Article de méthode

Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

DOI :

10.3791/53456

⸱

2 avril 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Neuronal Cell Biology, Technische Universität München, 2Cell Biology, Department of Biology, Faculty of Science, Utrecht University, 3Faculty of Biology, Ludwig-Maximilians-Universität-München, 4Adolf-Butenandt-Institute, Biochemistry, Ludwig-Maximilians-Universität-München, 5German Center for Neurodegenerative Diseases, 6Laboratory of Brain Development and Repair, The Rockefeller University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’imagerie du comportement dynamique des organites et d’autres structures subcellulaires in vivo peut faire la lumière sur leur fonction dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ici, nous présentons des méthodes de marquage génétique de deux organites, les centrosomes et les mitochondries, et d’imagerie de leur dynamique dans des embryons de poisson-zèbre vivants à l’aide de la microscopie à grand champ et confocale.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’imagerie in vivo offre un accès sans précédent au comportement dynamique des structures cellulaires et subcellulaires dans leur contexte naturel. La réalisation de telles expériences d’imagerie chez des vertébrés supérieurs tels que les mammifères nécessite généralement un accès chirurgical au système étudié. L’accessibilité optique des poissons-zèbres embryonnaires et larvaires permet de contourner ces procédures invasives et permet l’imagerie dans l’organisme intact. En effet, le poisson-zèbre est maintenant un modèle bien établi pour visualiser les comportements cellulaires dynamiques à l’aide de la microscopie in vivo dans un large éventail de contextes de développement, de la prolifération à la migration et à la différenciation. Un développement plus récent est l’utilisation croissante du poisson-zèbre pour étudier les événements subcellulaires, y compris le trafic mitochondrial et la dynamique des centrosomes. La relative facilité avec laquelle ces structures subcellulaires peuvent être marquées génétiquement par des protéines fluorescentes et l’utilisation de techniques de microscopie optique pour les imager transforment le poisson-zèbre en un modèle in vivo de biologie cellulaire. Nous décrivons ici des méthodes permettant de générer des constructions génétiques qui marquent des organites par fluorescence, en mettant en évidence les mitochondries et les centrosomes comme exemples spécifiques. Nous utilisons le système bipartite Gal4-UAS dans plusieurs configurations pour restreindre l’expression à des types de cellules spécifiques et fournir des protocoles pour générer des poissons transgéniques stables et exprimant transitoirement. Enfin, nous fournissons des lignes directrices pour choisir les méthodes de microscopie optique les plus appropriées pour l’imagerie de la dynamique subcellulaire.

Introduction

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L'imagerie in vivo fournit une visualisation directe des comportements cellulaires dans le contexte le plus physiologique. La transparence des embryons de poisson zèbre, leur développement rapide et externe et un riche éventail d'outils génétiques qui permettent l' étiquetage fluorescent ont tous contribué à l'utilisation croissante de la microscopie in vivo pour élucider la dynamique des événements clés du développement. Les études d'imagerie de développement du système nerveux chez le poisson zèbre ont par exemple considérablement élargi notre connaissance du comportement des cellules progénitrices neurales et le sort de leur progéniture , y compris leur migration ultérieure, la différenciation et l' intégration du circuit 1-8.

Le décor est désormais planté pour étudier la dynamique subcellulaire qui sous-tendent ces comportements cellulaires. En effet, le poisson zèbre sont déjà exploitées comme des outils pour in vivo la biologie cellulaire. Il est maintenant possible de visualiser les mitochondries 9-11, centrosomes 2,8,12-14, Golgi 15Le cytosquelette d' actine et microtubules 4 16, 17 endosomes et les composants de la membrane apicale complexe 1,18, entre autres structures sous - cellulaires dans les embryons de poisson zèbre in vivo. Jusqu'à présent, une grande partie de ce qui est connu sur la fonction de ces organites vient d'étudier leur comportement dans les cellules cultivées. Bien que des études in vitro ont donné un remarquable aperçu de la biologie cellulaire, les cellules en culture ne représentent pas pleinement la complexité de la situation in vivo et ne reflètent donc pas nécessairement la fonction et la dynamique des organites intracellulaires in vivo. Embryons de poisson zèbre offrent une solution viable en alternative vivo d'étudier la dynamique subcellulaire.

Comme les vertébrés, le poisson - zèbre possède de nombreux systèmes d'organes (par exemple, la rétine neurale) qui sont homologues à celles trouvées chez les espèces de mammifères. En outre, les embryons de poisson zèbre sont de plus en plus utilisés pour modéliser les maladies humaines 19,20 , y compris ceux qui sont liés à la fonction centrosomale (par exemple, microcéphalie 21 et amaurose 22 congénitale de Leber) et de la fonction mitochondriale (par exemple, la maladie de Parkinson 23, tauopathies 10,24 et le syndrome de Barth 25). imagerie in vivo au niveau cellulaire et subcellulaire dans ces cas, permettra une meilleure compréhension de la biologie des cellules sous-jacentes de ces états pathologiques.

L'objectif général des méthodes décrites ici est de fournir un guide complet pour enquêter sur les organites et d' autres structures subcellulaires dans les embryons de poisson zèbre en utilisant la microscopie optique in vivo. L'ensemble du flux de travail impliqués dans la visualisation et le suivi des structures intracellulaires in vivo est décrit - des approches d'étiquetage génétiques, de générer transitoirement exprimer et de poissons transgéniques stables, et enfin à l' imagerie utilisant grand champ et la microscopie confocale. Bien que chacun de ces procedures est utilisé par de nombreux laboratoires de poisson zèbre, les protocoles décrits sont optimisés et rationalisés pour étudier la dynamique des structures subcellulaires. Deux aspects spécifiques des travaux décrits ici méritent mention: Tout d'abord, l'utilisation du système d'expression Gal4-UAS dans de multiples configurations pour génétiquement organites d'étiquettes dans types cellulaires spécifiques. Deuxièmement, une comparaison directe de grand champ et la microscopie confocale à des structures subcellulaires d'image in vivo.

Les stratégies actuelles pour modifier génétiquement des organites d'étiquettes et autres structures sous - cellulaires chez le poisson zèbre , soit utiliser des ARNm coiffés 1,4,8 ou des constructions d'ADN sur la base , où les éléments promoteurs entraînent directement l'expression des protéines de fusion 9,14,15 transcrit in vitro coiffé résultats d'ARN in. rapide et large expression, ce n'est pas spécifique du tissu cependant. En outre, les niveaux d'expression diminuent au fil du temps que l'ARN coiffé est dilué ou dégradé. Ainsi, l'utilisation d'ARN à base deconstruit pour examiner la dynamique des organites à des stades ultérieurs de développement est limitée (généralement jusqu'à 3 jours après la fécondation).

Ces limitations peuvent être surmontées en utilisant des constructions d'ADN, où le contrôle spatial et temporel d'expression est déterminé par des éléments spécifiques du promoteur. Quand les constructions d'ADN sur la base sont utilisés dans le contexte du système Gal4-UAS des améliorations significatives des niveaux d'expression du transgène sont observées 26,27. Dans ce système d'expression bipartite éléments promoteurs spécifiques du type cellulaire conduisent l'expression d'un activateur de transcription de Gal4, tandis que les gènes rapporteurs sont clonés en aval de la séquence d'activation en amont Gal4 de liaison (UAS). En combinant UAS journalistes avec les pilotes Gal4 appropriés, l'expression peut être limitée aux types cellulaires spécifiques, contourner la nécessité de cloner des gènes rapporteurs derrière des promoteurs différents à chaque fois un motif d'expression spécifique est souhaitée. En outre, l'expression de multiples gènes rapporteurs UAS peut êtreentraînés par un seul activateur de Gal4. Le système Gal4-UAS fournit donc une approche génétique polyvalent et flexible pour l'étiquetage subcellulaire.

Grand champ et microscopes confocaux sont les chevaux de bataille de la plupart des laboratoires. Les systèmes à grand champ utilisent généralement une lampe à arc en tant que source de lumière et détecter la lumière émise par une caméra sensible qui est placé à l'extrémité du trajet lumineux. Cette modalité d'imagerie est généralement limitée à des échantillons minces comme hors de la lumière de mise au point obscurcit les informations de mise au point dans des échantillons plus épais. Microscopes confocale diffèrent des systèmes à champ large en ce qu'ils sont construits pour favoriser les signaux qui proviennent du plan focal par rapport à ceux qui sont originaires de mise au point ( par exemple, «sectionnement optique») 28. Pour réaliser un sectionnement optique à sténopé est placée dans le chemin d'émission dans une position conjuguée à la source de lumière ponctuelle. Les lasers sont utilisés en tant que sources de lumière et les signaux sont détectés avec des tubes photomultiplicateurs (PMT). Pratiquement, un laserfaisceau est glissée sur l'échantillon point par point et l'émission de fluorescence à chaque point (pixel) est détecté par le PMT.

Ici, nous l'image les mêmes structures subcellulaires dans la vie des embryons de poisson zèbre utilisant à la fois grand champ et la microscopie confocale pour fournir une comparaison directe des deux modalités de microscopie. L'objectif sous-jacent de fournir de telles comparaisons est d'offrir des lignes directrices pour le choix technique de microscopie la plus appropriée pour la question spécifique à portée de main.

En utilisant les approches décrites ici, nous démontrons Gal4-UAS étiquetage génétique basée des mitochondries et centrosomes. Ces organites sont imagés dans différents types de cellules du système nerveux et dans les cellules musculaires en utilisant grand champ et la microscopie confocale à démontrer la pertinence de chaque modalité d'imagerie. Les méthodes décrites ici peuvent être facilement adaptés pour enquêter sur d'autres organites et des structures subcellulaires dans l'embryon de poisson zèbre vivant.

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Protocole

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Toutes les expériences animales ont été réalisées conformément aux réglementations locales du gouvernement de Haute-Bavière (Munich, Allemagne).

1. Étiquetage Organelles et autres structures subcellulaires

NOTE: Ici journaliste génétique construit cette balise centrosomes fluorescence, les mitochondries et les membranes cellulaires sont décrites.

  1. Utiliser des méthodes classiques de clonage 29 pour générer des protéines de fusion qui étiquettent fluorescence centrosomes et les mitochondries. Cloner la séquence codante de centrin4 poisson zèbre (de cetn4) dans le cadre avec une protéine fluorescente 2 (FP) , tels que la protéine fluorescente jaune pour générer cetn4-YFP. Cloner la séquence d'adressage mitochondrial de la sous - unité VIII de la cytochrome c oxydase dans le cadre avec un FP comme la protéine fluorescente cyan pour générer mitoCFP 11/09.
  2. Pour limiter l'expression des protéines de fusion (cetn4-YFP ou mitoCFP) à des cellules spécifiques du zebrafish embryon (par exemple , les neurones ou des cellules musculaires) utilisent le système d'expression Gal4-UAS bipartites 26,27. Tout d'abord générer une construction rapporteur UAS. Utiliser des méthodes classiques pour cloner la protéine de fusion dans un vecteur d'expression de la SAMU, en aval de la cassette UAS Gal4 de liaison (variantes vont de 1x à 14x UAS, voir Discussion) 26,27,30 et un promoteur minimal (E1b promoteur basale de la carpe βactin gène), et générer des UAS: cetn4-YFP et UAS: mitoCFP.
    NOTE: Pour préparer UAS reporter construit pour la génération de la lignée transgénique stable éléments supplémentaires doivent être clonée (voir 3 ci - dessous)
  3. Pour visualiser le contexte cellulaire dans lequel les centrosomes ou mitochondries sont marquées, de générer UAS produits de construction rapporteurs dans lequel les membranes cellulaires sont marquées par PCR. Cloner les vingt premiers acides aminés de poisson - zèbre GAP43 (contenant des sites de palmitoylation) dans le cadre avec un PF de cibler que FP sur la membrane cellulaire (memFP) 31,32.
  4. obten constructions de conducteur ou de lignes transgéniques dans lesquels des éléments promoteurs spécifiques du type cellulaire conduisent l'expression de l'activateur de transcription de Gal4-VP16 27, 33 ou Gal4FF KalTA4 30.
  5. Combinez le journaliste UAS construit avec une construction de pilote approprié pour restreindre l' expression du type de cellule d'intérêt souhaité (par exemple, dans les neurones ou des cellules musculaires). Pour ce faire , co-injection pilote Gal4 et UAS journaliste construit au stade d' une cellule d'œufs fécondés (pour obtenir des instructions détaillées , voir 2 ci - dessous) pour générer transitoirement exprimer poissons. Vous pouvez également générer un UAS reporter lignée transgénique stable (pour obtenir des instructions détaillées , voir 3 ci - dessous) et traverser à un pilote Gal4 lignée transgénique stable pour générer la progéniture portant deux transgènes.
    NOTE: Il est également possible d'injecter UAS construction rapporteur / s dans des œufs fécondés à partir d' un pilote Gal4 lignée transgénique stable ou un pilote Gal4 construire en fertilizoeufs ed d'un UAS reporter lignée transgénique stable.
  6. Pour co-exprimer plusieurs protéines de fusion distinctes utilisant le système Gal4-UAS, utilisez un pilote Gal4 et UAS reporter / s dans l' une des configurations suivantes: A. Multiple, constructions UAS rapporteurs distincts (par exemple, UAS: mitoCFP et UAS: memYFP co -injected avec un pilote Gal4 construction) 10, B. Plusieurs cassettes UAS sur un seul journaliste (par exemple, UAS: cetn4-YFP, UAS: memCerulean) 12 C. Journaliste bidirectionnel UAS (par exemple UAS: memYFP, mitoCFP) 2,10,24 (Figure 1).

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Figure 1. Stratégies pour co-exprimer des protéines de fusion en utilisant le système Gal4-UAS.
La co-expression de protéines de fusion multiples peut être réalisé en utilisant UAS cassettes rapporteurs dans différentes configurations: (A) multiple, const entraînée UAS séparéeructs, (B) plusieurs cassettes UAS sur une construction unique ou (C) une cassette UAS bidirectionnel sur une seule construction. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. Générer transitoirement Exprimer poisson

NOTE: Ce qui suit est une adaptation des protocoles déjà publiés 34,35. Une configuration de base d'injection devrait inclure un stéréomicroscope avec une gamme de grossissement jusqu'à 12x, un micromanipulateur avec un porte-micropipette et une source de pression d'air. Préparer 2,1-2,5 à l'avance:

  1. Pour préparer des œufs chambres de microinjection, de préparer une solution de 1,5% (p / v) d'agarose dans de l'eau. Ajouter la poudre d'agarose à l'eau et micro-ondes jusqu'à ce que l'agarose est complètement dissous. Remplir une boîte de Petri (100 x 15 mm) avec cette solution.
    1. Laisser la solution d'agarose refroidir à APPRoximately 45 o C avant de placer un moule en plastique de microinjection (40 mm x 66 mm, avec 6x 50 mm de long des crêtes qui sont de 1,5 mm de large, 1 mm de profondeur et espacées de 3 mm d' écart) sur la surface de l'agarose fondu, en prenant soin de ne pas introduire des bulles à l'interface.
    2. Après les ensembles d'agarose, conserver à 4 o CO / N. Retirez délicatement le moule à l'aide d'une spatule. Préparer plusieurs chambres de microinjection à la fois, conserver à 4 o C et utiliser de façon répétée sur plusieurs semaines.
  2. Utiliser un extracteur pour générer des micro - pipette d'injection capillaires en verre avec une longue tige 36.
    REMARQUE: Les paramètres spécifiques utilisés pour générer des capillaires d'injection doit être déterminée de manière empirique. capillaires d'injection peut être tiré à l'avance et stockés avant leur utilisation.
  3. Mesurer la concentration d'ADN plasmidique (pilote Gal4 et UAS constructions rapporteurs) pour microinjection en utilisant un spectrophotomètre selon le manuel du fabricant. Mesure60, le rapport de l'absorbance à 260 nm et 280 nm (A260 / 280). Diluer l'ADN jusqu'à une concentration finale de 100 ng / ul dans de l'eau sans nucléase.
    REMARQUE: Un A260 / 280 rapport de 1,8 ~ signifie l' ADN pur. Envisager l'utilisation d'un kit commercial (basé sur une matrice de liaison à base de silice) pour purifier l'ADN plasmidique à être utilisé pour l'injection. L'ADN plasmidique devrait être de haute qualité pour éviter la toxicité.
  4. Préparer 10 ul injection-mix en combinant l'ADN (0,5 à 2,5 pi de 100 ng / stock ul pour une concentration finale de 5 à 20 ng / ul), la solution de Danieau (0,33 pi de 30x stock), Phenol Red (0,25 pi, eau en option) et sans nucléase à un volume total de 10 pi.
    REMARQUE: déterminer empiriquement la concentration d'ADN qui donne l' expression appropriée. GAL4 UAS conducteur et plasmides rapporteurs ont besoin d'être co-injecté. Aucune expression résultera lorsque seul le pilote Gal4 ou UAS plasmide rapporteur est injecté dans de type sauvage œufs fécondés. Si, toutefois, til fécondé les œufs sont à partir d'une ligne de pilote Gal4 puis injection d'un ou plusieurs plasmides UAS rapporteurs suffit. Inversement, si microinjection en une ligne de journaliste UAS, seul le pilote plasmide Gal4 doit être injecté. Enfin, alors que Phénol Red peut grandement aider à visualiser les injections, il est également un composé fluorescent lui-même. Par conséquent, Phénol Red pourrait obscurcir MF visualisation si l'imagerie est prévue avant 24 heures après la fécondation (HPF), car il ne peut pas être suffisamment dilué par ce temps.
  5. Le soir, avant les injections sont prévues, mis en place plusieurs paires (typiquement de 5 à 10) mâle et femelle pour la reproduction du poisson zèbre. Utilisez bassins d'élevage avec un insert contenant un fond grillagé et un séparateur amovible pour séparer les poissons mâles et femelles.
    NOTE: Mâle et femelle zebrafish se distinguent généralement par leur forme du corps. Les mâles ont tendance à être minces alors que les femelles ont tendance à présenter une saillie de l'abdomen ventral. Les mâles ont tendance en outre d'avoir un col rouge-jaunâtreoring sur leur région abdominale ventrale.
  6. Immédiatement avant les injections d'ADN, retirer les diviseurs pour permettre le mâle et la femelle s'accoupler. Environ 15 à 30 minutes après avoir enlevé le diviseur, vérifier les oeufs au fond de la cuve. Transférez le poisson adulte en utilisant un filet de pêche à un nouveau réservoir d'élevage.
  7. Versez l'eau, contenant les œufs fécondés nouvellement établies, sur le réservoir d'élevage dans un tamis (par exemple, une passoire à thé en plastique). Lavez les oeufs dans le tamis à l'aide d'un flacon pulvérisateur contenant la solution de Danieau. Inversez le tamis sur une boîte de Pétri et utiliser un flacon pulvérisateur avec la solution de Danieau pour récupérer tous les oeufs (typiquement 50 à 200 œufs par reproduction paire de poissons adultes).
  8. En utilisant une pipette de microloader, back-remplir un capillaire d'injection tiré avec l'injection-mélange d'ADN. Monter le capillaire d'injection dans le support d'un micromanipulateur et couper la pointe, sous le contrôle visuel d'un stéréomicroscope, en utilisant une pince pour créer une micropipette qui peut penetrate le chorion et le cytoplasme des cellules tout en étant en mesure de livrer un volume approprié de l'ADN.
    NOTE: La mesure dans laquelle la pointe du capillaire d'injection est coupé doit être déterminée empiriquement et peuvent le mieux être jugé lors de l' injection des œufs.
  9. Pour déterminer le volume de l'ADN pour injection, décharger une goutte de la solution d'injection dans l'huile minérale. Mesurer le rayon (r) de la goutte à l' aide d' un micromètre d'étalonnage et de calculer le volume (03/04 π r 3). Moduler le volume en réglant la pression d'injection et / ou la durée de chaque impulsion d'injection.
  10. En utilisant une pipette en plastique, transférer tous les œufs collectés (typiquement 50-200, de 2.7 ci - dessus) dans les tranchées d'une chambre de microinjection. Sous le contrôle visuel d'un stéréomicroscope, utilisez une pince pour orienter les œufs de telle sorte que le cytoplasme cellulaire (transparent) et jaune (dense, non-transparent) peuvent être facilement identifiés.
  11. Sous le contrôle visuel d'une chaîne hi-fimicroscope, injecter de l'ADN dans le cytoplasme de la cellule de l'œuf fécondé, en prenant soin de faire en sorte que le volume injecté (1 à 2 nl) correspond à environ 10% du volume de la cellule.
    REMARQUE: Phénol rouge dans les aides à la solution d'ADN dans la visualisation du volume injecté.
  12. Après l'injection, desserrez les œufs des tranchées du moule d'injection en les rinçant avec un flacon pulvérisateur contenant la solution de Danieau. Transférer ensuite les oeufs dans une boîte de Pétri frais à l' aide d' une pipette de transfert en plastique et maintenir dans un 28,5 o C incubateur.
  13. Maintenir les oeufs un-injecté en tant que témoins pour déterminer si les injections contribuent à des taux élevés de mortalité, soit à la suite de dommages physiques subis lors de la pénétration de micropipette ou le mélange d'ADN.
    NOTE: Les taux élevés de mortalité après les injections pourraient être dues à de nombreux facteurs, y compris la concentration ou injection volumes excessivement élevé d' ADN et / ou plasmides avec contaminants. Afin d'éviter la toxicité de préparations d'ADN de faible qualité, des kits commerciaux (basés sur une matrice de liaison à base de silice) peuvent être utilisés.
  14. A intervalles réguliers suivants injections, utilisez un stéréomicroscope pour dépister les œufs non fécondés et les embryons morts ou malformés et jeter ceux-ci.
    NOTE: Deem les œufs qui semblent être au stade d' une cellule plusieurs heures après la fécondation, comme non fécondé. Identifier les embryons malformés par des défauts anatomiques bruts tels qu'un compromis axes du corps antérieur-postérieur. matériau amorphe dans un chorion suggère que l'embryon n'a pas eu lieu à travers les étapes de développement et il est mort. Pour déterminer si les embryons qui ont été microinjecté suivent un cours normal du développement consulter atlas anatomiques 37.
  15. Transférer les embryons à l'aide d'une pipette de transfert en plastique à la solution contenant Danieau 1x 1-phényl 2-thiourée (1xPTU) entre 10 et 24 hpf pour empêcher la formation de pigments. Maintenir les embryons en solution la suite de Danieauaining PTU pendant toute la durée de l'expérience.
    NOTE: En plus de mélanophores, iridophores sur la surface de la peau peut être problématique pour l' imagerie. Alors que PTU n'inhibe pas la formation iridophore, les lignées mutantes avec un nombre réduit de iridophores tels que orbison roy (roy) existent et peuvent être utilisés 38.
  16. Après les embryons éclosent (généralement sur le post-fécondation deuxième ou troisième jour, 2 ou 3 dpf), jeter les chorions et échanger la solution du Danieau contenant PTU.
    REMARQUE: Ces étapes sont importantes pour garantir la qualité du milieu d'embryon et de la viabilité des embryons sains.

3. Générer des lignées transgéniques stables

NOTE: Les lignées transgéniques stables peuvent être produites de manière efficace en utilisant le système de transposon Tol2. Un vecteur de transposon Tol2 contenant le transgène d'intérêt est co-injecté avec l'ARNm codant pour l'enzyme transposase dans fertiliserd oeufs au stade une cellule. Protéine transposase dérivé de l'ARNm injecté catalyse l'excision de la cassette de transgène à partir du vecteur de transposon et son intégration dans le génome 39.

  1. Cloner la cassette rapporteur du transgène (par exemple, UAS: mitoCFP) entre Tol2 répétitions terminales inversées dans l' un des vecteurs Tol2 actuellement utilisés dans la communauté zebrafish comme décrit 40.
    REMARQUE: Les vecteurs Tol2 contenant une cassette de sélection dans laquelle les éléments promoteurs dirigent l' expression de la PF dans les systèmes d'organes non reliés à la zone d'intérêt (par exemple, le coeur 41 ou de la lentille 42) sont utiles pour le criblage de lignées transgéniques UAS rapporteurs en l'absence de Gal4 transactivation.
  2. À l'aide d'un kit commercial (basé sur une matrice de liaison à base de silice), de purifier l'ADN plasmidique à être utilisé pour l'injection. Assurez-vous que l'ADN plasmidique est de haute qualité pour éviter la toxicité.
  3. Transcrire Tol2 ARNm transposase codant pour l'aide d'unvecteur de transcription approprié tel que PCS-TP 43. En bref, linéariser PCS-TP et d'utiliser un kit commercial pour générer plafonné ARNm et suivre le protocole du fabricant. Prenez soin d'éviter la contamination par des RNases (par exemple, utiliser RNase conseils et tubes pipettes). Aliquoter l'ARN, à une concentration de 100 ng / pl, à usage unique et conserver à -80 o C.
  4. Le matin des injections, dégeler une aliquote de transposase ARNm sur la glace. Mélanger le vecteur d'ADN de transposon (2 ul de 100 ng / ul) et transposase ARNm (2 ul de 100 ng / ul) dans un rapport 1: 1, et d'ajouter 6 ul d'eau sans RNase pour porter le volume total à 10 ul.
    Remarque: Une concentration de 20 ng / pl est recommandée pour chacun , mais la concentration optimale doit être déterminée de manière empirique. Utiliser de l'eau libre RNAse pour la dilution. Utiliser des gants lors de la manipulation du mélange d'injection ADN-ARN et le garder sur la glace pendant toute la période des injections pour prévenir la dégradation de la mL'ARN.
  5. En suivant les instructions détaillées dans la section 2 ci - dessus, injecter le mélange d'injection ADN-ARN dans des œufs fécondés au stade d' une cellule. Sous contrôle visuel d'un stéréomicroscope cibler le cytoplasme des cellules au stade une cellule pour les taux d'efficacité de la transgenèse les plus élevées. Maintenir les embryons injectés à 28,5 o C jusqu'au moment de l' écran pour l' expression du transgène.
    NOTE: PCR peut être fait pour vérifier l' efficacité de la transposase Tol2 comme décrit précédemment 44.
  6. embryons d'écran dans une boîte de Pétri pour la transgenèse utilisant les oculaires d'un microscope de fluorescence de dissection.
    REMARQUE: Utilisez les filtres appropriés du microscope pour visualiser FP expression de la cassette sélectionnable (ie, la fluorescence dans le coeur ou la lentille) à 2 ou 3 dpf. Identifier les embryons transgéniques potentiels par l' expression (dans le cœur ou la lentille) et soulever ces embryons à l' âge adulte (F 0 génération) en utilisant la normeprotocoles 45. Vous pouvez également identifier les embryons transgéniques potentiels par PCR comme décrit dans 46.
  7. Une fois que la SAMU journaliste F 0 poissons sont 2,5 - 3 mois d'âge, les traverser (voir 2.5 pour plus de détails) à la non-transgénique de type sauvage du poisson pour acquérir des œufs pour établir une génération F 1. Vous pouvez également traverser la SAMU journaliste F 0 poissons à une ligne de pilote Gal4 pour établir une génération F 1. Dans ce dernier cas, le transgène conduit UAS-peut être directement contrôlée dans les embryons obtenus à partir de la croix.
  8. Utiliser une fluorescence microscope à dissection pour cribler F 1 embryons pour l' expression du transgène ou d'une cassette sélectionnée.
    REMARQUE: Lorsque l' expression est confirmée alors le transgène peut être dit être germinale transmis. La transgenèse est non-mendélienne au stade F 0. Le nombre d'embryons exprimant le transgène peut varier d'un petit nombre à la grande majorité de Embrayages individuelles. L' intégration de transposon dans différents F 0 poissons peut varier considérablement, ce qui entraîne différents profils d'expression. Par conséquent , maintenir la F 1 des poissons de différentes F 0 fondateurs comme des sous-lignes séparées. Intégrations de transposons dans F 1 poissons sont stables et sont répercutés sur les générations suivantes de façon mendélienne.
  9. Maintenir chaque F 0 poissons dans des réservoirs séparés de ré-identifier les porteurs du transgène.

4. Préparer Embryons for Imaging sur un microscope droit

NOTE: Les procédures décrites ici ont été optimisés pour l' imagerie sur les microscopes verticaux avec des objectifs à long distance de travail d' eau par immersion-cône.

  1. Utilisez une fluorescence microscope de dissection pour dépister les embryons pour l'expression du transgène.
    NOTE: L' expression d'un journaliste transgène UAS dépendra de la ligne de pilote Gal4 spécifique utilisé. Sélectionnez embryons pour des expériences d'imagerie basées sur exp souhaitéemotif de ression.
  2. Transférer les embryons sélectionnés à l'aide d'une pipette en plastique pour une boîte de Pétri séparé contenant le tampon de Danieau avec 1x PTU et 1x Tricaine.
    REMARQUE: Lorsque l' étiquetage est rare (seulement quelques cellules dans un système d'organes) monter les embryons en agarose (voir 04.03 à 04.07 ci - dessous) et de l' écran pour l' expression du transgène à l' aide d' un microscope à champ large avec des objectifs à fort grossissement (voir 5.1 ci - dessous). Tricaine anesthetizes le poisson et devrait être effective en quelques secondes. Si les poissons ne sont pas immobilisés, il est probable que la tricaïne est dégradée. Les raisons possibles de cette dégradation comprennent un mauvais stockage des Tricaine, qui est sensible à la lumière 47.
  3. Préparer l'agarose à incorporer le poisson en dissolvant la poudre d'agarose à bas point de fusion dans le tampon de Danieau à une concentration finale de 0,7%. Aliquote (1 ml) et conserver dans un bloc thermique à 40 ° C jusqu'à utilisation.
    NOTE: concentrat supérieurions d'agarose (jusqu'à 1,5%) peut également être utilisé pour intégrer le poisson.
  4. Ajouter 50 pl d'un 20x stock d'Tricaine et 20 ul d'une solution 50x stock de PTU à l'aliquote de 1 ml d'agarose bas point de fusion et bien mélanger en appuyant sur le côté du tube. Remettre le tube au bloc thermique. En utilisant une pipette de transfert en plastique, pipette doucement quelques (1-10) embryons anesthésiés dans l'agarose, transfert aussi peu de liquide que possible afin d'éviter la dilution de l'agarose.
  5. Au moyen d'un transfert de pipette en plastique tous les embryons avec une petite quantité d'agarose dans un fond de verre boîte de Pétri.
  6. Travail relativement rapide, l'utilisation de pinces pour positionner les embryons dans l'orientation souhaitée, en fonction de la structure à imager.
    NOTE: les embryons Orient , de leur côté , si la rétine ou Rohon-Beard (RB) neurones sensoriels devraient être imagés.
  7. Permettre à l'agarose se solidifie pendant au moins 15 minutes. Ajouter le tampon de Danieau contenant 1xPTU et 1xTricaine pour couvrir les embryons intégrés dans agaroproprement parler. Placer le plat contenant des embryons d'agarose-intégré dans un incubateur à 28,5 o C jusqu'au moment de l' image.

5. Imagerie cellulaire et subcellulaire Structures utilisant grand champ ou microscopie confocale

REMARQUE: grand champ microscopique et point microscopie confocale à balayage sont les modalités les plus largement utilisés à l' image embryons de poisson zèbre marquées par fluorescence Le tableau 1 résume les principaux avantages et inconvénients des deux systèmes.. Pour les deux formes de microscopie, les embryons sont montés dans l' agarose , comme décrit dans 4 ci - dessus, et maintenue à 28,5 ° C pendant toute l'expérience d'imagerie en utilisant une chambre de chauffage sur la platine du microscope. Fait important, le plat avec des embryons d'agarose-intégré est autorisé à équilibrer à 28,5 o C avant l' imagerie commence que les fluctuations de température provoquent la dérive dans la dimension z. Lors de la réalisation des expériences d'imagerie à long terme (plus de several heures), placer un couvercle en plexiglas sur la boîte de Pétri pour réduire l'évaporation du tampon.

Grand champ Point de balayage confocal
Coût Relativement peu coûteux Cher (env. 5 fois plus)
Photo-blanchiment Faible Haute. L'échantillon est exposé à une lumière laser au-dessus et au-dessous du plan focal.
Photo-toxicité Faible High (voir la photo-blanchiment ci-dessus)
la vitesse d' acquisition Vite Lent
Résolution xy La loi de l'abbé La loi de Abbe (peut être améliorée par l'application de 40% en utilisant un très petit trou d'épingle;. Cependant,la plupart des paramètres cela a peu d'application pratique)
sectionnement optique Pauvre Oui (peut être ajustée selon la taille sténopé)
La pénétration tissulaire Limité à des structures superficielles (par exemple, Rohon-Beard cellules ou fibres musculaires) Limitée à <100 mm à partir de la surface de l'embryon

Tableau 1. Comparaison générale du grand champ et le point-microscopie confocale à balayage

  1. La microscopie à grand champ
    NOTE: Voici les lignes directrices sont fournies pour l' imagerie embryons de poisson zèbre en utilisant un microscope droit à grand champ avec des objectifs à long distance de travail d' eau par immersion-cône. Le microscope est équipé d'une caméra CCD refroidie, et des jeux de filtres pour visualiser des fluorophores différents monté sur une roue de filtres automatisé pour l'acquisition rapide de multiples canaux.L' acquisition des images est contrôlée par μManager, un progiciel de microscopie open source 48. Un exemple spécifique pour l'imagerie des mitochondries dans les neurones sensoriels RB est fourni. RB cellules sont génétiquement marquées à l' aide membrane YFP ciblée et leurs mitochondries sont CFP-marqués (voir 1.1 ci - dessus).
    1. Embryons de montage de leur côté à bas point de fusion d' agarose comme décrit dans 4 ci - dessus.
    2. Laisser le plat avec du poisson monté à équilibrer à 28,5 o C dans une chambre de chauffage sur la scène du microscope avant de commencer l' imagerie.
    3. Utilisez un objectif eau-trempage-cône faible grossissement et regarder à travers les oculaires du microscope pour choisir une zone sur la surface de l'embryon à l'image.
      NOTE: Si le transgénique ligne MitoFish rapporteur stable, Tg (UAS-E1b: mYFP, mitoCFP) mde6, est utilisé en conjonction avec une ligne de pilote tels que HuC: Gal4 alors les neurones les plus RB sont marqués, et apparaissent comme un mes densesh-travail de tonnelles de neurites sur la surface de l'embryon. Si la micro - injection de constructions d' ADN est utilisée pour réaliser l' étiquetage clairsemé (par exemple sensorielle: Gal4-VP16 avec SAMU: mitoCFP et SAMU: MA-YFP), les embryons d'écran afin d' identifier les cellules doublement marquées.
    4. Ouvrez le logiciel de microscope (μManager 1.4) et cliquez sur "Illumination '' sous la rubrique« Paramètres de configuration »pour définir les jeux de filtres appropriés pour la longueur d'onde d'intérêt (YFP ou CFP pour l'exemple actuel). Sous la rubrique« Réglages de l'appareil ", entrez le temps d'exposition requis pour acquérir une image appropriée.
      NOTE: Les "Réglages éclairage" est pré-réglée par l'utilisateur lors de l' installation du logiciel et est chargé lors de l' ouverture μManager. Si le logiciel est pas configuré pour contrôler la roue de filtre, déplacer manuellement la roue de filtre dans la tourelle à la position appropriée.
    5. Changer pour un objectif d'eau par immersion cône longue distance-travail allant de 40-100x grossissement. Choisirl'objectif qui a la plus haute ouverture numérique (NA) et est corrigé chromatiquement (apochromatique).
    6. Cliquez sur "Live" pour choisir le champ de vision: Dans le cas du neurone RB, l'image du transport mitochondrial à l'axone souches, émanant du corps cellulaire, ou sous la tonnelle périphérique.
      NOTE: Les tonnelles périphériques des neurones RB dans le pli de la nageoire caudale de l'embryon fournissent une occasion idéale pour l' image d' un grand champ de vision qui est plat et peut donc être capturé sur une seule image avec un microscope à champ large. Il est donc important de monter l'embryon à plat que possible, sur son côté, de sorte que le pli caudale est parallèle au fond de la boîte de Pétri.
    7. Après avoir choisi un champ de vue, cliquez sur le bouton "sélection rectangulaire" dans le menu ImageJ, définir une région d'intérêt (ROI) et cliquez sur "ROI" dans la fenêtre μManager. Après avoir sélectionné le retour sur investissement pour l'imagerie, cliquez sur "Stop" et "Enregistrer" pour take une image du canal YFP pour enregistrer la morphologie locale des neurites / s.
    8. Pour l'image du transport mitochondrial cliquez sur le "Multi-D Acq." bouton. Observer une fenêtre supplémentaire ( «Multi-dimensionnelle Acquisition") et sélectionner le nombre de points de temps, ainsi que l'intervalle entre les points de temps sur cette fenêtre. Utiliser des taux de trame de 0,3-1 Hz. Effectuer des enregistrements pendant au moins 10 min pour recueillir autant de points de données que possible.
    9. Dans la fenêtre "multi-dimensionnelle Acquisition", cliquez sur "Canaux", d'ajouter et de définir la longueur d'onde pour l'imagerie (PCP pour les mitochondries dans cet exemple) et le temps d'exposition. Gardez les temps d'exposition à moins de 400 msec pour l'imagerie du transport mitochondrial.
    10. Cliquez sur l'option "Enregistrer les images" dans la fenêtre "multi-dimensionnelle d'acquisition», pour sauvegarder automatiquement les fichiers dans un dossier spécifique décrit dans la «racine Directory». Cliquez sur "Acquire" dans le coin supérieur droit de commencer timimagerie e-lapse.
    11. réajuster manuellement la mise au point pendant l'enregistrement time-lapse pour compenser toute dérive dans la dimension z.
      NOTE: L'utilisation de ces paramètres de transport mitochondrial dans les neurones RB peut être imagée aussi longtemps que 4 heures.
  2. Microscopie confocale
    NOTE: Voici les lignes directrices sont fournies pour l' imagerie avec un Olympus FV1000 microscope confocal verticale et les objectifs de l' eau-trempage-cône distances long travail. Le microscope est équipé de plusieurs lignes laser, et plusieurs détecteurs (photomultiplicateurs conventionnels et des détecteurs les plus sensibles en arséniure de gallium de phosphure) qui permettent une imagerie à canaux multiples. il est fait référence spécifique au logiciel Olympus Fluoview. Toutefois, les paramètres d'imagerie décrits ici doivent être facilement transférables à d'autres systèmes confocaux.
    1. Embryons de montage dans l' agarose bas point de fusion dans une orientation appropriée pour l'organe / structure imager, tels que décrits dans les 4 ci - dessus.
    2. Laisser le plat avec du poisson monté à équilibrer à 28,5 o C dans une chambre de chauffage sur la scène du microscope avant de commencer l' imagerie.
    3. Utilisez la distance objectifs d'eau par immersion à cône long travail pour microscopes confocaux dans une configuration verticale. Choisir des objectifs avec le plus haut possible NA pour maximiser la quantité des signaux fluorescents qui peuvent être collectées et ont le meilleur pouvoir de résolution. Lorsque la collecte des images à partir de plusieurs canaux choisissent objectifs chromatiquement corrigées (apochromatiques).
    4. Ouvrez le logiciel de microscope et cliquez sur "Trans Lamp" ou "Epi lampe" à utiliser respectivement soit la lumière transmise ou de la fluorescence pour identifier la région d'intérêt par les oculaires du microscope.
    5. Utilisez le logiciel pour configurer les paramètres d'analyse suivants pour acquérir des piles d'images:
      1. Dans la fenêtre "Réglage Acquisition" vérifier que l'objectif choisi pour l'imagerie correspond à l'objectif qui apparaît sur le menu down Menu des objectifs disponibles.
        NOTE: Ceci est d'assurer que tous les paramètres pré-calculées pour un objectif particulier (résolution par exemple, latérale et axiale, la taille de l'ouverture confocale etc.) sont valables et peuvent être utilisés de manière fiable.
      2. Sélectionnez la ligne laser / s, et d'excitation et d'émission dichroïques filtres appropriés à l'image protéine fluorescente spécifique (s). Pour ce faire, en cliquant sur la "liste Dye" dans la fenêtre "Image Acquisition Control" et choisissez le fluorophore / s approprié. Vous pouvez également cliquer sur le bouton «chemin de lumière et colorants" pour régler manuellement ces paramètres.
        NOTE: Lorsque la "Liste Dye" option de bouton est choisi, le logiciel sélectionne automatiquement les filtres dichroïques lignes laser, d' excitation et d' émission appropriés et ajuste la taille de l'ouverture confocale de manière appropriée.
      3. Dans la fenêtre "Acquisition Réglage", régler le facteur "Zoom" et "asp Tailleect rapport "(ie, 512x512, 1024x1024 , etc.) de l'image numérisée pour obtenir la taille de pixel nécessaire pour résoudre au mieux les structures imagées. Définissez la taille de pixel à environ la moitié de la résolution théorique de l'objectif, ce qui suit Nyquist critères d'échantillonnage . pour déterminer la taille de pixel de l'image acquise, cliquez sur le bouton avec le symbole de l'information ( "i") dans la fenêtre "image Acquisition Control".
      4. Réglez la vitesse de balayage la plus rapide possible (2 us / pixel) dans la fenêtre "Réglage Acquisition".
      5. Dans le "Image Acquisition Control" fenêtre, cliquez sur Kalman ligne moyenne pour réduire le facteur bruit.Procédé de 2 à 3 suffit habituellement.
      6. Sélectionnez un mode de balayage séquentiel lors de l'imagerie fluorophores avec chevauchement des spectres. Pour ce faire, cliquez sur "séquentielle" et "Line" dans la fenêtre "Image Acquisition Control".
      7. Réglez la puissance de sortie de la ligne laser / s pertinents (généralementinférieure à 5%). Les valeurs spécifiques doivent être déterminées empiriquement.
      8. Cliquez sur le bouton "XY Repeat" ou "x2 Focus" ou "Focus x4" pour analyser en continu la région sélectionnée tout en ajustant les réglages du détecteur pour chaque canal. Réglez "HV", "Gain" et "Offset" pour chaque canal d'acquérir des images qui ont la gamme dynamique la plus élevée des valeurs de gris.
        NOTE: Les valeurs spécifiques de ces paramètres doivent être déterminées empiriquement. «HV» permet de régler la tension sur le détecteur pour changer sa sensibilité, "Offset" ajuste le signal de sortie du détecteur et «gain» multiplie le signal de sortie du détecteur par un facteur constant.
      9. Appuyez sur Ctrl + H pour visualiser les images acquises par le biais d'une table de consultation (HiLo) qui identifie la sous-saturée (apparaissent en bleu) et plus saturée pixels (apparaissent en rouge), qui tous deux devraient généralement être évités. Re-évaluer la puissance du laser pertinente line / s et les paramètres de détection.
        REMARQUE: L' utilisation de puissance laser élevée et des niveaux élevés de la "HV" du détecteur conduira à plus de signal. puissance du laser supérieur sera toutefois conduire à une augmentation de blanchiment et de photo-toxicité. L'augmentation de la "HV" conduira à une augmentation du bruit. Par conséquent, un compromis doit être trouvé lors de la mise puissance du laser et "HV" pour acquérir des images avec des niveaux acceptables de bruit tout en empêchant la photo-dommages (voir également le tableau 1).
      10. Collecter des images à partir d'un volume défini en se concentrant sur les limites supérieure et inférieure de la zone d'intérêt. Dans le "Réglage Acquisition" fenêtre, cliquez sur le "End Set" et "Start Set" set boutons de la fenêtre z-stack à la limite supérieure et inférieure du volume à imager. Sélectionnez une taille de pas qui est la moitié de la résolution z pour l'objectif donné (par exemple., Si z la résolution est de 2 pm choisir 1 pm). Pour déterminer le z-résolution de l'objectie cliquez sur le bouton avec le symbole de l'information ( "i") dans la fenêtre "Image Acquisition Control".
      11. Mettre en place une série de temps pour recueillir z-piles à une fréquence temporelle qui est approprié pour la dynamique de la structure subcellulaire imagée. Dans le "TimeScan" sous-fenêtre entrer la fréquence à laquelle z-piles devraient être acquises ( "Interval" ') et le nombre de fois les images doivent être acquises ( «Num»).
      12. Cliquez sur la "profondeur" et boutons "Time" dans la fenêtre "Image Acquisition Control" pour confirmer que z-stack et le temps de la série seront acquises. Enfin, cliquez sur le bouton "XYZT" pour commencer l'acquisition d'images en accéléré.
      13. Après l'achèvement de l'acquisition d'images, d'observer "Série Fait" sur l'interface du logiciel. Cliquez dessus et enregistrer les images en format "OIB" pour enregistrer les images et les métadonnées qui leur sont associées.
        NOTE: Les images obtenues sur lemicroscope à champ large et microscope confocal peuvent être visualisées et analysées à l'aide de logiciels tels que FIDJI, un domaine public programme de traitement d'image libre.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, l'utilisation du grand champ et la microscopie confocale à la mitochondrie et centrosomes dans la vie des embryons de poisson zèbre image est directement comparé et contrasté. En fonction de la localisation des cellules dans lesquelles la dynamique des organites doivent être examinés et que la fréquence inhérente des événements subcellulaires spécifiques, en général, soit à grand champ ou la microscopie confocale est le meilleur choix. Nous imagé organites dans les neurones RB s...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous démontrons la polyvalence du système d'expression Gal4-UAS aux mitochondries tag fluorescence, centrosomes et les membranes cellulaires de types cellulaires spécifiques in vivo dans des embryons de poisson zèbre. De nombreuses protéines de fusion fluorescentes qui marquent les autres organites ou structures sous - cellulaires peuvent être trouvés dans la littérature et peuvent être obtenus auprès du laboratoire respectif, les sources commerciales ou des dépôts de plasmides non commerciaux (par...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P.E. est soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 et la Graduate School de la Technische Universität München (TUM-GS). G.P. a été soutenu par TUM-GS. L.T. est soutenu par une bourse de l’EMBO (EMBO ALTF 108-2013). Les travaux de D.P. sur le poisson-zèbre ont été soutenus par la DFG par le biais du Sonderforschungsbereich « Mécanismes moléculaires de la neurodégénérescence » (SFB 596) ; le Center for Integrated Protein Sciences (Munich) et le septième programme-cadre de la Communauté européenne (FP7/2007-2013) dans le cadre de la convention de subvention n° 200611 (MEMOSAD). Il est actuellement boursier de la New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller et a été soutenu par une bourse de l’Académie allemande des sciences Leopoldina. L.G. est soutenu par le financement de la DFG à travers le SFB 870 « Assemblage et fonction des circuits neuronaux », projet A11.

Nous remercions Kristina Wullimann pour l’entretien de notre installation de pisciculture, Yvonne Hufnagel pour le soutien technique et Thomas Misgeld pour les commentaires sur le manuscrit. Nous sommes reconnaissants à R. Köster (Technische Universität Braunschweig) de nous avoir fourni le vecteur M1 Medusa (pSKmemmRFP :5xUAS :H2B-CFP :5xUAS :Centrin2-YFP) à partir duquel nous avons cloné Centrin-YFP et S.C. Suzuki et T. Yoshimatsu (Université de Washington) pour avoir fourni la cassette 14xUAS :MA-céruléenne que nous avons utilisée pour générer la construction du rapporteur pour créer CentrinFish. Nous remercions également S.C. Suzuki et T. Yoshimatsu (Université de Washington) pour la lignée transgénique Otx2 :Gal4, A. Sagasti pour la construction Sensory :Gal4-VP16 (UCLA) et M. Nonet (Université de Washington à St. Louis) pour le vecteur pCold Heart Tol2. Nous remercions Bettina Schmid, Alexander Hruscha et Christian Haass (Centre allemand pour les maladies neurodégénératives de Munich - DZNE) d’avoir contribué au développement de MitoFish.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Agarose (2-hydroxyéthylagarose)Sigma-AldrichA4018-10GTempérature de gélification basse Type VII
Chauffe-blocEppendorfThermomixeur compact
Ca(NO3)2 Hydrate de nitrate de calcium, 99,996 %  ;Aldrich202967-50gPour préparer la caméra CCD 30x de Danieau
QimagingRetiga Exi Fast 1394
Ceramic Coated Dumont #5 ForcepsDumont - Fine Science Tools11252-50#5 Forceps
Microscope confocal à balayage laserOlympusFV1000 Fluoview
Chauffage de la paraboleWarner Instrument CorporationDH-35Anneau chauffant
Ethyl 3-aminobenzoate méthanesulfatesel PharmaQTricaïne PharmaQ-25gTricaïne (anesthésique)
Microscope de dissection de fluorescenceLeicaM205 FA
GeneClean kitMP Biomedicals111001200
Plats de culture à fond de verreMatTek CorporationP35G-0-14-CBoîte de Pétri de 35 mm, micropuits de 14 mm, verre de protection n° 0
Aiguilles en verreWorld Precision Instruments Inc.  ;TW100F-4Pour micro-injections
HEPESSigmaH3375-250gPour préparer 30x Graisse sous vide poussé Danieau’s
Dow Corning  ;DCC000001242 150gGraisse au dioxyde de silicium
KCl 99 %Sigma-AldrichS7643-5kgPour préparer 30x
MgSO4.7H2O de Danieau   ; Sulfate de magnésium heptahydraté 98+ % A.C.S réactifSigma-Aldrich230291-500gPour préparer 30x
Microinjecteur de Danieau  ;EppendorfFemtoJet
MicrochargeursEppendorf9300010070.5-20 ul
MicromanipulateurMaerzhaeuser WetzlarMM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R
Porte-micropipetteIntracelP/N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription KitAmbionAM1340Pour transcrire PCS-Transposase
NaCl BioXtra >99.5 %Sigma-AldrichP9541-1kgPour préparer le nanophotomètre
30x Pour mesurer la concentration d’ADN/ARN
Extracteur d’aiguilleSutter InstrumentP-1000Flaming/Brown
NIR Apo 40x/0.80W  ;Objectifà cône d’immersion dans l’eau
Nikon N-Phénylthiourée Grade I, env. 98 %SigmaP7629-10GPTU (empêche la pigmentation)
Boîtes de PétriSarstedt AG  ;82147292 x 16 mm  ;
Moules en plastique  ;Outils scientifiques adaptatifsTU-1Pour les micro-injections
Couvercle en plexiglas avec un trouSurLe trou dans le couvercle en plexiglas doit être 3 mm plus grand que le diamètre de l’objectif du cône de trempage d’eau
Passoire à thé (plastique)Pour collecter les œufs de poisson-zèbre
Contrôleur de températureWarner Instrument CorporationTC-344BDouble température automatique
Contrôleur Pipettes de transfertSarstedt AG  ;86.1171Pipettes de transfert en plastique de 3,5 ml
UMPlanFI 100x/1.00WObjectif à cône d’immersion dans l’eauOlympus
UMPlanFLN 20x/0.50W  ;Olympus
Microscope grand champOlympusBX51WI
PTU (50x Stock)Dissoudre 76 mg de PTU dans 50 ml d’eau distillée
Remuer vigoureusement à température ambiante  ;
Conserver à -20 oC dans 1 ml d’aliquotes
Utiliser à 1x solution de travail
Tricaïne (20x Stock)Dissoudre 200 mg de Tricaïne dans 48 ml d’eau distillée
Ajouter 2 ml de base 1M Tris (pH9)
Ajuster au pH 7  ;
Conserver à -20 oC dans 1 ml d’aliquotes
Utilisation à 1x solution de travail
Solution de Danieau (30x stock)1,740 mM  ; NaCl  ;
21 mM  ;   ;   ;   ;   ; KCl  ;
12 mM  ;   ;   ;   ;   ; MgSO4.7H2O  ;
18 mM  ;   ;   ;   ;   ; Ca (NO3)2
150 mM  ;   ;   ; Tampon HEPES  ;
Eau distillée jusqu’à 1 L  ;
Store à 4 oC  ;
Utilisation à une solution de travail 0,3x
de Danieau mesure

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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