Mesure et analyse de la production extracellulaire acide pour Déterminer glycolytique Taux

Résumé

La glycolyse est un marqueur métabolique déterminant dans plusieurs systèmes biologiques. La surveillance de la glycolyse par la mesure du flux extracellulaire de H⁺ est courante, mais nécessite une correction quantitative et sans ambiguïté. Ici, nous montrons comment recueillir et corriger des données de flux extracellulaires pour distinguer les sources respiratoires et glycolytiques d’acidification extracellulaire.

Résumé

La mesure extracellulaire de la consommation d’oxygène et de la production d’acide est un moyen simple et puissant de surveiller les taux de respiration et de glycolyse¹. Les réactions mitochondriales (respiration) et non mitochondriales (autres réactions redox) consomment de l’oxygène, mais ces réactions peuvent être facilement distinguées par l’inhibition chimique de la respiration mitochondriale. Cependant, alors que la consommation d’oxygène mitochondriale est une mesure directe et sans ambiguïté du taux respiratoire², il n’en va pas de même pour la production d’acide extracellulaire et sa relation avec le taux glycolytique ^3-6. L’acide extracellulaire produit par les cellules est dérivé à la fois du lactate, produit par la glycolyse anaérobie, et du CO₂, produit dans le cycle de l’acide citrique pendant la respiration. Pour la glycolyse, la conversion du glucose en lactate^- + H⁺ et l’exportation des produits dans le milieu de dosage sont à l’origine de l’acidification glycolytique. Pour la respiration, l’exportation de CO₂, l’hydratation en H₂CO₃ et la dissociation en HCO₃^- + H⁺ sont à l’origine de l’acidification respiratoire. Les proportions d’acidification glycolytique et respiratoire dépendent des conditions expérimentales, y compris le type de cellule et le(s) substrat(s) fourni(s), et peuvent aller de près de 100 % d’acidification glycolytique à près de 100 % d’acidification respiratoire ⁶. Ici, nous démontrons les méthodes de collecte de données et de calcul nécessaires pour déterminer les contributions respiratoires et glycolytiques à l’acidification extracellulaire totale par des cellules entières en culture en utilisant des cellules myoblastiques C2C12 comme modèle.

Introduction

L'objectif global de cette méthode est de mesurer avec précision le taux de la glycolyse des cellules en utilisant l'analyse de flux extracellulaire. La mesure quantitative du taux de la glycolyse en utilisant l'acidification extracellulaire est le point final souhaité de nombreuses expériences. Cependant, le taux global de l'acidification extracellulaire est la somme de deux composantes: l'acidification respiratoire, sous forme de CO ₂ (qui hydrate à H ₂ CO ₃ dissocie alors de HCO ₃ ^- + H ^+), et de l'acidification de la glycolyse, sous la forme de lactate ^{- + H} +.

Les contributions de CO _{2 à} l'acidification extracellulaire totale ont jusqu'à récemment été considéré comme négligeable dans la plate-forme de mesure utilisée ici, l'analyseur XF24 ^7. Cependant, il est clair dans plusieurs autres systèmes qui _CO 2 peut être un contributeur majeur à l'acidification extracellulaire ^4-5. Plusieurs documents reconnaissent ce concontribution, mais ne tentez pas de quantification directe de CO ₂ -derived ^3,8,9 acide. Nous avons récemment démontré que quantitativement _production de CO 2 est une source importante de l'acidification extracellulaire dans ce système ^6. En outre, bien qu'il existe plusieurs voies métaboliques qui produisent _du CO 2 de catabolisme du glucose, celles effectuées par les déshydrogénases de la matrice dans le cycle de l'acide citrique sont les contributeurs écrasante et toutes les autres sources génèrent des quantités de CO ₂ qui sont dans l'erreur expérimentale ^6.

Sans correction de _production de CO 2, l'acidification extracellulaire est donc un indicateur ambigu de taux glycolyse et ne peut être utilisée quantitativement. Notre dernière publication met en lumière plusieurs cas où respiratoires CO _{2 comprend} la majeure partie du signal de l'acidification totale, même dans les cellules croit généralement d'utiliser principalement la glycolyse ^6. En outre, lerespiratoires CO ₂ contribution à l'acidification totale varie considérablement au cours des expériences de profilage métaboliques communs, ce qui démontre que la comparaison correcte de la vitesse au cours de la glycolyse différentes parties d'une expérience nécessite une correction pour le CO _2.

Pour mesurer le taux glycolytique de cellules en utilisant le taux d'acidification extracellulaire, il est nécessaire de convertir des changements de pH à des changements dans totale H ⁺ générés, et pour soustraire l'acidification extracellulaire provoquée par CO ₂ libéré pendant le fonctionnement du cycle de l'acide citrique. Ici, nous décrivons un procédé simple pour la mesure de la vitesse de production de protons extracellulaire (à partir de changements extracellulaires du pH et de la force calibrée tampon du milieu de dosage) et _production de CO 2 (à partir de changements extracellulaires de la concentration _en O 2), et montrons comment calculer le taux glycolytique l'utilisation de ces mesures.

Cette méthode force ens l'utilité de la mesure de l'acidification extracellulaire en l'utilisant pour calculer correctement le taux glycolytique tel que défini par la production de lactate. Sans correction pour le CO respiratoires ₂ (ou mesure directe de lactate), il est impossible de déterminer si et dans quelle mesure le taux d'acidification totale reflète le taux de la glycolyse, confondant l'interprétation des expériences qui utilisent l'acidification extracellulaire totale comme une mesure directe de la production de lactate.

CALCULS

CO ₂ et le lactate sont, dans l'erreur expérimentale, les deux seuls contributeurs à la production d'acide extracellulaire, basées sur des expériences avec des cellules de myoblastes ^6. Par conséquent, le taux d'acidification extracellulaire totale (PPR, le taux de production de protons) peut être définie comme:

PPR _{tot =} PPR _resp + PPR _Glyc équation 1

. _content "> où tot = totale; resp = respiratoire; Glyc = glycolytique glycolytique PPR est donc:

PPR PPR _Glyc = _tot - PPR _resp équation 2

Ici,

PPR _{tot =} ECAR _{tot /} BP équation 3

où ECAR = taux d'acidification extracellulaire (mph / min), et BP = pouvoir tampon (mph / pmol H ^{+ à} 7 pi), tandis que

PPR _resp = (10 ^{pH-PK ₁} / (1 ​​+ 10 ^{pH-PK ₁₎₎} (max ^H + / O ₂₎ (OCR _tot - OCR _{rot / myx)} L'équation 4

où K = _une constante d'équilibre de CO ₂ combiné hydratation et la dissociation de ^_HCO 3 - + H ^+; max ⁺ H / S ₂ = ee _CO 2 acidification -derived pour une transformation métabolique particulier tel que l'oxydation complète du glucose ^6; OCR = taux d'oxygène de la consommation (pmol de O ₂ / min), et OCR _{rot / myx} = non mitochondrial OCR.

Equation 4 isolats mitochondrial OCR en soustrayant tout OCR non-mitochondrial (défini comme OCR qui est résistant à la mitochondrial poisons respiratoire roténone et myxothiazol) et représente le maximum ^H + généré par O ₂ consommé pour chaque substrat (max ^H + / O ₂ ) (voir ^6), ainsi que la proportion de CO ₂ donnant lieu à H ⁺ à la température et le pH expérimental (10 ^{pH-PK ₁} / (1 ​​+ 10 ^{pH-PK _1).} Pour toute oxydation du glucose, de l'oxygène mitochondrial Taux de consommation (OCR) est exactement égal au taux de _production de CO 2. Dans le volume d'essai confiné de mesure de flux extracellulaire, CO ₂ produitsd par respiration reste piégé dans le milieu d'essai. La majeure partie du CO ₂ est piégé hydraté _en H 2 _CO 3, qui se dissocie ensuite à _^HCO 3 - ⁺ H +. Une petite fraction reste dissous mais pas hydraté, et une autre petite fraction est hydraté mais pas dissocié, comme dicté thermodynamiquement par la constante d'équilibre combiné de CO ₂ hydratation et la dissociation de HCO ₃ ^{- + H} + à la température expérimentale (37 ° C) et le pH (~ 7,4).

Ainsi, l'équation complète pour le calcul de PPR _g en soustrayant de PPR PPR _{resp tot est:}

PPR _Glyc = ECAR _{tot /} BP - (10 ^{pH-PK ₁} / (1 ​​+ 10 ^{pH-PK ₁₎₎} (max ^H + / O ₂₎ (OCR _tot - OCR _{rot / myx)} L'équation 5

jen cette façon, les taux de la respiration et de la glycolyse, ainsi que leur taux de production d'ATP associés, peut être déterminée quantitativement à partir de mesures simples (consommation d'oxygène, acidification extracellulaire, capacité tampon) et l'importation ou le calcul des autres valeurs requises (H ⁺ / S ₂ , P / S, et la constante d'équilibre K ₁₎ ^6. L'expérience décrite ici se développe sur des techniques standard pour utiliser le Flux Analyzer extracellulaire tels que Seahorse XF24 ^10,11; pour d'autres formats de mesure de flux extracellulaire (par exemple, XF 96 ^e, ou XFP), tous les volumes ci-dessous devraient être réduites de manière appropriée.

Le pouvoir tampon du milieu d'essai peut être mesurée par la construction d'une courbe d'étalonnage, soit directement dans la plate-forme flux extracellulaire ou séparément à l'aide d'une sonde de pH étalonnée. Ici, trois options de mesure de mise en mémoire tampon par le moyen d'analyse de flux sont donnés extracellulaire, y compris en utilisant tous INJECTIsur les ports de l'analyseur de flux extracellulaire avec des puits d'échantillons exempts de cellules, ou en utilisant uniquement le dernier port d'injection dans les puits contenant des cellules (section 1) ou en utilisant une mesure de pH externe (section 2). Voir la feuille de calcul ci-jointe pour les calculs complets de données d'exemple.

Pour mesurer la puissance tampon en utilisant la capacité de l'instrument flux extracellulaire pH de détection, il est plus sûr d'utiliser des puits sans cellules afin de minimiser la variation du signal. Cependant, dans l'erreur, aucune différence statistique existe entre les puits lors de la réalisation et cette mesure contenant des cellules exempt de cellules (données non présentées). NOTE: La variation décrit dans l'étape 1.7 comporte l'avantage de rendre compte de tous les changements potentiels à tampon conférés par composés ajoutés ou par la présence de cellules, avec l'inconvénient d'un signal bruyant. Toutefois, comme indiqué ci-dessus, aucune différence significative n'a été trouvée dans le pouvoir tampon calculé entre la conception acellulaire indiqué dans le tableau 1 etla conception post-expérience dans le tableau 2 dans les conditions expérimentales décrites ici.

En outre, sur des plages de ApH petites (<0,4 unités; expérimentalement meilleure limités à 0,2 unités), la pente linéaire obtenue en reportant Δ mpH / pmol H ⁺ se rapproche de manière adéquate la relation logarithmique entre ApH et [H ^+]. La pente de cette courbe d'étalonnage représente donc le pouvoir tampon du milieu d'essai dans l'essai de pH / nmol ^H + dans 7 ul, ou MSP / pmol ^H + dans 7 ul. Nous recommandons d'augmenter le pouvoir tampon milieu ou en diminuant la densité cellulaire pour les échantillons qui dépassent un changement de 0,2 unité de pH au cours de la durée de mesure. Le temps de mesure peut aussi être diminué, mais cela pourrait réduire le taux d'acidification de l'état d'équilibre et d'introduire des erreurs dans le calcul du taux.

Protocole

1. Mesurer Buffering Puissance en un flux Instrument extracellulaire: deux variantes

REMARQUE: les calculs et les méthodes décrites ici ont été développées à l'aide d'un analyseur de Flux extracellulaire. Pour les autres instruments, le volume de mesure doit être mise à l'échelle appropriée.

1. Préparer 0,1 M HCl norme dans l'eau en utilisant du HCl concentré (voir matériel et équipement) selon les instructions du fabricant.
   Remarque: Un exemple de calcul pour préparer des injections HCl pour une utilisation dans les quatre ports d'injection est indiqué dans le Tableau 1:

Tableau 1. injections consécutives HCl dans un dosage flux extracellulaire ainsi.

2. Préparer des dilutions de la norme HCl dans le milieu à doser comme dans le tableau 1 pour le nombre de répétitions techniques étant carrIED dans une plaque, plus un pour permettre à l'erreur de pipetage; par exemple, pour les quatre répétitions techniques du port A d'injection, préparer un stock de (1,1 pi x 5) HCl 0,1 M dans (48,9 pi x 5) milieu de dosage.
3. Distribuer 50 ul dans chaque port A de la cartouche de la sonde de mesure. Répétez cette procédure pour les ports restants B, C, et D.
4. Exécutez un test de flux extracellulaire ¹⁰ avec un cycle d'étalonnage standard, suivie de deux cycles de [2 min mélange, 1 min d'attente, et 5 min de la mesure] pour chacun des quatre ajouts portuaires (voir la figure 2).
   1. Programmer l'expérience ci-dessus dans le logiciel de l'instrument selon les instructions du logiciel. Charger la cartouche préparé dans la machine et effectuer le calibrage selon les instructions du logiciel.
   2. Lorsque vous êtes invité par le programme, retirez la plaque contenant étalon-et insérer la plaque contenant du milieu d'essai dans chaque puits dans l'instrument; poursuivre le programme.
5. U chanter la moyenne de 8-10 points de données obtenues à l'état d'équilibre (en général les 8-10 derniers points) avant et après chaque addition de port, calculer la (cumulatif) différence de pH (ApH) causés par chaque injection d'acide standard.
6. Tracer ApH contre nmol ^H + contenu dans le volume 7 ul piégé par la sonde de mesure. La pente linéaire est le pouvoir tampon (BP) en MPH / pmol H ^+.
7. Alternativement aux étapes 1,2-1,3, effectuer les mesures suivantes de ApH un essai dans lequel des ports A, B, et C sont utilisés pour mener une expérience, suivie par une injection HCl à Port D. Comme dans le tableau 2, quatre répétitions techniques sont utilisé pour générer chaque point d'une courbe standard de 5 points dans les 20 puits expérimentaux (à l'exclusion des puits de correction de température de quatre de fond) de la plaque de flux extracellulaire de dosage.

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Tableau 2. injection HCl simple dans un test de flux extracellulaire bien.

2. Mesurer Buffering alimentation Utilisation d'un pH-mètre externe

NOTE: Pour mesurer le pouvoir tampon d'un support en utilisant une sonde de pH externe, étalonner la sonde à 37 ° C et maintenir cette température pendant tous les réactifs pendant l'expérience.

1. Préparer 0,1 M HCl norme dans l'eau en utilisant du HCl concentré selon les instructions du fabricant.
2. Chaud sonde de pH, les normes de pH, le milieu de dosage dont le pouvoir tampon est à mesurer, et du HCl 0,1 M à 37 ° C dans un bain d'eau.
3. Calibrer sonde de pH à 37 ° C selon les instructions du fabricant. Maintenir tous les réactifs à 37 ° C tout au long de l'essai en utilisant une plaque chauffante ou un bain d'eau.
4. Aliquote de 10 ml du milieu d'essai dans un petit bêcher ou un tube conique. Contrôler le pH en continu en utilisant une sonde de pH immergé.
5. Ajouter HCl 0,1 M comme à ladire en 10-20 aliquotes pi de milieu.
   1. Assurer le mélange à l'aide d'une barre d'agitation ou par tourbillon manuellement le conteneur après chaque addition d'acide.
   2. Attendre quelques secondes pour la mesure du pH pour stabiliser, puis enregistrer le pH après chaque addition.
   3. Comme le montre le tableau 3, faire un nombre suffisant d'ajouts pour assurer calcul de pente précis et pour couvrir la gamme de pH attendu pendant l'expérience.

Tableau 3. Mesure de la puissance de mise en mémoire tampon en utilisant un pH-mètre. Les données représentent une expérience typique avec six additions de 20 ul de HCl 0,1 M.

6. Plot ApH contre nmol ajouté par ^H + 7 ul, ce qui donne une pente linéaire qui représente le pouvoir tampon (Figure 1).

Figure 1. Déterminer pouvoir tampon. HCl courbe d'étalonnage mesurée comme dans le tableau 1, le tableau 2 ou (ici) comme dans le tableau 3. La pente de la courbe en forme linéaire donne le pouvoir tampon (pH / nmol ^H + dans 7 ul). Chaque point représente moyenne ± SEM de n = 9 répétitions techniques.

7. Une fois que le pouvoir tampon est connu par la méthode 1 ou 2 ci-dessus, convertir le signal de ECAR (mph / min) à PPR (pmol ^H + / min / protéine ug) en divisant ECAR par la puissance mise en mémoire tampon (BP) (MPH / pmol ^H +) mise à l'échelle et à la teneur en protéine de chaque puits:
   PPR _tot (pmol H ⁺ / min / pg de protéine) = ECAR (mph / min) / BP (mph / pmol H ^{+ à} 7 pi) / protéines par puits (pg) L'équation 6
8. Sinon, utilisez les mêmes expériences dans la méthodes 1 ou 2 pour calculer la capacité tampon (BC) valeur utilisée par le logiciel de l'appareil pour calculer automatiquement PPR lors de la collecte de données.
   REMARQUE: L'utilisateur de l'instrument manuel ¹² (page 107) fournit des informations détaillées sur le calcul et l'utilisation de la capacité tampon, où BC est décrit comme
   BC (mol / L) = moles H ⁺ / (ApH x volume tampon (L)) L'équation 7
   NOTE: Le pouvoir tampon tel que défini dans l'équation 7 peut être calculée dans les essais de l'instrument ou de la sonde de pH externe décrites ci-dessus. Conversion entre pouvoir tampon capacité tampon et se fait facilement (voir tableau joint):
   BC = 1 ^x 10 -9 / BP ((mph / pmol H ^{+ à} 7 pi) / 7 pi) de l'équation 8
   NOTE: Si connue avant d'effectuer le test, la capacité tampon peut être entré directement dans le logiciel de l'appareil lors de l'installation expérimentale.
9. Appliquer cette procédure et les calculs utilisés ci-dessus pour la plupart des systèmes tampons classiques, comme décrit dans la publication précédente ^6.
   NOTE: Le tableau 4 donne la liste de pouvoir tampon capacité tampon et de plusieurs médias conventionnels.

Tableau 4. pouvoir tampon et la capacité de mise en mémoire tampon des médias sélectionnés.

3. Réalisation d'une extracellulaire Flux dosage utilisant cellules C2C12 de myoblastes

NOTE: Dans l'étape 3.4.3, il n'y avait pas de différences observées dans _CO 2 -derived production d'acide dépend de la présence de l'anhydrase carbonique dans la culture C2C12, suggérant que sa présence ne soit pas nécessaire pour la conversion complète de CO _{2 à HCO} 3 ^- H + ^+. Cependant, tester empiriquement ce dans différents systèmes expérimentaux est recommandé avant omanhydrase carbonique itting.

1. Culture souris C2C12 de myoblastes ¹³ à 37 ° C sous 95% d'air / _5% de CO2 dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec du glucose 11,1 mM, 2 mM de glutamine, 10% en volume de sérum / v bovin fœtal (FBS), 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine.
2. 24 h avant l'essai, les cellules plaque / graines dans 100 ul du même milieu de culture à 20.000 cellules / puits dans une plaque de dosage à 24 puits en polystyrène flux extracellulaire (voir Matériels et Méthodes) sans revêtement supplémentaire.
3. Diluer oligomycine, FCCP, et la roténone, plus myxothiazol et HCl (en option) à 10x concentration finale dans Krebs Ringer phosphate HEPES (KRPH) milieu de dosage (2 mM HEPES, NaCl 136, 2 mM NaH _{2 PO 4} mM, KCl 3,7, 1 _mM de MgCl2, 1,5 _mM de CaCl2, 0,1% p / v d'albumine de sérum bovin gras-acide, pH 7,4 à 37 ° C).
4. La préparation des cellules
   1. 30 min avant le test, laver les cellules adhérentes trois fois en aspirant à GEretirer ntly le moyen du puits, puis en ajoutant lentement 500 KRPH ul.
   2. Incuber les cellules après l'étape de lavage troisième à 37 ° C sous air (pas moins de 5% de CO _2, ce qui modifiera le pH de ce milieu exempt de bicarbonate).
   3. Au début de l'essai, remplacer KRPH dans les puits avec 500 pi KRPH frais contenant anhydrase carbonique 500 U / ml et soit du glucose (10 mM) ou seulement moyen, sans substrat supplémentaire.
5. Chargement de la cartouche du capteur
   1. Pipet 50 aliquotes de chaque composé 10x préparé à l'étape 3.3 dans les ports d'une cartouche extracellulaire flux de capteur comme suit (concentrations finales dans les tests ainsi donnés) de la cartouche: Port A: 2 pg / ml oligomycine, Port B: 0,5 uM FCCP, Port C : roténone 1 uM, 1 uM myxothiazol, Port D: HCl (si l'exécution d'une calibration in-dosage de l'acide comme décrit ci- dessus et dans le tableau 2).
      NOTE: dans le but d'une inhibition complète de la chaîne respiratoire décrit ici, 1 pm mesxothiazol peut être utilisé de manière interchangeable avec 1 uM antimycine A.
6. Extracellulaire dosage flux:
   1. Effectuez un test de flux extracellulaire standard pour la détermination du contrôle respiratoire comme décrit dans ^10.

NOTE: Pour chaque segment de l'expérience, de déterminer la combinaison, attendez, et les temps de mesure souhaitée, ainsi que le nombre de cycles par segment.

REMARQUE: Les données du tableau 5 ont été recueillies au cours de deux cycles de dosage de 2 min mix, 1 minutes d'attente, et à 5 min mesure pour chaque segment, avec trois cycles d'essai se produisant après l'addition du port D de différentes quantités de HCl (pour l'étalonnage de la mémoire tampon puissance comme dans le Tableau 2).

Tableau 5. configuration de test flux extracellulaire.

4. DE MESUREFin ng-point de la concentration de lactate

Remarque: Afin de valider le test indirect décrit ici dans un système différent, le point extrémité concentration de lactate à la fin d'une expérience de flux extracellulaire peut être déterminée directement dans une plaque à 96 puits classique par mesure de la vitesse initiale (plus de 2 minutes) de réduction de NAD ⁺ NADH → catalysée par la lactate déshydrogénase, décrit en détail dans notre publication préalable ^6. Pour les données présentées dans Les résultats représentatifs, la concentration de lactate de point final dans les puits d'essai contenant du glucose était ~ 40 pm.

1. Préparer moyen d'hydrazine 2x: 1 M de Tris, 20 mM d'EDTA, 400 mM d'hydrazine à pH 9,8 à 22 ° C). Immédiatement avant le début de l'essai, ajouter NAD ⁺ 4 mM de lactate déshydrogénase et (LDH) à 40 U / ml. Composition de milieu d'essai final (1x): 500 mM de Tris, 10 mM d'EDTA, 200 mM d'hydrazine, 2 mM de NAD ^+, 20 U / ml de LDH.
2. Immédiatement après le dosage flux extracellulaire, retirer 100pi de milieu de dosage de chaque puits de la plaque de dosage flux extracellulaire et le transfert à un puits d'une opaque (noir) plaque de 96 puits.
3. Pour chaque échantillon, ajouter 100 pi 2x moyen d'hydrazine.
4. Charger immédiatement la plaque dans un lecteur de microplaques et de commencer à surveiller la fluorescence de NADH à 340 nm d'excitation / émission à 460 nm.
5. Enregistrer la vitesse initiale d'environ 2 min.
6. Exécuter une expérience similaire à construire une courbe d'étalonnage en traçant la vitesse initiale de la concentration de lactate pour des concentrations de lactate ajoutés de 0 à 50 uM.
7. Calculer la concentration de lactate dans chaque puits expérimental utilisant la courbe standard.

5. Mesure Teneur en protéines

1. Retirer le reste de milieu d'essai à partir de chaque puits de la plaque de dosage.
2. Laver les puits trois fois avec 250 ul KRPH libre-BSA, en prenant soin de minimiser le délogement des cellules de la surface de fond de puits.
3. Ajouter 25 ul lyse RIPAmoyen (NaCl 150 mM, Tris 50 mM, EGTA 1 mM, EDTA 1 mM, 1% v / v de Triton X-100, 0,5% p / v de désoxycholate de sodium, 0,1% v / v de SDS, pH 7,4 à 22 ° C) à chaque puits de la plaque de dosage.
4. Incuber la plaque sur de la glace pendant 30 min.
5. Agiter la plaque sur un agitateur de plaque à 1200 rpm pendant 5 min.
6. Mesurer la concentration de protéines par des procédés classiques, par exemple par dosage BCA, en veillant à ce que la composition du tampon de lyse est compatible avec la méthode de mesure. La teneur en protéines dans l'expérience sur la figure 2 était d'environ 4 ug / puits.

Résultats

La figure 2 montre les données brutes d'une expérience typique. Les 10 derniers points de l'enregistrement à la fois de l'OCR et le pH (ombragée barres verticales) point-à-point de mesure ont été utilisés pour les calculs. Les préoccupations initiales que la valeur moyenne (de mesure de point milieu) de chaque cycle de dosage ne fourniraient pas une résolution suffisante des tarifs pour un calcul précis, d'autant plus qu'il semblait y avoir un léger décalage entre l'addition de port et le taux d'acidification de l'état d'équilibre, ont été pas confirmée, que cela ne semble pas contribuer de manière significative à des erreurs de calcul (non représenté). Alternativement, si la capacité tampon correct est entré lors de l'installation expérimentale, PPR peut être lue directement à partir de la lecture de la collecte des données de l'instrument en affichant la sortie PPR dans le logiciel de l'appareil ou dans le format compatible PC disponible en tant que l'un des paramètres de sortie de données.

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Figure 2. Le représentant des traces de flux extracellulaires de _O 2 et H ^+. OCR pH et des traces de l'exemple expérience dans le tableau 5, contenant 10 mM de glucose en début d'essai. Port D a différentes concentrations de HCl pour l'étalonnage de la puissance de mise en mémoire tampon (non représentée sur ces traces moyennées). Les données de la publication précédente ^6. Chaque point représente moyenne ± SEM de n = 8 répétitions biologiques. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

L'analyse des données des résultats représentatifs

Utilisation de la feuille de calcul indiqué dans le tableau 6 et fourni en pièce jointe, les valeurs des données de puits individuels peuvent être entrés dans les colonnes affichées avec en-têtes jaunes. Les six colonnes à le droit sont calculées à partir de ces entrées. L'exemple dans le tableau 6 montre les calculs de PPR et _{resp Glyc} PPR utilisant ECAR et les données OCR des puits individuels pour les conditions natives avec ou sans glucose ajouté, avant Port A plus de oligomycine. Répétitions techniques sur chaque préparation biologique sont normalement la moyenne pour donner des valeurs uniques des sorties dans les quatre dernières colonnes, les données provenant de différentes préparations biologiques sont en moyenne à la propagation appropriée des statistiques d'erreur dans BP et ces quatre valeurs.

Tableau 6. Calcul de l'appareil respiratoire et de l'acidification de la glycolyse. Colonnes intitulées en jaune indiquent valeurs à entrer de calcul (par exemple, BP, max ^H + / O _2), ou à partir de la collecte de données (par exemple, l'ECAR _tot, OCR). ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table |. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce tableau comme une feuille de calcul Excel .

Contributions de la glycolyse et la respiration à PPR après correction

La figure 3 montre la sortie graphique des données calculées comme dans le tableau 6 pour les débits en natif de l'acidification glycolytique et respiratoire, les taux suivants oligomycine plus (Port A), et les taux suivants plus FCCP (Port B). Ces données démontrent clairement comment les proportions du changement d'acidification respiratoire et de la glycolyse avec choix du substrat (glucose par rapport au témoin (CTL) avec aucun ajoutés) et avec le statut mitochondrial (fonction native vs fonction pharmacologiquement altérée).

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Figure 3. Taux Proton de production (PPR) à partir de sources de la glycolyse et respiratoires. PPR provenant de la respiration (Les parties ouvertes) et de la glycolyse (des parties remplies) des cellules C2C12 calculées selon l'équation 5 avec du glucose ajoutée (trois barres de gauche) ou sans glucose ajoutée (trois barres à droite). Les données de ^six. Toutes les données représentent la moyenne ± SEM de n = 8 répétitions biologiques.

Discussion

Acidification extracellulaire est une indication facilement mesurée du taux métabolique cellulaire. Pour déterminer correctement le taux de glycolyse cellulaire (tel que défini par la production de lactate), il est essentiel de connaître le pouvoir tampon du milieu de dosage, et pour convertir les mesures de flux extracellulaires de la consommation d'oxygène et l'acidification Proton taux de production. En effectuant ce calcul, l'acidification résultant de _CO 2 libéré dans le cycle de l'acide citrique peut être soustrait, en laissant l'acidification qui résulte de la production de lactate.

Les multiples façons différentes données ici pour mesurer la puissance de tampon pour cette correction portent différents avantages et inconvénients. Mesure externe à l'aide d'une sonde de pH est très précise et reproductible, mais peut ne pas refléter de petites différences dans la détection de pH introduit par les fluorophores contenus dans la plaque de dosage, l'addition de composés au cours de l'essai, ou la présence de til cellules elles-mêmes. Le mesures de pH traitent en plaque ces questions, mais aussi introduire des degrés variables de bruit expérimental.

La correction de CO _{2 à} l'ECAR permet pour la première fois le calcul sans équivoque et quantitative des taux de la glycolyse, et révèle la variation de la contribution respiratoire et glycolytique ECAR totale au cours d'une expérience. En utilisant l'équation 5 et les mesures d'OCR, ECAR, et le pouvoir tampon, le taux de la glycolyse peut être calculée en utilisant la simple feuille de calcul fournie (tableau 6). Ce taux peut être vérifiée par la mesure de lactate post-hoc si désiré ^6. Dans les cellules où la voie des pentoses phosphates est hautement actif, l'utilisation d'inhibiteurs de la voie tels que le 6-aminonicotinamide peut être utile d'isoler taux glycolytique. Calcul de la contribution de chacun de CO ₂ ^- et le lactate dérivé H ⁺ du total mesurées extra cellulaire acidification Coter et oxygène consommatTaux d'ions est un outil précieux pour l'utilisation des données de flux extracellulaires de faire des déclarations puissantes et quantitatives sur l'activité métabolique.

En utilisant les procédures décrites ici, y compris les diverses modifications pour mesurer la puissance de tampon, et l'optimisation de l'expérience flux extracellulaire pour les cellules visées par l'enquête et les données souhaitées, le taux de glycolyse dans des cellules intactes peut être quantifiée dans une large gamme de conditions expérimentales. Ce procédé est limité à des cellules qui peuvent croître en culture adhérente (ou sur des cellules ou organites qui peuvent être respectées) une surface de polystyrène. Il est le plus fiable lorsque les cellules cultivées sont homogènes et confluentes, bien que les données utiles peuvent encore être obtenues sur une plage de ces conditions. Les calculs nécessitent une certaine connaissance du métabolisme des cellules, comme Max H ⁺ / O _{2 gammes} de 0,65 à 1,0 pour l'oxydation complète de différents substrats et plus pour oxydation partielle ^6, cependant, si les cellules sont known à oxyder le glucose, une valeur de 1,0 peut être présumée.

Bien pertinente à tous caractérisation métabolique, ce procédé peut être particulièrement utile lorsqu'il est utilisé dans des systèmes dans lesquels un décalage entre le métabolisme respiratoire et glycolytique pour maintenir l'approvisionnement en ATP cellulaire est un phénotype critique, y compris la caractérisation de cellules souches et de cellules cancéreuses dérivées de tumeurs. La compréhension des modifications de contrôle métabolique dans ces contextes et d'autres permettra à un plus grand degré de sophistication et la précision dans la conception expérimentale et l'analyse de ces types de cellules.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pherastar FS	BMG	n/a	lecteur de microplaques
Seahorse XF-24	Seahorse Bioscience	n/a	instrument de flux extracellulaire
Seahorse XF plaque de dosage Seahorse	Bioscience	V7-PS	consommable
XF Calibrant	Seahorse Bioscience	100840-000	solution
HCl standard	Sigma	38280	chimique
oligomycine	Sigma	O4876	produit chimique
FCCP	Sigma	C2920	produit chimique
Rotenone	Sigma	R8875	produit chimique
Myxothiazol	Sigma	T5580	produit chimique
DMEM	Corning	10-013-CV	moyen
composant FBS	Corning	35-010-CV	milieu composant
pénicilline/streptomycine	Corning	30-002-CI	composant moyen
anhydrase carbonique	Sigma	C2624	produit chimique
Plaque de dosage à 96 puits	Corning	CLS3991	consommable
NAD+	Sigma	N7004	produit chimique
LDH	Sigma	L1254	produit chimique