Article de méthode

Une expression efficace de cellules de mammifères et en une seule étape de purification extracellulaire glycoprotéines à la cristallisation

DOI :

10.3791/53445

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23 décembre 2015

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1Molecular Microbiology and Microbial Pathogenesis Program, Washington University School of Medicine, 2Department of Internal Medicine, Washington University School of Medicine, 3Drug Discovery Program in Pulmonary and Critical Care Medicine, Washington University School of Medicine, 4Biochemistry Program, Washington University School of Medicine, 5Center for the Investigation of Membrane Excitability Diseases, Washington University School of Medicine, 6Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, 7Department of Cell Biology and Physiology, Washington University School of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Il s’agit d’un protocole rapide et rentable pour la production de protéines de mammifères glycosylées sécrétées et la purification ultérieure en une seule étape avec des rendements suffisants de protéines homogènes pour la cristallographie aux rayons X et d’autres études biophysiques.

Résumé

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La production de protéines de mammifères sécrétées pour les études structurales et biophysiques peut être difficile, longue et coûteuse. Voici un protocole rapide et économique pour l’expression des protéines sécrétées dans les cellules de mammifères et la purification en une étape à l’aide de la chromatographie d’affinité du nickel. Le système est basé sur la transfection transitoire à grande échelle de cellules de mammifères en suspension, ce qui réduit considérablement le temps de production de protéines, car il élimine des étapes, telles que le développement de virus d’expression ou la génération de lignées cellulaires d’expression stables. Ce protocole utilise des agents de transfection bon marché, qui peuvent être facilement fabriqués par une simple modification chimique, ou des agents de transfection à prix modéré, qui augmentent le rendement grâce à une efficacité de transfection accrue et à une cytotoxicité réduite. Une surveillance attentive et le maintien de la glycémie dans les milieux augmentent le rendement en protéines. Le contrôle de la maturation des glycanes natifs à l’étape d’expression augmente le rendement final de protéines de mammifères correctement repliées et fonctionnelles, qui sont des propriétés idéales pour poursuivre la cristallographie aux rayons X. Dans certains cas, la purification en une seule étape produit des protéines d’une pureté suffisante pour la cristallisation, ce qui est démontré ici à titre d’exemple.

Introduction

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Comprendre la structure des protéines à un niveau atomique est clé pour découvrir la base moléculaire des voies biologiques et de maladies. X-ray cristallographie des protéines est la méthode la plus largement utilisée / applicable pour la détermination des structures macromoléculaires. Le principal défi de cette méthode est d'obtenir des quantités suffisantes de bien plié, protéine pure. Cela devient un problème particulier lorsque l'on travaille avec des protéines sécrétées mammifères, qui subissent des modifications post-traductionnelles spécifiques.

Protéines bactérienne exprimées sont la principale source de protéines cristal....

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Protocole

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1. production de quantités milligramme d'ADN plasmidique à grande échelle pour la transfection transitoire

  1. Cloner la protéine d'intérêt dans un certain nombre vecteur d'expression mammifère élevé de copies en utilisant le site de restriction clonage, ou une autre technique appropriée.
    1. Pour des résultats optimaux, utilisez pHLsec 7 vecteur, qui a un haut-C-terminal 6His-tag, une séquence forte Kozak promoteur et un signal de sécrétion optimisé.
  2. Transformer le plasmide sur des cellules compétentes.
    1. Ajouter 20 ul de cellules compétentes de E. coli sur 1 ug d'ADN de plasmide et incuber sur de la ....

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Résultats

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Ici suit les résultats de ce système d'expression appliquée à une immunoglobuline sécrétée 13 kDa (Ig) le domaine de récepteur de protéine humaine exprimée de déclenchement sur les cellules myéloïdes (2, résidus 19-132 hTREM2). TREM2 est une protéine transmembranaire de type I contenant un seul domaine de type Ig extracellulaire qui dispose de deux ponts disulfure et deux sites de glycosylation N-liés. Contrairement à de nombreux autres domaines Ig protéines 8, TREM2 ne se prêtaient pas à repliement des c.......

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Discussion

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Cellules HEK 293F offrent une forte production de protéines nécessitant modifications post-traductionnelles. Ce système permet l'expression rapide et évolutive des protéines pliées contenant nativement disulfures, la glycosylation, la phosphorylation et qui, autrement, être absent en utilisant plus d'outils d'expression de routine. En outre, ce système peut être utilisé pour l'expression et la purification de complexes multi-protéines simplement par co-transfection de plusieurs plasmides. Outre TREM2, ce.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par NIH R01-HL119813 (à T.J.B.), L’American Lung Association RG-196051 (à T.J.B.), une subvention pilote et de faisabilité CIMED (à T.J.B.), les bourses prédoctorales 14PRE19970008 de l’American Heart Association (à Z.Y.) et 15PRE22110004 (à D.L.K.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Flacons de cultureGeneMateF-5909B
293 Freestyle MediaGibco/Life Technologies12338-018
GlutaMAXGibco/Life Technologies35050-061À utiliser à la place du
réactif de transfection Glutamine Hype 5Oz BiosciencesHY01500
293réactif de transfection de fectineLife Technologies
réactif de transfection PEISigma-Aldrich408727
Maxiprep KitQiagen12162
Ni-NTA Superflow  ;Qiagen30430
Endo HfNEBP0703L
Résine d’amyloseNEBE8021S
Cell Boost R05.2HyCloneSH30584.02Supplément de culture cellulaire
GlucCellCESCO BioengineeringDG2032Système de surveillance du glucose
Opti-MEMLife Technologies519850.91Milieu sans sérum pour la transfection de l’ADN
Luria Broth (LB Media)Life Technologies10855-001
GC10 Cellules compétentesSigma-AldrichG2919
12347019

Références

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  1. Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674(2013).
  2. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15

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Mots-clés

Chromatographie d affinit au nickeltransfection transitoirepurification de prot inesmaturation des glycanessuivi de la viabilit cellulairecontr le du glucose du milieucristallisation des prot ines

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