solution	Life Technologies	85112
(souris, rat, lapin &hellip ;)-IgG	Diagenode	C15400001, C15420001, C15410206
Rack magnétique - DynaMag-2	Life Technologies	12321D
H3K9/14ac Anticorps polyclonal - Premium  ;	Diagenode	C15410200-10
Chelex 100 Résine	Bio-Rad	142-2832
Proteinase K	Life Technologies	17916
Anti-Myc Tag Anticorps, clone 4A6	Millipore	05-724
LightCycler 480 SYBR Green I Master	Roche	4707516001

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