Développement d'une bande de test immunochromatographique à base d'or colloïdal pour la détection des Cétacés myoglobine

Résumé

Ce protocole décrit le développement de deux anticorps monoclonaux (mAbs) de classe IgG fortement réactifs à la myoglobine des cétacés. Ces anticorps monoclonaux sont appliqués sur une bandelette de test immunochromatographique en or colloïdal basée sur le format sandwich pour différencier le Mb des cétacés des phoques et d’autres animaux.

Résumé

Ce protocole décrit le développement d’une bandelette de test immunochromatographique en or colloïdal basée sur le format sandwich qui peut être utilisée pour différencier la myoglobine (Mb) des cétacés de celle des phoques et d’autres animaux. La bande permet un dépistage rapide et sur place de la viande de cétacés, limitant ainsi son commerce et sa consommation illégaux. Deux anticorps monoclonaux (mAbs) ayant une réactivité envers le Mb des cétacés ont été développés. Les séquences d’acides aminés des régions réactives antigéniques Mb de divers animaux ont été analysées afin de concevoir deux peptides synthétiques (un peptide général et un peptide spécifique) et d’élever ensuite les mAbs (sous-classe IgG₁). Les anticorps monoclonaux ont été sélectionnés à partir d’hybridomes criblés par ELISA indirect, western blot et dot blot. CGF5H9 était spécifique aux Mbs des lapins, des chiens, des porcs, des vaches, des chèvres et des cétacés, tandis qu’il montrait une faible ou aucune affinité avec les Mbs des poulets, des thons et des phoques. CSF1H13 peut lier les phoques et les cétacés avec une forte affinité, mais n’a montré aucune affinité avec d’autres animaux. Des échantillons de cétacés de quatre familles (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae et Kogiidae) ont été utilisés dans cette étude, et les résultats ont indiqué que ces deux anticorps monoclonaux ont une large capacité de liaison aux MBS de différents cétacés. Ces anticorps monochimiques ont été appliqués sur une bandelette de test immunochromatographique d’or colloïdal de type sandwich. CGF5H9, qui reconnaît de nombreuses espèces, a été marqué à l’or par des colloïdes et utilisé comme anticorps de détection. CSF1H13, qui a été enduit sur la zone d’essai, a détecté la présence de Mbs de cétacés et de phoques. Des échantillons de muscles de thon, de poulet, de phoque, de cinq espèces de mammifères terrestres et de 15 espèces de cétacés ont été testés en trois exemplaires. Tous les échantillons de cétacés ont montré des résultats positifs et tous les autres échantillons ont montré des résultats négatifs.

Introduction

Historiquement, la viande de cétacé a été consommée dans de nombreuses régions du monde et cette consommation continue aujourd’hui¹. En raison du niveau trophique des cétacés, on sait que des niveaux élevés de mercure et d’autres toxines sont présents dans leur viande². Par conséquent, la consommation de viande de cétacé pourrait entraîner un problème de santé non seulement pour les groupes à haut risque tels que les femmes enceintes, mais aussi pour la population générale³. En outre, la contamination de la viande de cétacé par des agents pathogènes zoonotiques ou potentiellement zoonotiques peut également se produire lors de sa transformation et de son stockage⁴. Il est difficile, même pour des agents expérimentés, d’identifier les viandes de cétacés par leur seule apparence. Par conséquent, une méthode d’identification scientifique fiable est nécessaire pour différencier la viande de cétacé des autres viandes. Cela permettrait de limiter la consommation de viande de cétacés.

Les méthodes actuelles d’identification des espèces comprennent des techniques moléculaires et des méthodes immunologiques. Les techniques moléculaires, telles que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et le séquençage de l’ADN, peuvent être utilisées pour identifier des échantillons non seulement de viande crue⁵ et d’échantillons décomposés⁶, mais aussi d’aliments transformés tels que les saucisses cuites et les aliments pour animaux^7,8. Les méthodes immunologiques, telles que le test immuno-enzymatique (ELISA), sont couramment utilisées dans la production alimentaire pour détecter la teneur en viande, par exemple, du porc⁹, du bœuf¹⁰ et du poisson-chat¹¹. L’analyse de l’ADN par PCR pour l’identification de la viande de cétacé est disponible¹² et a contribué à prévenir le commerce international illégal de viande de cétacé au Japon, en Corée du Sud, aux Philippines, à Taïwan, à Hong Kong, en Russie, en Norvège et aux États-Unis¹. Ces méthodes sont efficaces et fiables, mais elles peuvent prendre des heures ou des jours et impliquer des étapes laborieuses. L’identification de la viande des cétacés est généralement basée sur des techniques moléculaires et il n’existe actuellement aucune méthode immunologique. Pour les organismes de réglementation, il est hautement souhaitable de mettre au point une technique fiable et rapide qui puisse être utilisée sur le terrain pour identifier les viandes de cétacés.

Les bandelettes immunochromatographiques sont utilisées comme outils de détection avec l’avantage de produire un résultat rapide via un protocole simple et adapté à une utilisation sur le terrain. Les principes de la bandelette immunochromatographique et de l’ELISA sont très similaires et comprennent des anticorps, des antigènes et des marquages. De nombreux marqueurs différents tels que l’or colloïdal, le carbone et le latex ont été utilisés dans le développement de bandes immunochromatographiques. À l’heure actuelle, cette méthode est couramment utilisée pour détecter les antibiotiques, les toxines, les bactéries et les virus¹³, mais elle est rarement utilisée pour identifier les protéines dans la viande^14,15. Ici, nous proposons un dosage immunoenzymatique par chromatographie à flux latéral pour la détection rapide de la myoglobine (Mb) des cétacés.

Protocole

Déclaration éthique: L'étude a été réalisée conformément aux directives internationales et approuvé par le Comité institutionnel des soins aux animaux et de l' utilisation (IACUC) de l' Université Nationale Chiayi, l' approbation ID: 99022. L'utilisation de l' échantillon cétacé a été autorisé par le Conseil de l' agriculture de Taiwan (permis de recherche 100M-02.1-C-99).

1. Muscle Préparation de l'échantillon et SDS-PAGE

Note: Les échantillons de muscle de 23 espèces dont 16 espèces de mammifères marins, 5 espèces de mammifères terrestres, le thon et le poulet ont été utilisés dans cette étude (tableau 1). Les échantillons de muscles de cétacés ont été obtenus à partir d'individus échoués, la pêche, les prises accessoires et à la confiscation. Lapin, le rat, le chien et les tissus musculaires de poulet ont été obtenus à partir de la maladie Centre de diagnostic animal de l'Université Nationale Chiayi. Des échantillons de boeuf, de porc, de l'agneau, et le thon ont été achetés dans un supermarché local. L'échantillon musculaire du phoque (Phoca vitulina ) a été fourni par Farglory Ocean Park. dodécyl sulfate de sodium par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) a été utilisée pour séparer les protéines solubles avec des masses moléculaires différentes dans des échantillons de muscle.

1. Conservez tous les échantillons à -20 ° C jusqu'à utilisation.
2. mortier pré-cool à -20 ° C. Ensuite, mettre 3 g de l'échantillon de muscle congelé en elle.
3. Homogénéiser l'échantillon avec 10 ml d'une solution saline froide tamponnée au phosphate (PBS) en utilisant un homogénéiseur de tissu.
4. Centrifuger l'échantillon homogénéisé à 10.000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Collecter les surnageants et le stocker à -20 ° C jusqu'à utilisation.
5. Préparer 5 ml de 5% de gel d'empilement (3,07 ml d'eau distillée, 1,25 ml de tampon de gel supérieure 4x pH 6,8, 625 ul de 40% d'acrylamide, 50 pl de 10% de persulfate d'ammonium (APS), et 5 ul de la tétraméthyléthylènediamine ( TEMED)) et 10 ml de 15% de gel de séparation (3,65 ml d'eau distillée, 2,5 ml de 4x tampon de gel inférieur à pH 8,8, 3,75 ml de 40% d'acrylamide, 100 ul de 10% d'APS,et 4 ul de TEMED).
   1. Dans la cellule d'électrophorèse, verser gel d'empilement (5% d'acrylamide) sur le dessus du gel de séparation (15% d'acrylamide) après que celle-ci soit solidifiée. Insérer un peigne de gel dans le gel d'empilement.
6. Effectuer PAGE selon les conditions suivantes: état de fonctionnement initial: 100 volts, 20 min et dernière condition: 120 volts, 40 min.
7. Colorer le gel avec du bleu brillant Coomassie à la température ambiante pendant 30 minutes jusqu'à ce que le gel est uniformément de couleur bleue.
   Remarque: La coloration est terminée lorsque le gel est plus visible dans la solution de colorant.
8. Décolorer avec une solution d'acide acétique (10%) à la température ambiante pendant 1 h. Les bandes commencent à apparaître. Continuer détachage à 4 ° C pendant la nuit jusqu'à ce fond est clair.

2. Peptide Synthèse et Production d'anticorps monoclonaux

1. Récupérez les séquences d'acides aminés de Mb de GenBank y compris le thon, le poulet, l'autruche, les mammifères domestiques, le phoque et 18 espècesdes cétacés (tableau 2).
2. Alignez les séquences en utilisant un logiciel approprié ^16:
   1. Lancez l'alignement Explorer en sélectionnant Aligner: Modifier / Construire l' alignement sur ​​la barre de lancement; sélectionnez Créer un nouveau alignement , puis cliquez sur OK. Une boîte de dialogue apparaîtra vous demandant «Êtes-vous construire un alignement de séquences d'ADN ou de protéines?"
   2. Cliquez sur le bouton "Protein"; sélectionnez Données: Open: Récupérer des séquences de fichiers et fichier de séquence de sélection; sélectionnez Edit: Tout sélectionner la commande de menu pour sélectionner tous les sites pour chaque séquence dans l'ensemble pour créer un alignement de séquences multiples données.
   3. Sélectionnez Alignement: Alignez par ClustalW dans le menu principal pour aligner les séquences données sélectionnées en utilisant l'algorithme ClustalW; sélectionnez "BLOSUM" comme la protéine Poids Matrice puis cliquez sur le bouton OK.
3. Analyser l'alignement de la séquence:
   1. Focus sur 5 si réactif antigéniquetes ^17: site 1 (AKVEADVA, 15-22), le site 2 (KASEDLK, 56-62), le site 3 (ATKHKI, 94-99), le site 4 (HVLHSRH, 113-119) et le site 5 (KYKELGY, 145- 151) et de trouver le fragment conservé parmi les cétacés. Un astérisque (*; symbole de consensus dans l'alignement (Protocole 2.2.3)) indique les positions qui ont un seul résidu, entièrement conservé. Les fragments conservés suivants dans les cétacés ont été trouvés: séquence KASEDLKKHG (qui comprend le site 2) et la séquence HVLHSRHP (qui comprend le site 4).
4. Synthétiser des fragments de séquences candidates en fonction de l'analyse de la séquence et le conjugué avec une protéine d'ovalbumine (OVA) comme protéine porteuse en utilisant les services commerciaux.
   1. Ajouter des acides aminés hydrophobes (par exemple methionine) à l' extrémité N-terminale du site réactif antigénique pour empêcher le peptide provenant de la décomposition (par exemple, M-KASEDLKKHG).
   2. Allonger le C-terminal du site réactif antigénique pour exposer le site antigénique de base à l'immunocytes. En outre, Conjuporte le peptide avec de l' OVA par addition d' une cysteine ​​(Cys, C) , à l' extrémité C-terminale (par exemple, M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
5. Émulsifier l'adjuvant complet de Freund pour immunogène 1 ou l'adjuvant incomplet de Freund pour les deux immunogene avec un volume égal de chaque peptide synthétique dans du PBS (3 ml, concentration finale de 30-50 ug / 100 ul).
6. Inoculer immunogene 1 (0,1 mg) par voie sous- cutanée dans chacune des souris BALB / c 5 femelle.
7. Effectuer des injections de rappel sous-cutanée cinq fois à l'aide de 2 immunogène à des intervalles de deux semaines et de recueillir des sérums de test en queue de clip échantillonnage des souris avant chaque booster.
8. Déterminer les sérums titre pour la première projection.
   1. Dissoudre 100 pg de peptide libre dans 25 ml de tampon de réaction et aliquote de 50 ul de la solution dans chaque puits d'une plaque à 96 puits. Ajouter une solution de réactif de couplage de 10 pi dans chaque puits et mélanger la plaque. Incuber la plaque pendant 2 h à température ambiante.
   2. Supprimez le contenu du puits,laver chaque puits 3 fois avec de l'eau distillée, et bloquer la plaque en ajoutant 200 pi de solution de blocage. Incuber pendant 1 heure à température ambiante. Retirer le contenu et laver chaque puits 3 fois avec de l'eau distillée.
   3. Effectuer ELISA indirect (Protocole 5.1-5.7) pour déterminer les sérums titre pour la première projection. Choisissez la souris avec le titre le plus élevé (la plus haute densité optique) pour la collecte de la rate.
9. Trois jours avant la collecte de la rate, ensemencer 0,1 mg d'immunogène 1 voie sous-cutanée dans la souris présentant le titre le plus élevé.
10. Recueillir les cellules de rate des souris immunisées choisies et fusionner avec des cellules de myélome murin F0 (sp2 / 0-Ag14) pour obtenir des cellules d'hybridome pour la production de mAb ^18.
11. 14 jours après la fusion, sélectionnez les clones positifs par criblage de la réactivité des surnageants d'hybridome vers peptide synthétique libre en utilisant ELISA indirect (Protocole 5.1-5.7).
12. Diluer les cellules à un nombre approprié par puits pour maximizment la proportion des puits qui ne contiennent qu'un seul clone unique (dilution de clonage).
    1. Ajouter 100 ul de milieu de culture cellulaire à tous les puits de la plaque de 96 puits, sauf A1 et qui est laissé vide.
    2. Ajouter 200 ul de la suspension cellulaire dans le puits A1. Puis transférer rapidement 100 pi de A1 à B1 et mélanger par pipetage. Répétez ces 1: 2 dilutions en bas de la colonne entière, puis jetez 100 pi de H1 de sorte qu'il se retrouve avec le même volume que les puits au-dessus.
    3. Ajouter une 100 ul supplémentaires de support à la colonne 1 avec une micro-pipette à 8 canaux. Transférer ensuite rapidement 100 ul de chacun des puits dans la colonne 1 à ceux de la colonne 2, en utilisant la même pipette et mélanger doucement par pipetage.
    4. En utilisant les mêmes conseils, répéter ces 1: 2 dilutions dans l'ensemble de la plaque. Jeter les 100 ul de chacun des puits dans la dernière colonne.
    5. Amener le volume final de chaque puits à 200 ul par addition de 100 ul de milieu à chaque puits. Incuber plate undisturbed à 37 ° C dans un incubateur à _CO2 humidifié.
    6. Vérifiez chaque puits et marquer tous les puits qui contiennent une seule colonie. Réaliser deux ou plusieurs clonages jusqu'à ce que> 90% des puits contenant des clones uniques sont positifs pour la production d'anticorps.
13. Tamiser les clones par western blot et dot blot (protocole 03.01 à 04.06). Puis colonies de sous-culture des puits dans les grands navires pour développer des cellules pour obtenir des mAb. Habituellement, chaque clone est transféré dans un seul puits dans une plaque de 12 ou 24 puits.
14. Mesurer l'affinité entre les mAb et les extraits de muscle de vache, de chèvre, de porc, chien, lapin, le thon, le poulet, le phoque, et quatre espèces de cétacés représentatives par western blot et dot blot (protocole 03.01 à 04.06).
15. Inoculer les cellules d'hybridome sélectionnées (jusqu'à 3 x 10 ⁶⁾ intrapéritonéale à des souris pour induire ascite. gonflement abdominal est généralement apparente dans les 7-10 jours après l'injection d'hybridome. Collecter fluide à l'aide d'une aiguille hypodermique(Moins de 20 gauge).
16. un fluide d'ascites centrifuge (10 000 x g pendant 10 min) pour éliminer les cellules et les débris. Filtrer à travers un filtre de 0,45 um. Ajouter 1 à 20 ml de l'échantillon, 15 ml de tampon de liaison, et de 3 à 5 ml de tampon d'élution dans la colonne de protéine G-Sepharose. Recueillir la fraction d'élution contenant l'anticorps purifié à partir du liquide d'ascite de souris.
17. Déterminer l'isotype d'anticorps par kit isotypage d'anticorps en utilisant les instructions du fabricant.

3. Western Blot

1. Préparer un tampon de charge 2x contenant du β-mercaptoéthanol (BME) en mélangeant 950 pi de tampon d'échantillon de Laemmli 2x avec 50 ul de BME. Diluer les surnageants musculaires (protocole 1.1-1.4) dans un tampon de chargement avec un rapport approprié pour l'obtention de bons signaux: 1:50 (cétacés et phoques) et 1: 5 (les animaux domestiques et le thon) lors de l'utilisation d'anticorps Mb polyclonal de lapin anti-humaine, et 1: 1 (porc, lapin, poulet et thon), 1: 5 (vache, chèvre et le chien), et 1:25 (cétacés et phoques) quand unntibody est de surnageant d'hybridome.
2. Chauffer l'échantillon à 95 ° C pendant 5 min. Charger les échantillons dans les puits d'un gel SDS-PAGE (acrylamide à 4% d'empilage et 12% d'acrylamide de séparation) ainsi que des marqueurs de poids moléculaire. Exécutez le gel pendant 5 min à 50 V augmente alors la tension à 150 V pour terminer la course dans environ 1 h.
3. Placer le gel dans un tampon de transfert 1x pendant 15 min. Transférer la protéine séparée de nitrocellulose (NC) membranes après ils sont séparés par PAGE. Le transfert peut être fait à 100 V pendant 60-90 min.
4. Préparer une solution de blocage: 1x PBS contenant 0,1% de Tween 20 avec 5% de lait écrémé en poudre. Bloquer la membrane NC dans 25 ml de solution à la température ambiante de blocage pendant 1 h. Laver trois fois pendant 5 minutes à chaque fois avec 15 ml de tampon phosphate salin avec du Tween 20 (PBST).
5. Incuber la membrane et de l'anticorps primaire (liquide d'ascite ou le surnageant d'hybridome) dans 10 ml de tampon de dilution d'anticorps dilué avec une solution de blocage de 5% à 4 ° C pendant une nuit.
6. Laver le Membrane nouveau trois fois avec PBST pour nettoyer anticorps excessive.
7. Incuber la membrane avec alcaline de chèvre conjugué à la phosphatase IgG anti-souris à 1: 1250 dans une solution de blocage avec une légère agitation pendant 1 heure à température ambiante.
8. Laver la membrane et on incube à nouveau dans le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate de chlorure / p-nitrobleu de tétrazolium (BCIP / NBT) du mélange de substrat de phosphatase 10 à 20 min jusqu'à ce que le développement de la couleur.
9. Arrêter la réaction en lavant la membrane plusieurs changements d'eau distillée.

4. Dot Blot

1. Diluer les surnageants musculaires (protocole 1.1-1.4) dans 5% de sérum albumine bovine (BSA) dans du PBST avec un rapport approprié pour l'obtention de bons signaux: 1: 5 pour les animaux domestiques et le thon, et 1h25 pour les cétacés et phoques. Spot 5 pi d'échantillons sur une membrane. Minimiser la zone que la solution pénètre (habituellement 3-4 mm de diamètre) en appliquant lentement.
2. Sécher la membrane à la température ambiante (par exemple, </ Em> dans un flux laminaire pendant 30-60 min), la bloquer avec une solution en boîte de Pétri de blocage pendant 1 h à température ambiante, et le laver avec du PBST.
3. Incuber la membrane avec l'anticorps primaire (mAb de surnageant d'hybridome à 1: 10 000 ou fluide ascitique à 1: 100 000 dilué dans une solution de blocage de 5%) pendant 1 h à température ambiante.
4. L'utilisation du PBST pour laver la membrane à trois reprises pendant 5 min à chaque fois pour éliminer l'excès d'anticorps, puis incuber avec un anticorps secondaire (alcaline de chèvre conjugué à la phosphatase IgG anti-souris à 1: 1250 dans 5% de solution de blocage) pendant 1 heure à la température ambiante, .
5. Laver la membrane et on incube à nouveau dans le mélange de substrat de phosphatase BCIP / NBT à l'intérieur de 10 à 20 min jusqu'à ce que le développement de la couleur.
6. Arrêter la réaction en lavant la membrane plusieurs changements d'eau distillée.

5. ELISA indirect

1. Préparer un tampon de lavage (imidazole 0,002 M de solution saline tamponnée avec 0,02% de Tween 20). Laver la plaque 3 fois avec lavetampon entre chaque étape suivante (protocole 5,2-5,5).
2. Préparer une dilution 1:25 du surnageant de muscle (protocole de 1,1 à 1,4) dans un tampon de revêtement. Enduire une plaque à 96 puits ELISA avec 100 pi surnageants dilués à 4 ° C pendant la nuit et le bloquer avec un tampon de blocage (1% de BSA dans du PBS) pendant 1 heure à température ambiante.
3. Préparer 1: 2000 dilution de l'anticorps monoclonal purifié avec du tampon dilué et ajouter 100 pi de mAb dilué à chaque puits. Incuber la plaque pendant 1 heure à température ambiante.
4. Ajouter un anticorps de chèvre anti-IgG de souris conjugué avec de la peroxydase de raifort (dilution 1: 200 dans un tampon de dilution) pour une incubation supplémentaire.
5. Ajouter le substrat de la peroxydase dans chaque puits (100 pl / puits) et incuber pendant 10 à 15 min.
6. Arrêter la réaction enzymatique par la solution d'arrêt de la peroxydase (100 pl / puits) lorsque le développement de la couleur est observée.
7. Lire la densité optique à 450 nm en utilisant un spectrophotomètre de microplaque.

6. Préparation de l'or colloïdal marqué mAb

Remarque: La couleur de la solution d'or colloïdal et le mélange doit toujours être rouge. Ajuster le pH, la concentration de mAb, la vitesse de la centrifugeuse lorsque précipité noir est remarqué. Les étapes 6.1 et 6.2 sont des étapes d'optimisation.

1. Ajouter la détection Acm purifié (50 pg / ml, 3 ul) à 100 ul d'une solution d'or colloïdal avec des valeurs de pH variant de 5-9. Le pH minimum qui maintient la couleur rouge pendant deux heures est considérée comme le pH optimal. Nota: Dans cette étude, 0,1 M de carbonate de potassium a été utilisé pour ajuster l'or colloïdal (40 nm) de la solution à pH 8,0 (pH optimum).
2. Ajouter diverses quantités de mAb purifiés de détection (500 pg / ml, de 1 à 20 ul) à 100 ul d'une solution d'or colloïdal à un pH de 8,0. Note: La concentration optimale dans cette étude est de 6 pg / ml (pas précipité noir).
3. D'après les résultats ci-dessus, ajouter 60 pg d'Acm purifié détection de goutte à goutte à 10 ml d'une solution d'or colloïdal. Émulsionner le mélange doucement à température ambiante pendant 10 min. Un dd 2 ml d'une solution à 5% de BSA dans du PBS (pH 7,4) au mélange et émulsionner doucement à la température ambiante pendant 15 minutes afin de réduire les interférences de fond.
4. Centrifuger le mélange à 10.000 xg pendant 30 min à 4 ° C.
5. Retirer le surnageant avec un anticorps non conjugué et soigneusement en suspension les culots obtenus dans 4 ml de PBST contenant 1% de BSA et 0,1% de Tween 20, et de répéter la centrifugation et de suspension à plusieurs reprises.
6. Suspendre les précipités finaux dans 1 ml de PBST et de le stocker à 4 ° C jusqu'à utilisation.

7. Construction d'Immune Strip

Remarque: La figure 1 montre la conception de la bande immunitaire. Préparer et assembler les bandes dans un laboratoire état environnemental faible humidité (<20% d'humidité relative) pour la durée de conservation prolongée (> 1 an). Les dimensions des plaquettes et de la membrane sont: conjugué pad 300 mm x 10 mm, tampon absorbant 300 mm x 24 mm, pad d'échantillon de 300 mm x 24 mm, NC membrane 300 mm x 25 mm, 300 pasteboardmm x 80 mm.

1. Ajouter colloïde solution d'or marqué mAb de l'étape 6.6 avec une micropipette pour saturer le tampon conjugué puis sécher à 37 ° C pendant 1 heure avant l'assemblage.
2. Distribuer l'antigène de capture d'anticorps monoclonal (500 pg / d'ml) sur la zone d'essai et de lapin anti-IgG de souris spécifique (500 ug / d'ml) sur la zone de contrôle pour détecter mAb sur la membrane NC en utilisant une pipette ou immunostrip imprimante. Maintenir la distance (> 5 mm) entre les deux zones pour éviter les interférences.
3. Coller le tampon conjugué, tampon absorbant et la membrane NC sur le carton avec du ruban adhésif double face.
   Remarque: Superposer les plots de chaque côté de la membrane NC d'environ 2 mm. la construction de la bande inappropriée entraînera un test incomplet.
4. Placez le tampon de l'échantillon sur le tampon conjugué (2 mm) et le coller sur la table de montage.
5. Créer de 6 mm de large bandes avec un coupe-papier. Emballer les bandes dans le sachet en feuille d'aluminium avec déshydratant, et les stocker à 4 ° C jusqu'à leur utilisation.

8. La réactivité croisée de test

1. Homogénéiser 0,03 g d'échantillon de muscle brut avec 1 ml de PBS (contenant 0,1% de BSA) dans un tube de 1,5 ml de centrifugeuse à l'aide d'un bâton de bambou ou d'une tige de meulage.
2. Maintenez la bande par l'extrémité opposée aux zones de test et de tremper la partie du tampon d'échantillon dans l'échantillon pendant 5-10 minutes et observer le résultat directement.
   1. Facultatif: Collectez 500 ul surnageant et le transférer dans un nouveau tube de centrifugeuse.
      Remarque: Cette étape est suggéré si le signal est pas évident lorsque la bande est directement trempé dans le surnageant.
3. Testez différents échantillons de muscle en triple.
   Note: Ici, nous avons testé le thon, le poulet, le phoque, 15 espèces de cétacés et 5 espèces de mammifères terrestres.
4. Avoir cinq inspecteurs indépendants répètent 8.3 pour cinq fois, à savoir, utiliser 575 bandes au total.

Résultats

Caractéristiques des anticorps monoclonaux

Nous avons développé deux IgG ₁ mAb (CGF5H9 et CSF1H13) reconnaissant deux peptides synthétiques (MKASEDLKKHGNTVLC et AIIHVLHSRHPAEFGC), respectivement, de cétacé Mb, et ceux - ci ont été utilisés pour construire un or colloïdal bande de test immunochromatographique de type sandwich pour la détection rapide de Mb cétacé. la figure 2 montre que CGF5H9 détecte cétacés et autres mammifères c...

Discussion

En utilisant un peptide synthétique conjugué à la protéine porteuse est remarquablement plus efficace par rapport à sa protéine apparentée. Pour une technique fondée sandwich, parce que l'anticorps monoclonal est développé en utilisant des épitopes avec des emplacements relatifs connus, les deux mAb dans cette étude ne sont pas susceptibles d'interférer avec l'interaction mutuelle avec l'épitope de l'antigène cible. En outre, la réactivité entre la protéine native et l'anticorps de souris immunis...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Saline tamponnée au phosphate	AMRESCO	J373
Protéine G HP SpinTrap  ;	GE  ; Healthcare	28-9031-34	Colonne de spin contenant la protéine G Sepharose
IsoStrip Kit d’isotypage d’anticorps monoclonaux de souris	Roche	11493027001	Strips d’isotypage, pré-enrobés d’anticorps anti-Ig de souris spécifiques à la sous-classe et à la chaîne légère
Mini Trans-Blot	Bio-Rad	170-3935
Membrane nitrocellulosique	Whatman	Z613630
Anticorps solution bloquante  ;	LTK BioLaboratories		Pour minimiser les interactions de liaison non spécifiques des IgG non spécifiques dans les échantillons
substrat de la phosphatase BCIP/NBT.	KPL	50-81-00
Détecteur de protéines HRP Microwell Kit, Anti-souris	KPL	54-62-18
Nunc Immunoplate MaxiSorp Plaque ELISA Thermo	; Fisher Scientific	EW-01928-08
Multiskan  ; Lecteur EX ELISA  ;	Thermo  ; Électron  ; Solution	d’or
	REGA biotechnologie inc.		40-50 nm est approprié pour l’immunostrip
Albumine sérique bovine	Gibco	15561-020
Test rapide imprimante immno-strip	REGA biotechnology Inc.	AGISMART RP-1000  ;	Convient uniquement à la production à petite échelle d’immunostrips à des fins de recherche et développement
Composants de bande (membranes CN, tampons d’échantillons (verre #33, S& S), coussinets conjugués (#16S, S& S) et des tampons absorbants (CF6, Whatman))	REGA biotechnology Inc.
Freund' s adjuvant et incomplet Freund' s adjuvant  ;	Sigma-Aldrich	F5881, F5506	Utilisé pour produire des émulsions eau-dans-huile d’immunogènes
Acrylamide, tampon de gel, persulfate d’ammonium (APS), tétraméthyléthylènediamine (TEMED)  ;	Préparation de gel Protech		pour SDS-PAGE
Coomassie bleu brillant R-250	Bio-Rad	1610436	Coloration des protéines dans les gels SDS-PAGE
le tampon d’échantillon Laemmli et le 1610737 de &bêta ;-mercaptoéthanol	Bio-Rad	, 1610710	Diluer les échantillons de protéines avant le chargement sur les gels SDS-PAGE