Un air sec Chromosome Dropping rapide Méthode de préparation adéquate pour les poissons dans les usines

Résumé

Un protocole est décrit pour la préparation de disséminations de chromosomes végétaux mitotiques de haute qualité par une méthode de largage rapide à sec à l’air adaptée à la détection FISH de sondes d’ADN à copie unique et à copie élevée.

Résumé

Préparation des étalements de chromosomes est une condition préalable à l'exécution réussie de hybridation in situ en fluorescence (FISH). Préparation des chromosomes de la plante spreads de haute qualité est difficile en raison de la paroi cellulaire rigide. L'un des procédés approuvés pour la préparation des chromosomes de la plante est une préparation dite chute, également connu en tant que goutte d'étalement ou d'une technique de séchage par air. Ici, nous présentons un protocole pour la préparation rapide du chromosome mitotique propage approprié pour la détection du poisson de sondes d'ADN copie unique et haute. Cette méthode est une variante améliorée de la méthode de la goutte sécher à l'air réalisée sous une humidité relative de 50% -55%. Ce protocole comprend un nombre réduit d'étapes de lavage rendant son application facile, efficace et reproductible. Avantages évidents de cette approche sont bien étalées, chromosomes métaphasiques endommagées et de nombreux siégeant en tant que condition préalable idéale pour l'analyse FISH succès. En utilisant ce protocole, nous avons obtenu chrome de haute qualitéOSOME spreads et les résultats de FISH reproductibles pour Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum et Secale céréale.

Introduction

Hybridation fluorescente in situ (FISH) est un outil efficace pour la cartographie physique des séquences à copie unique et élevés au niveau chromosomique. La condition préalable est la préparation du chromosome spreads de haute qualité. Il n'y a pas chromosome protocole général de préparation qui serait également approprié pour des cellules animales et végétales. Préparation des chromosomes de plantes est particulièrement difficile en raison de la paroi cellulaire rigide et divers de consistance à l'intérieur du cytoplasme des espèces différentes. L'un des procédés avantageux pour la préparation des chromosomes de la plante est une tech....

Protocole

1. Préparation Chromosome

1. La germination des graines et la fixation des extrémités des racines
   1. Germer les graines d'orge 10-20 sur deux couches de papier filtre humide dans une boîte de Petri dans des conditions sombres pendant 2 jours à 22-24 ° C. Couper les racines vigoureuses avec la longueur de 1-2 cm de la graine en utilisant une lame de rasoir.
   2. Préparez de l'eau glacée en plaçant une bouteille en verre de 500 ml contenant de l'eau froide du robinet dans l'eau glacée écrasé. Aérer l'eau glacée et plongez pointes des racines pendant 20 heures pour augmenter la fréquence des cellules en métaphase.
   3. Transfe....

Résultats

Lames microscopiques avec les écarts de métaphase de mitose ont été préparés par la méthode rapide de l'air sec chute chromosome préparation décrit ci-dessus (Suppl. Figure 1). Analyse FISH a été réalisée en utilisant les deux, des séquences répétitives et une seule copie. Les images ont été obtenues par un microscope à épifluorescence avec un ensemble de filtres permettant d'excitation des fluorophores et correspondant captés par la caméra CCD monochrome une haute sensibilité. Pour l'acquis.......

Discussion

L'expérience de préparation du chromosome a été réalisée en utilisant jeunes racines de céréales appartenant à la famille des graminées (Poaceae). Toutes les espèces analysées ont 14 chromosomes métaphasiques relativement longue de la mitose (11-15 um) dans l'ensemble du génome diploïde et appartiennent à des espèces grand génome (05.01 à 07.09 GBP).

Longueur des racines germées était pas plus de 2 cm pour obtenir un maximum de tissu méristématique. La synchronisation des cellules en.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque chauffante	MEDAX GmbH	12603
Cellulase R10	Duchefa	C8001
Cellulase  ;	CalBioChem	219466
Pectolyase	Sigma	P3026
Cytohelicase	Sigma	C8274
Texas Red-12-dUTP	Invitrogen	C3176	fluorochrome direct  ;
Fluor488-5-dUTP	Invitrogen	C11397	fluorochrome direct  ;
Microscope à fluorescence	Olympus BX61	BX61
Caméra CCD	Orca ER, Hamamatsu	C10600
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)  ;	Vector Laboratories	H-1200	colorant fluoré