Imagerie en temps réel des plantes Dynamics de surface cellulaire avec angle variable épifluorescence Microscopie

Summary

L'objectif de ce protocole est de démontrer comment surveiller la dynamique des protéines étiquetées par fluorescence sur des surfaces de cellules végétales avec angle variable épifluorescence microscopie, montrant clignoter points de GFP-tagged PATR1, une protéine de trafic membranaire, dans le cortex cellulaire du complexe stomatique dans Arabidopsis thaliana.

Abstract

La surface cellulaire d’une plante est son interface pour percevoir les signaux environnementaux ; elle répond par des changements biologiques cellulaires tels que le trafic membranaire et le réarrangement cytosquelettique. L’analyse d’images en temps réel et à haute résolution de ces événements intracellulaires augmentera la compréhension de la biologie des cellules végétales au niveau moléculaire. La microscopie à épifluorescence à angle variable (VAEM) est une technique émergente qui fournit des images en accéléré de haute qualité de protéines marquées par fluorescence à la surface des cellules végétales. Dans cet article, les procédures pratiques sont décrites pour la préparation des échantillons VAEM, le réglage du système optique VAEM, la capture vidéo et l’analyse d’images. A titre d’exemple d’observation VAEM, des résultats représentatifs sont présentés sur la dynamique des PATROL1. Il s’agit d’une protéine essentielle au mouvement des stomates, dont on pense qu’elle est impliquée dans l’administration de la pompe à protons aux membranes plasmiques dans le complexe stomatique d’Arabidopsis thaliana. L’observation en temps réel des cellules de garde et des cellules subsidiaires dans les cotylédons d’A. thaliana a montré que les PATROL1 marquées par fluorescence apparaissaient sous forme de structures en forme de points sur les membranes plasmiques pendant plusieurs secondes, puis disparaissaient. L’analyse kymographe des données de films VAEM a déterminé la distribution temporelle de la présence (appelée « temps de séjour ») des structures en forme de points. L’utilisation de VAEM est abordée dans le contexte de cet exemple.

Introduction

La surface de la cellule végétale, y compris la membrane plasmique et son cytoplasme immédiatement adjacent, est la principale région de la perception d’une cellule végétale et l’intégration des signaux biotiques et abiotiques de l’environnement extracellulaire. En réponse à ces signaux, les composants de surface cellulaire, y compris les protéines de la membrane plasmique et le cytosquelette cortical, subissent des changements dynamiques, sur une échelle de temps allant de quelques secondes à^{1 à 4} minutes. Ainsi, l’imagerie en temps réel et à haute résolution des protéines fluorescentes à la surface des cellules peut éclairer les réponses d’une plante aux signaux environnementaux au niveau moléculaire.

La microscopie confocale à balayage laser est un outil puissant pour la détermination de la localisation des protéines marquées par fluorescence³, cependant, il est souvent difficile de surveiller la dynamique des protéines en temps réel en raison de ses temps de capture relativement longs. Une technique émergente pour la surveillance en temps réel des protéines dans la cellule végétale est la microscopie à épifluorescence à angle variable (VAEM), qui est une adaptation de l’équipement habituellement utilisé pour la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF). En microscopie TIRF, la source lumineuse d’excitation de fluorescence est un champ lumineux évanescent qui est généré lorsque l’angle d’entrée du laser est suffisamment faible pour réfléchir totalement la lumière à l’intérieur de l’interface verre-eau. La profondeur de pénétration du champ lumineux évanescent est d’environ 100 nm. La microscopie TIRF est un outil exceptionnel pour l’imagerie de molécules uniques, comme la détection de l’exocytose dans les cellules animales⁵. Cependant, la lumière évanescente ne peut pas atteindre les membranes plasmiques ou le cytoplasme cortical des cellules végétales, car elles ont des parois cellulaires épaisses. Récemment, l’équipement de microscopie TIRF a été adapté par des biologistes des cellules végétales, observant qu’un laser, s’il est légèrement plus incliné que lorsqu’il est utilisé pour induire des phénomènes de réflexion interne totale, pourrait exciter la surface des échantillons de cellules végétales, ce qui permet d’obtenir une imagerie cellulaire végétale de haute qualité^6,7. La profondeur d’éclairage d’excitation est modifiée en ajustant l’angle d’entrée du laser ; par conséquent, cette technique est décrite comme VAEM. Ce système optique est également appelé microscopie TIRF à angle variable (VA-TIRFM) car il est possible qu’une réflexion totale puisse avoir lieu à l’interface paroi-périplasme⁷, cependant, le terme VAEM est utilisé dans cet article, selon le premier rapport dans les plantes⁶.

L’objectif de ce protocole est de démontrer des procédures pratiques d’utilisation de VAEM pour visualiser la dynamique des protéines marquées par fluorescence à la surface des cellules végétales. De plus, un protocole d’analyse d’images permettant de quantifier le temps de séjour (durée de présence) des molécules est décrit pour l’analyse de films VAEM. Le clignotement du point GFP-PATROL1 sur les cellules du complexe stomatique dans les cotylédons d’Arabidopsis thaliana est utilisé comme exemple. PATROL1 a été identifié par des approches génétiques directes comme un gène causal d’un défaut de réponse stomatique mutant chez A. thaliana⁸. PATROL1 est un homologue végétal de MUNC-13, qui est un facteur d’amorçage dans l’exocytose de la vésicule^{synaptique 8}. En réponse à des signaux environnementaux, tels que la lumière ou l’humidité, on pense que PATROL1 régule de manière réversible l’administration d’une pompe à protons aux membranes plasmiques du complexe stomatique. Les complexes stomatiques comprennent chacun une paire de cellules de garde⁸ et de cellules subsidiaires⁹, et ils nécessitent une pompe à protons pour le mouvement stomatique. Dans ces cellules, les PATROL1 marquées à la GFP se localisent dans des structures pointillaires qui restent sur la membrane plasmique pendant moins de 1 min⁹.

Protocol

1. Préparation de semis

1. Stériliser les graines.
   1. Préparer la solution de stérilisation en ajoutant 500 ul de NaClO (chlore disponible: 5,0%) et 1 ul de 10% de Triton X-100 à 500 pi d'eau stérile.
   2. Lieu ca. 10 transgénique A. thaliana graines transportant GFP-PATR1 ⁸ dans un tube de 1,5 ml.
   3. Ajouter une solution d'éthanol 1 ml de 70%, et bien mélanger en inversant cinq fois. Laissez pendant 1 min.
   4. Observer les graines tombent au fond du tube. Dans une hotte à flux laminaire propre, retirez délicatement l'éthanol à 70% à l'aide d'une micropipette, et ajouter 1 ml de solution de stérilisation. Mélangez bien en inversant cinq fois et laisser reposer pendant 5 min.
   5. Laver les graines. Je travaille toujours dans des conditions aseptiques sur un banc propre, retirez délicatement la solution à l'aide d'une micropipette, et ajouter 1 ml d'eau stérile. Répétez cette opération cinq fois. Les graines stérilisées peuvent être stockés dans de l'eau stérile à 4 ° C pendant 2 jours.
2. Ainsiw les graines stérilisées sur une augmentation de 0,5% de gomme de gellane solidifié 1/2 Murashige et Skoog plaque de milieu (pH 5,8) ^9. Tape le couvercle sur la plaque à l'aide de deux couches de ruban adhésif chirurgical.
3. Incuber la plaque à l'obscurité à 4 ° C avec une chambre de stockage à froid, O / N.
4. Transférer la plaque dans une chambre de croissance fixé à 23,5 ° C avec un cycle lumière-obscurité / 12 h-12 h en utilisant 100-pmol m ^{-2 s} -1 lumières blanches, et incuber pendant 7 jours. Les semis avec cotylédons d'environ 1 mm de long peuvent alors être récoltées.

2. Sky Goutte montage des spécimens Cotylédon

REMARQUE: Un facteur important dans la préparation des échantillons pour l'observation VAEM est d'éviter l'inclusion de bulles d'air entre l'échantillon et le verre de protection. Bubbles réduisent considérablement la qualité de l'image en VAEM provoquant des différences dans l'indice de réfraction. Une méthode simple, que nous avons appelé «chute de ciel» de montage, peut être utilisé pour éviter les bullesentre l'A. cotylédons thaliana et le verre de protection. Cela devrait être fait immédiatement avant l'observation.

1. Placer 30 ul de tampon de base de [5 mM de 2- (N-morpholino) -éthanesulfonique Tris-acide (MES-Tris) à pH 6,5, KCl 50 mM, _CaCl2 100 pM] sur le centre d'une lame de verre (taille: 76 × 26 mm, épaisseur: 1,0-1,2 mm).
2. Retirer les cotylédons d'un semis 7-day-old avec des ciseaux de dissection. Flotteur cotylédon avec la face d'observation tournée vers le haut sur ​​la chute de la mémoire tampon de base (figure 1, étape 1).
3. Placez 30 pi de tampon de base sur le centre d'un verre de couverture (taille: 18 × 18 mm, épaisseur: 0,12-0,17 mm) (figure 1, étape 2). Tournez le couvercle en verre à l'envers doucement. La tension superficielle empêche la chute de tampon de tomber. Tenez le couvercle en verre avec des pincettes sur un bord. Placez le bord opposé de la lame de verre de telle sorte que la chute de tampon est d'environ au-dessus du cotylédon.
4. Avec le bord du verre de couverture encore sur la diapositive, et tenant toujours le bord opposé avec des pincettes, ajuster la position de la chute de tampon sous le couvercle en verre de sorte qu'il est directement au-dessus de l'échantillon des cotylédons (figure 1, étape 3). Lâchez le couvercle en verre. Monter une goutte sur l'échantillon résultant à une préparation sans bulles d'air.
5. Essuyez l'excès de tampon en utilisant des tissus non pelucheux. Observez la préparation immédiatement (voir étape 3).
   NOTE: Il n'y a pas besoin pour sceller les échantillons.

3. VAEM Observation et Movie Acquisition

Remarque: Le système de microscope TIRF ⁹ utilisé dans la présente étude est décrite comme suit: Un microscope inversé est équipé d'une unité de TIRF et une lentille d'objectif TIRF avec une ouverture numérique de 1,49. Pour le contrôle informatisé de l'angle d'entrée de laser, une boîte de contrôle est utilisé. La protéine fluorescente verte (GFP) est excité avec un 488 nm à pompage optique laser semi-conducteur, et til fluorescence est détectée à travers un filtre passe-bande de 510 à 550 nm pour empêcher autofluorescence de chloroplastes. La valeur maximale mesurée de la puissance de sortie de la fibre est de 13,0 à 13,5 mW. Pour la détection, une multiplication d'électrons dispositif à couplage de charge (CCD-EM) système de tête de caméra et une unité C-mount changement caméra de grossissement sont utilisés.

1. Calibrer le laser de centrage et en se concentrant selon les instructions du fabricant.
   REMARQUE: Cette étape est cruciale pour les observations de VAEM précises. Il est fortement recommandé que des contrôles périodiques des procédures d'ajustement de chemin de laser, appropriée à votre microscope, sont effectuées.
   1. Déterminer la position centrale illuminée avec un chemin de lumière sans lentille objective sur le plafond de la salle de microscopie. Pour marquer la position centrale, mettre un joint de cercle de couleur sur le plafond (Figure 2, étape 1, 2).
   2. Éclairer le plafond avec une lentille d'objectif (figure 2, étape 3, 4). Déplacez le illuminated région de la position centrale (figure 2, étape 5). Concentrer le laser (Figure 2, étape 6). Peaufinez la position du laser focalisé au centre (Figure 2, étape 7).
2. Définir un échantillon sur la platine du microscope et de sélectionner des cellules d'observation en utilisant un éclairage à fond clair.
3. Vérifier que la protéine fluorescente peut être observé dans les cellules, et mis en la position de la z à la surface cellulaire en utilisant un éclairage à épifluorescence (figure 3A).
4. Effectuer des observations VAEM.
   1. Incliner l'angle du faisceau laser d'entrée progressivement avec le boîtier de commande. Dans le même temps, de surveiller attentivement l'image en direct. Initialement, l'image sera floue (figure 3B).
   2. Comme le laser angle augmente, l'image VAEM deviendra moins floue, éventuellement produire une image claire (figure 3C et D). À ce stade, arrêter Increachanter l'angle laser. Si le signal de fluorescence est perdue, pour diminuer un angle moins profond.
   3. Peaufinez l'angle d'entrée laser pour obtenir une meilleure image. Fine-tuning de la position de la z peut également améliorer l'image. Si nécessaire, ajuster les paramètres optiques (puissance de laser, longueur d'onde et de jeux de filtres) et des paramètres de capteur d'image [taille de l'image, le temps d'exposition, gain, numériseur et électrons multipliant (EM) Gain].
      Remarque: dans le cas de l'équipement de microscope TIRF décrit ci-dessus, les paramètres représentatifs sont les suivants. Grossissement de lentille juste en face de la caméra: 2X; Sortie laser: 1,0 mW; Taille de l'image: 512 x 512 pixels; Temps d'exposition: 100 ms; Gain: 5 ×; Digitizer: 11 MHz; et EM Gain: 100.
5. Acquérir un film comme un fichier image TIFF multi-page à l'aide du logiciel de microscope commerciale. Ici, le film est de points GFP marquée à clignoter sur la surface des cellules des stomates.
   REMARQUE: les conditions d'acquisition d'image représentatifs sont comme folbas. Mode d'acquisition: Stream RAM; Nombre de cadres: 600; et la taille multi-page du fichier TIFF: ~ 302 MB.

4. Analyse kymographe pour la quantification de la GFP marquée Dot Temps de résidence Utilisation Fidji Software

1. Installez Fidji (Fidji est Juste ImageJ ') ¹⁰ logiciels en utilisant les instructions des auteurs (http://fiji.sc/Fiji).
2. Exécutez Fidji et ouvrir le multi-page du fichier TIFF acquise en utilisant le menu Fidji "Fichier-Ouvrir".
3. Placez une ligne sur le site d'intérêt, en utilisant l'outil barre de menu Fidji outil "Sélection de droite". Eventuellement, utiliser l'outil "Sélection de ligne sectorielle» ou «Outil de sélection Freehand Line". Dans les résultats présentés ici, une ligne droite de 100 pixels (correspondant à 8,0 um) a été placée sur une cellule filiale (figure 4A).
4. Faire une image en utilisant le menu kymographe Fidji "Image-Piles-dynamique trancher de nouveau "(http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (figure 4B). Eventuellement, "Retourner verticalement" et "pivoter de 90 degrés" dans une fenêtre de case sont également disponibles (non utilisé dans les résultats présentés ici). X et Y-axe dans l'image de kymographe indiquent la position de la ligne (100 pixels correspondant à 8,0 um) et l'heure d'observation (600 pixels correspondant à 60 sec), respectivement. Si l'image de kymographe est pas satisfaisante, la position et le type (droite, segmentés et à main levée) de la ligne sur l'image multi-pages peuvent être modifiées. Comme les changements de ligne, l'image de kymographe change dynamiquement. enregistrer une image de kymographe comme un fichier TIFF en utilisant le menu Fidji "File-Save As-Tiff".
5. Mesurer la longueur de la goutte dans l'orientation de l'axe des temps.
   1. Pour effectuer la réduction du bruit, appliquer un filtre gaussien aux images kymographe en utilisant le menu Fidji "processus Filtres-Flou gaussien". Le «Sigma (Radius) "paramètre est accordable (1 rayon de pixel est utilisé pour les résultats présentés).
   2. Segment les régions de signal par un seuil, en utilisant le menu Fidji "Image-Adjust-Threshold".
      NOTE: Il ya plusieurs algorithmes de seuillage à choisir. Dans les résultats présentés, l'algorithme "Yen" a été choisi (figure 4C).
   3. Préparez-vous à mesurer le temps (y) -axis longueur du blob en utilisant le menu "Analyser Set-mesures". Cochez la case "rectangle englobant" dans la fenêtre "Set Mesures". Idéalement, l'ensemble de la zone doit être aussi petit que possible, d'exclure le bruit. Ici, la superficie minimale a été fixée à 50 pixels. Mesurer le temps (y) -axis longueur du blob en utilisant le menu "Analyze-analyser des particules". Pour obtenir les valeurs de résultat et de prouver la crédibilité des régions de mesure, vérifier les «Résultats» et «Ajouter au Gestionnaire </ em> "boîtes.
   4. Les valeurs dans la colonne «Hauteur» sont le temps (y) axe des x longueurs pour le blob mesurée (Figure 4D). Enregistrer les valeurs en utilisant le menu de la table des résultats "File-Save As» et de calculer et de traiter l'ensemble de données de durées d'image de blob en utilisant un logiciel d'analyse statistique et / ou d'un tableur (figure 4E).

Results

Dans cet article, de la vidéo, les protocoles d'observation VAEM de GFP-PATR1 dans A. cellules complexes thaliana cotylédons stomates sont fournis. Montage de chute de Sky est une méthode de préparation simple qui peut aider à réduire l'apparition de bulles d'air dans les préparations VAEM de A. cotylédons thaliana (Figure 1). Une inclinaison trop importante du laser d'entrée et / ou z-positionnement des spécimens pour VAEM fournira une image claire. Si cela se produi...

Discussion

Dans cet article, de vidéo, les protocoles sont donnés pour surveiller et mesurer le comportement dynamique des points GFP-PATR1 sur le complexe stomatique de Arabidopsis thaliana. Comme indiqué ici, l'observation VAEM est un outil puissant pour l'imagerie en direct de la surface des cellules de la plante. Dans les conditions expérimentales utilisées ici pour la surveillance GFP-PATR1, il y avait très peu de photoblanchiment de fluorescence dans l'échantillon utilisé pendant 1 min de capture vidéo, ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope inversé	Olympus	IX-73
Unité TIRF	Objectif Olympus	IX3-RFAEVAW
TIRF  ;	Olympus	UAPON 100 & fois ; OTIRF  ;	NA = 1,49
Boîtier de contrôle d’angle laser	Chuo Seiki	QT-AK
Laser semi-conducteur à pompage optique	Saphir	TM LP USB 488-20 CDRH Laser
510&ndash ; Filtre passe-bande 550 nm	Olympus	U-FBNA
EM Caméra CCD	Hamamatsu Photonics	ImagEM C9100-13
Unité de changement de grossissement de la caméra à monture C  ;	Logiciel Olympus	U-TVCAC
MetaMorph	Dispositifs moléculaires	MetaMorph version 7.7.11.0
Manuel de microscopie TIRF	Olympus	AX7385	Instructions : Système d’éclairage par réflexion interne totale (imprimé au Japon le 24 août 2012)
Huile d’immersion Huile d’immersion	Olympus	Typr-F	ne = 1,518 (23 degrés)