Cathétérisme à long terme de l'Intestinal lymphe Tronc et Collection de lymphe dans néonatales Pigs

Résumé

Nous présentons une intervention chirurgicale pour cathétériser le tronc lymphatique intestinal chez des porcs nouveau-nés afin de recueillir de grandes quantités de composants du métabolisme des lipides à partir de la lymphe efférente.

Résumé

Le cathétérisme du tronc lymphatique intestinal chez le porc nouveau-né est une technique permettant de collecter à long terme de grandes quantités de lymphe efférente intestinale (centrale). Il est important de noter que la collecte de la lymphe centrale de l’intestin permet aux chercheurs d’étudier à la fois les mécanismes et les constituants lipidiques associés au métabolisme des lipides, à l’inflammation intestinale et aux métastases cancéreuses, ainsi que les cellules impliquées dans la fonction immunitaire et l’immunosurveillance. Une approche chirurgicale médiane ventrale permet une excellente exposition chirurgicale à l’abdomen crânien et un accès relativement facile au vaisseau lymphatique intestinal du tronc qui se trouve près du pancréas et au segment ventral droit de la veine porte sous la face viscérale du lobe hépatique droit. Le vaisseau est méticuleusement disséqué et libéré du fascia environnant, puis dilaté avec des sutures permettant l’insertion et la fixation ultérieure du cathéter dans le vaisseau. Le cathéter est extériorisé et environ 1 L/24 h de lymphe est recueilli sur une période de 7 jours. Bien que cette technique permette de collecter de grandes quantités de lymphe centrale sur une longue période de temps, le succès dépend d’une dissection chirurgicale soigneuse, d’une manipulation des tissus et d’une attention particulière à la technique chirurgicale appropriée. Ceci est particulièrement important pour les chirurgies chez les jeunes animaux, car les vaisseaux lymphatiques peuvent facilement se déchirer, ce qui peut entraîner un échec chirurgical et expérimental. La vidéo montre une excellente technique chirurgicale pour la collecte de lymphe intestinale.

Introduction

Le système lymphatique est un domaine peu étudié la physiologie. Modèles précliniques de cathétérisme lymphatique se produisent dans différentes espèces animales ^1-8 et sont utilisés par les industries pharmaceutiques et les institutions de recherche pour étudier les mécanismes impliqués dans les lipides ^8-12 et le métabolisme des médicaments ^13-15, les métastases du cancer ¹⁶ avec traitement expérimental ^17, et la fonction immunitaire ^{18 -26.} Cette étude examine l'utilisation de l'intestin lymphatique tronc cathétérisme dans un modèle de porc domestique pour mesurer les composants du métabolisme des lipoprotéines. le métabolisme des lipoprotéines est impliquée dans la production et la sécrétion des chylomicrons, ainsi que des changements dans les lipides et les protéines associées au total. Ces considérations sont importantes car il y a de grandes différences dans le métabolisme des lipides entre les modèles et les humains de rongeurs couramment utilisés et en tant que tels, en utilisant des modèles de porcs pour recueillir la lymphe intestinale pourrait fournir des informations plus comparables pour l'étude des lipides metabolism chez les personnes ^27-31.

Plusieurs techniques chirurgicales sont utilisées pour recueillir la lymphe intestinale chez les grandes espèces animales: une approche de l' épaule crânienne (c. -à- thoracique cathétérisme conduit) ^5, une approche latérale de flanc supérieur ^32-34, et une ligne médiane ventrale ou approche paramédiane ^22,35. Cette vidéo décrit en détail la procédure chirurgicale chez le porc en utilisant une approche chirurgicale de la ligne médiane ventrale pour le cathétérisme de la lymphe tronc intestinal. Careful permis de technique chirurgicale cette méthode de cathétérisme lymphatique pour recueillir de grandes quantités de la lymphe et de ses constituants sur des périodes de temps prolongées.

Cette technique ouvre une myriade d'applications à de nombreuses disciplines qui examinent diverses fonctions physiologiques. Les applications peuvent comprendre, mais sans s'y limiter, la lipoprotéine du corps entier et le métabolisme des lipides, immunosurveillance, la genèse des tumeurs et les métastases, la fonction intestinale, et la perfectionnement et la progression de la maladie inflammatoire intestinale.

Protocole

Toutes les procédures sur les animaux de laboratoire décrits dans la vidéo et manuscrits ont été approuvés par le Comité soin et l'utilisation des animaux et institutionnels ont suivi les lignes directrices établies par le Conseil canadien des soins aux animaux.

1. Anesthésie chirurgicale et préparation chirurgicale des porcelets nouveau-nés

1. Dans une antichambre séparée, prémédication 25 kg porcs près de la base du cou avec un cocktail de médicaments sédatifs-anesthésique intramusculaire contenant: azaperone (0,3 mg / kg), le chlorhydrate de kétamine (10 mg / kg), la dexmédétomidine (15 ug / kg).
   Note: Ajouter buprénorphine (0,005-0,02 mg / kg) dans le cocktail de médicaments pré-anesthésique pour le contrôle de la douleur intra-opératoire améliorée.
2. Anesthetize les porcs avec l' inhalation de gaz d'inhalation isoflurane (4-5% d' isoflurane à 500 ml-1000 ml / min O ₂₎ en utilisant un masque facial. Visualisez les cordes vocales en utilisant un champ laryngé vétérinaire (17-25 cm de long à lame droite), et appliquer topique 10% de lidocaïne stérilisez à la voixcordons. Laisser la pulvérisation de lidocaïne prendre contact avec les cordes vocales 30-60 sec avant l'intubation pour réduire la possibilité de spasme des cordes vocales et l'obstruction des voies respiratoires.
3. Intuber les porcs en passant un tube d'intubation endotrachéale (5,0-7,0 mm Diamètre intérieur (ID)) entre les cordes vocales et de maintenir l'anesthésie avec du gaz isoflurane (0,5-2,0% isoflurane à 1000-2000 ml / min O ₂₎ en utilisant une fermeture circuit Réaspiration système anesthésique tout au long de la chirurgie. Évaluer le niveau de l'anesthésie par la mâchoire ton, et les deux pédales et palpébraux réponses réflexes. gaz anesthésique expiré est balayé et évacué en dehors de la salle d'opération.
4. Nettoyer la surface extérieure de l'oreille avec une solution de lavage chirurgical 2,0% de chlorhexidine suivi d'un rinçage à l'alcool isopropylique à 70%. Avec un cathéter intraveineux 20 G, cathétériser une veine de l'oreille pour fournir des fluides intraveineux (Solution de Ringer lactate; 5-10 ml / kg / h) pendant la chirurgie. Fixer un oxymètre de pouls à la surface de la muqueuse de la langue avec medbande ical pour surveiller la fréquence cardiaque et la saturation du périphérique oxygénation du sang (SpO _2).
5. Placez le porc anesthésié dans une position couchée dorsale et de se raser l'abdomen ventral à partir du milieu du thorax caudale à la face ventrale du pubis. Nettoyez cette zone avec deux alternant 2,0% chlorhexidine scrubs chirurgicales et lavages à l'eau stérile.
6. Transférez le porc anesthésié à la suite chirurgicale et d'appliquer le lavage chirurgical final de 70% d'alcool isopropylique rinçage, laisser sécher, puis draper l'animal.
7. Insérer une sonde de température rectale environ 2-4 cm dans le rectum pour surveiller la température du corps. Placez les porcs sur un coussin chauffant de recirculation de l'eau pour maintenir la température normale du corps (38-40 ° C) durant la procédure chirurgicale.
8. Drapé le cochon avec quatre serviettes rideaux placés dans un modèle de quadrant recouvrant autour de l'abdomen. Placez le premier drapé dans xiphisternum, le second drap le long face latérale de l'abdomen environ 5 cm latéral à la ligne médiane abdominale. Placer le troisième champ de l'autre côté de la crête de l'iléon du bassin et le quatrième champ, comme le deuxième champ (bien que sur le côté opposé), est placé le long de la face latérale de l'abdomen d'environ 5 cm en dehors de la ligne médiane abdominale.
9. Placer un grand drap de table, avec une fente d'ouverture permettant l'accès au site chirurgical, sur les rideaux de serviette sous-jacents et couvrir le porc et l'ensemble de la table chirurgicale. Le champ final est un steri-drap jetable placé sur le grand champ de table.

2. Chirurgie abdominale et cathétérisme du Intestinal Lymphatique Trunk

1. Faire une incision de la peau de 20 cm avec une lame de bistouri pour exposer les muscles abdominaux sous-jacents. Inciser les couches de muscles abdominaux avec électrocautérisation monopolaire (20 réglage Watts) pour exposer le péritoine pariétal. Ouvrez un segment linéaire de 20 cm de péritoine pariétal avec des ciseaux Metzenbaum pour accéder à des viscères abdominaux et des vaisseaux lymphatiques.
2. Placer une valve à l'aspect crânienne de l'incision chirurgicale afin de maintenir la cavité abdominale ouverte pendant toute la durée de l'intervention chirurgicale.
3. Mouiller avec tous les tissus chaud (37 ° C) une solution saline stérile pour toute la procédure chirurgicale. Soulevez doucement une grande partie de l'intestin y compris le côlon, le caecum, l'iléon et le jéjunum de la cavité abdominale et extérioriser le flanc gauche du porc pour accéder à l'abdomen supérieur, du foie et des vaisseaux lymphatiques. Fixer l'intestin extériorisé en position avec des rideaux de serviettes supplémentaires pour former une fronde pour appuyer doucement l'intestin.
4. Localisez le vaisseau lymphatique, il pond environ 4 cm crânio-médial de la veine rénale droite, 6 cm ventral caudal-medial- des contremaîtres Caval et sous l'aspect viscéral du lobe droit du foie près du pancréas ^22,36,37. Identifier le vaisseau lymphatique comme une structure translucide juxtaposé au segment ventrale droite de la veine ^36,37.
5. Séparer la vess lymphatiqueel des fascia environnantes en taquinant doucement le tissu attaché avec des applicateurs Q-tip. Une fois que les aspects latéraux du navire sont séparés du tissu environnant, créer un "tunnel" ouverture sous le bateau avec bien émoussée basculé forceps.
6. Passez trois 2-0 sutures de soie sous le vaisseau lymphatique avec une pince fine. Ligaturer la suture la plus caudale premier à obturer, dilatent et remplir le récipient avec la lymphe. Délibérément laisser les extrémités de ce fil de suture relativement longues (4 cm) pour fixer le cathéter au vaisseau lymphatique. Placez deux autres sutures séparées de 1,0 cm de l'autre et sont d'environ 1,0-1,5 cm crâniens à la suture caudale sécurisée. Laissez ces deux sutures avec un «simple cravate ligatures lâche» pour permettre la fixation rapide du cathéter dans le vaisseau.
   Remarque: Le segment du vaisseau lymphatique situé entre la suture la plus caudale de ligature et suture du milieu (des deux sutures crâniennes) est le site de cathétérisme. En ce qui concerne sumatériau ture, 2-0 polyglactine suture peut remplacer 2-0 sutures de soie si nécessaire.
7. Coupez un petit trou dans le récipient avec iris ciseaux et dilater le vaisseau avec de fines pinces émoussées. Insérez environ 1,0-1,5 cm de tube de cathéter spécialisé (4,06 Diamètre extérieur (OD) X 2,31 mm ID) avec une extrémité biseautée dans le récipient et attacher les deux sutures crâniennes pour fixer le cathéter en place. Utiliser les extrémités de la suture caudale de suture longue pour fixer le cathéter dans le récipient.
8. Laver l'intestin extériorisé avec de grandes quantités d'eau chaude salée et revenir doucement à la cavité abdominale assurant un positionnement anatomique correcte de l'intestin.
9. Extériorisent le cathéter au milieu flanc gauche (5-10 cm ventral de la fosse paralumbar). Faire une incision de la peau avec un scalpel et passer un trocart dans la cavité abdominale à la surface de la peau pour créer une ouverture pour l'extériorisation du cathéter. Utilisez une grande pince Kelly à extérioriser le cathéter de la cav abdominaleIty par l'ouverture de trocart.
10. Fermez le péritoine pariétal avec un motif de suture simple et continu de 2-0 polyglactine suture avec une (conique) aiguille ronde. Fermez les couches de muscles abdominaux avec un motif de suture interrompue simple avec une suture 2-0 polyglactine sur une aiguille ronde.
11. Fermez la peau dans un modèle subcuticulaire avec 2-0 polyglactine suture sur une aiguille de coupe. Fixer le cathéter extériorisé à la peau avec un motif de suture en bourse et une suture 2-0 en nylon sur une aiguille de coupe.
12. Placez une veste spécialisée sur le porc tout en anesthésié pour faciliter sa mise en place et de réduire le stress du porc lors de la récupération.

Recovery 3. Post-chirurgical et lymphe Collection

1. Environ 10 minutes avant l'arrêt de l'anesthésie par inhalation, administrer bupenorphine (0,1 mg / kg) par voie intramusculaire pour fournir immédiatement après la chirurgie analgésie. Continuer bupenorphine (0,1 mg / kg) toutes les 12 heures pendant 24-48 heures pour maintenirpost-chirurgie analgésie.
2. Surveiller les porcs pour les complications post-chirurgicales chaque 8-12 h pour une période de 7 jours.
3. Recueillir la lymphe dans 500 ml bouteilles de lavage de polypropylène, revêtu d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), et complété avec des antibiotiques; pénicilline (6000 UI), la streptomycine (6 mg) et de l'amphotéricine B (3 mg) toutes les 12 heures pendant une période de 7 jours.

4. Quantification des lipoprotéines ApoB48, triglycéride, cholestérol et protéines totales provenant de lymphe

1. Centrifuger l'échantillon lymphatique à 1800 xg pendant 5 min à 4 ° C. Recueillir le surnageant et l'utiliser pour la quantification des triglycérides, le cholestérol et la protéine totale.
2. Divisez le surnageant dans trois échantillons: un échantillon non dilué, un échantillon dilué 01h20 eau distillée et un échantillon final dilué à 1: 100 avec de l'eau distillée.
3. Utilisez le surnageant non dilué pour mesurer les niveaux de cholestérol, avec un kit disponible dans le commerce.
4. Utilisez le 01:20 et 01:100 échantillons dilués pour mesurer les niveaux de protéines totales de triglycérides et d'un kit disponible dans le commerce et la protéine dosage de l'acide totale bicinchoninique respectivement.

5. Quantification des lipoprotéines ApoB48, Collected de lymphe ³⁸

1. Déterminer la concentration de lipoprotéines ApoB48 avec une méthode immunitaire Western Blot adapté ^38. lymphe totale séparée avec 3-8% électrophorèse sur gel de polyacrylamide de sodium dodécyl-tris acetate- (SDS-PAGE).
2. Transférer les protéines séparées sur une membrane de fluorure de polyvinylidène (0,45 um) et de les laisser incuber avec un anticorps polyclonal de chèvre à l'ApoB (1: 4000), puis le lier avec un anticorps secondaire anti-chèvre.
3. Quantifier la lipoprotéine ApoB48 avec chimioluminescence en utilisant une comparaison densitométrique linéaire avec rongeur purifié standard protéine ApoB48.

Résultats

cathétérisme lymphatique du tronc lymphatique intestinale des porcelets nouveau-nés permet la collecte d'environ 1 L / 24 h de la lymphe centrale sur une période de 7 jours. La lymphe recueillie dans ces expériences contenait des composants du métabolisme des lipides, des protéines de la lymphe savoir totale, ApoB48 lipoprotéines, des triglycérides, des protéines totales, et le cholestérol. Le tableau 1 montre les montants représentatifs de ces composants lipidiques à partir d'échantillo...

Discussion

La collecte de la lymphe intestinale est une excellente méthode pour étudier les mécanismes impliqués dans les lipides ^8-12 et ^13-15 médicament métabolisme, les métastases du cancer ^16,17, le trafic cellulaire et la fonction immunitaire ^18-26, dans divers modèles animaux expérimentaux. En effet, la capacité de récolter de grandes quantités d' une ou l' autre périphérique (afférences) et centrale (efférente et les gros vaisseaux du tronc) lymphe sur une longue période a...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lame de laryngoscope Miller	Welch Allyn	68044	Longueur 182 mm
Surgivet conseiller : Moniteur de signes vitaux	Surgivet	V9203
Sonde de température rectale	Surgivet	V3417
Générateur d’électrochirurgie monopolaire	Valley Lab
Ciseaux Metzenbaum	Fine Science	14518-18
Écarteur Tuffier	Stevens	162-11-676
Pince à moustiques	Stevens	162-7-10
Pince Kelly courbée (14cm)	Stevens	162-7-38
Pince à tissus Allis	Stevens	162-7-38
Pince à pansement (10.2cm)	Stevens	162-18-780
Pince à pansement Adison (12.1cm)	Stevens	162-17-2510
Tourne-aiguilles	Stevens	162-V98-42
Ciseaux à iris	Fine science	14058-11
Pompe à eau de circulation	Jorvet	J-783X
Maxitherm-Couverture en vinyle	Jorvet	J-784C
Applicateurs d’embouts Q	Fisher Scientific	22-037-960
Cathétérisme  ; tubes (4.06 OD X 2.31 ID)	Braintree Scientific Inc.	MRE-160	Tubulure d’implantation Micro-Renethane
2-0 suture en soie	Ethicon	LA556
2-0 suture polyglactine	Ethicon	J443H	2-0 vicryl
Veste grand animal	Lomir Biomedical Inc.	SSJ2YC
Flacons hygiéniques en polypropylène	Fisher Scientific	03-409-22C	500 ml
Pénicilline-Streptomycine	Sigma Aldrich	D4333
EDTA	Sigma Aldrich	60-00-4
Amphotéricine B	Sigma Aldrich	A2411
Azaperone	Elanco Santé		Stresnil
Chlorhydrate de dexmédétomidine	Zoetis	6295	Dexdomitor
Isoflurane	Abbott Animal  ; Santé	05260-5	IsoFlo
Chlorhydrate de kétamine	Zoetis	2626	Ketaset
Chlorhydrate de bupenorphine	Champion Alstoe Santé		DIN :02347510
6 mm Tube endotrachéal	Jorvet	J-165d
10 % Spray de lidocaïne	AstraZeneca		DIN :02003767
4 % Chlorhexidine gommage	chirurgicalPartnar Santé animale	PCH-011	Dilué : solution à 2,0 %
3M Champ chirurgical stérile	3M Health Care	1040
SDS page gel	Invitrogen	EA0375BOX	3-8 % acétate de tris
de fluorure de polyvinylidène	Millipore	IPVH00010	0,45 &mu ; Anticorps ApoB de taille des pores
;	EMD Millipore	AB742	dilution 1:4000
Donkey anti-chèvre IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	Sc-2304
ECL Prime Western Blot Reagent	GE Healthcare LifeSciences	RPN2232  ;   ;   ;
Kit de triglycérides	Wako Pure Chemicals	998-40391/994-40491
Kit de cholestérol total	Wako Pure Chemicals	439-17501
Protéines	totales  ; Percer  ;	23225	Dosage de l’acide bicinchoninique