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Article de méthode

Orthotopique Hind Limb transplantation chez la souris

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DOI :

10.3791/53483

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12 février 2016

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1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Laboratory, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Visceral, Transplant and Thoracic Surgery, Innsbruck Medical University, 3Center for Vascularized Composite Allotransplantation, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Chang Gung Memorial Hospital and School of Medicine, 4Department of General, Visceral and Transplant Surgery, Charite Berlin

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce modèle de roman pour arrière orthotopique branche transplantation chez la souris, l'application d'une technique de brassard non-suture pour anastomose super-microvasculaire, fournit un outil puissant pour la recherche immunologique mécanique in vivo concernant une allotransplantation composite vascularisée (VCA).

Résumé

Les systèmes de modèles animaux in vivo, et en particulier les modèles murins, sont devenus des outils scientifiques puissants et polyvalents indispensables à la recherche fondamentale et translationnelle dans le domaine de la médecine de transplantation. Une vaste gamme de réactifs est disponible exclusivement dans ce contexte, y compris des anticorps monoclonaux et polyclonaux pour des applications diagnostiques et interventionnelles. De plus, un grand nombre de souches génotypées, consanguines, transgéniques et knock-out permettent une étude détaillée des contributions individuelles des composants humoraux et cellulaires à l’interaction complexe d’une réponse immunitaire et font de la souris l’étalon-or de la recherche immunologique.

L’allotransplantation composite vascularisée (VCA) délimite un nouveau domaine de transplantation utilisant des allogreffes pour remplacer les « semblables » chez les patients souffrant de perte de tissu traumatique ou congénitale. Ce protocole méthodologique chirurgical montre l’utilisation d’une technique de brassard sans suture pour l’anastomose super-microvasculaire dans un modèle de transplantation orthotopique de membre postérieur de souris. Le modèle permet spécifiquement de comparer les paradigmes établis dans le domaine de la transplantation d’organes solides avec une nouvelle forme de transplantation composée de divers composants tissulaires différents. De manière unique, ce modèle permet la transplantation d’un compartiment et d’une niche de moelle osseuse vascularisés viables qui ont le potentiel d’exercer un effet bénéfique sur l’équilibre entre l’acceptation et le rejet immunitaires. Cette technique fournit un outil pour étudier la reconnaissance des alloantigènes et le rejet et l’acceptation des allogreffes, et permet la poursuite d’études sur la régénération nerveuse fonctionnelle pour faire progresser ce nouveau domaine de la transplantation.

Introduction

La fin des années quatre-vingt-dix a marqué le début de la transplantation reconstructive avec la première greffe de main réussie réalisée en France en 1998. Depuis lors, l’utilisation des VCA pour la reconstruction d’anomalies tissulaires dévastatrices a été utilisée avec succès chez un large éventail de patients. À ce jour, le monde compte 76 destinataires de 112 membres supérieurs ainsi que 31 visages 1-3. De plus, plusieurs autres types d’ACV tels que la paroi abdominale 4, le larynx 5, la trachée 6, les articulations vascularisées 7 et même le pénis 8 ont été réalisés. De plus, la naissance vivante d’un bébé a récemment été signalée après une transplantation d’utérus 9. Cette expérience mondiale croissante est révélatrice de la façon dont la transplantation reconstructive est devenue une option thérapeutique valable pour les patients souffrant d’anomalies tissulaires fonctionnelles importantes qui ne se prêtent pas à la chirurgie et au traitement reconstructifs et restaurateurs conventionnels.

Bien que l’idée de remplacer le « semblable par un semblable » ait suscité l’enthousiasme clinique, le scepticisme initial prévaut toujours en ce qui concerne les effets secondaires de l’immunosuppression conventionnelle à forte dose nécessaire pour maintenir les allogreffes et leur fonction 10,11. Cependant, comme le montrent les travaux fondamentaux de Lee et al., ces greffes composites sont moins susceptibles d’être rejetées que leurs composants individuels, et en outre, certains des composants tissulaires tels que le compartiment osseux vascularisé ont alimenté l’optimisme car ils pourraient exercer des effets immunologiques uniques sur l’équilibre de l’acceptation et du rejet immunitaires 12.

Notre groupe a été le pionnier de plusieurs modèles animaux microchirurgicaux pour la transplantation d’organes solides, ainsi que pour l’allotransplantation composite vascularisée 13-19. Nous décrivons ici une nouvelle intervention chirurgicale utilisant une technique de brassard sans suture pour réaliser une anastomose super micro-vasculaire dans un modèle de transplantation orthotopique de membre postérieur de souris. Ce modèle de transplantation fournit un outil utile pour étudier les mécanismes d’acceptation et de rejet immunitaires, ainsi que le rôle des composants tissulaires individuels, tels que la moelle osseuse vascularisée, dans l’induction de la tolérance dans le cadre immunologiquement polyvalent de l’espèce de souris. De plus, le placement orthotopique du membre ouvre des possibilités pour la régénération nerveuse et les études de résultats fonctionnels, qui sont d’une importance cruciale pour le cadre de l’ACV.

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Protocole

Toutes les expériences ont été menées en conformité avec le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire de l'Institut national de la santé (NIH) et ont été approuvés par le Comité de l'Université Johns Hopkins animal soin et l'utilisation (JHUACUC). Les procédures spécifiques ont été réalisées dans le cadre du protocole de MO13M108 de ACUC approuvé.

Opération 1. des donateurs

  1. Administrer une analgésie au point de temps approprié pour chaque formulation pharmacologique avant la chirurgie. Conformément à la protection des animaux et l'utilisation approuvée protocole utilisé 0,1 mg / kg de poids corporel de la buprénorphine sous-cutanée 1 heure avant l'incision de la peau.
  2. Sedate le donateur à l'isoflurane appliquée à travers une chambre attachée à un vaporisateur isoflurane à 4%; maintenir la sédation et anesthésie à 2% grâce à un cône de nez. Effectuer orteil retrait de pincement réflexion pour contrôler la profondeur de l'anesthésie avant l'ouverture de la procédure.
  3. Porter des masques, des blouses d'isolation jetables et des gants.
  4. Raser les ar chirurgicaleEA, en particulier le membre postérieur et à l'aine, et préparation avec 10% Povidone - iode.
  5. Utilisez un drap de champ stérile, instruments autoclave et d'un microscope à fort grossissement (40X).
  6. Faire l'aine incision de la peau avec des ciseaux proximale à la zone mi-cuisse et la circonférence connecter l'incision à la démarcation de la patte postérieure du reste du corps de la souris.
  7. Identifier et disséquer l'artère fémorale, la veine et le nerf. Séparer les trois structures à l'aide de pinces et de micro-ciseaux.
  8. Une fois que le pédicule est disséqué diviser les vaisseaux au niveau du ligament inguinal au moyen de micro ciseaux.
  9. Ensuite, continuer à diviser les différents ventrales (gracilis et muscles de la cuisse médiale) et les groupes de muscles dorsaux 20 de manière proximale au niveau de la mi-cuisse pour séparer le greffage de l'animal donneur avec des ciseaux.
  10. Transect fémur et couper au milieu de la diaphyse fémorale à l'aide de ciseaux.
  11. Euthanasier des animaux par fol surdosage isofluranemugissaient par dislocation cervicale. Confirmez cessation des battements du cœur et de la respiration.
  12. Rincer la branche avec 2 ml héparinisés (30 IE) froide (4 ° C) une solution saline en utilisant une aiguille de calibre 33 de chasse monté sur une seringue (voir tableau des matériaux).
  13. Placer un brassard de polyimide sur la veine fémorale et l'artère, respectivement.
  14. Enveloppez greffe dans de la gaze de coton humide, placer dans un plat de Pétri et conserver à 4 ° C jusqu'à ce médaillon.

2. Bénéficiaire Opération

  1. L'enlèvement de la patte postérieure
    1. Administrer une analgésie au point de temps approprié pour chaque formulation pharmacologique avant la chirurgie. Conformément à la protection des animaux et l'utilisation approuvée protocole utilisé 0,1 mg / kg de poids corporel de la buprénorphine SC 1 heure avant l'incision de la peau.
    2. Sedate le donateur à l'isoflurane appliquée à travers une chambre attachée à un vaporisateur isoflurane à 4%; maintenir la sédation et anesthésie à 2% grâce à un cône de nez. Effectuer orteil retrait de pincement réflexion pour surveiller le depth de l'anesthésie avant l'ouverture de la procédure.
    3. Utilisez pommade vétérinaire sur les yeux de la souris pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
    4. Raser la zone chirurgicale, en particulier le membre postérieur et à l'aine et préparation avec 10% Povidone - iode.
    5. Faire l'aine incision de la peau avec des ciseaux proximale à la zone mi-cuisse et la circonférence connecter l'incision à la démarcation de la patte postérieure du reste du corps de la souris.
    6. Identifier et disséquer l'artère fémorale, la veine et le nerf et séparer les trois structures à l'aide de pinces et de micro-ciseaux.
    7. Une fois que le pédicule est disséqué, serrer les vaisseaux fémoraux au niveau du ligament inguinal.
    8. Couper les vaisseaux distale au niveau de l'artère épigastrique superficielle.
    9. Ensuite, continuer à diviser les différents ventrales (gracilis et muscles de la cuisse médiale) et les groupes de muscles dorsaux 20 de manière proximale au niveau de la mi-cuisse pour séparer l'arrière li nativemb des animaux receveurs avec des ciseaux.
    10. Transect du fémur dans le milieu de la diaphyse fémorale à l'aide de ciseaux.
    11. Cautériser muscles de la cuisse précédemment sectionnés pour prévenir les saignements du site de dissection et donc destinataire perte de sang.
  2. Implantation
    1. Minimiser la perte de liquide par l'irrigation du champ opératoire avec une solution saline chaude (37 ° C) et l'injection de 0,3 ml de solution saline chaude avant et après l'opération.
    2. Placez la greffe d'une manière qui reflète la position anatomique précise de la patte arrière natif en alignant le fémur du destinataire et la greffe et de les connecter en utilisant une aiguille spinale 20 G comme une tige intramédullaire.
    3. Coapt les Groupes musculaires ventrales et dorsales en utilisant du matériel de suture absorbable (6-0 Polysorb).
    4. Connecter les vaisseaux fémoraux en utilisant la technique du brassard non-suture; en détail, tirer du côté du destinataire du navire au cours des poignets montés préalablement sur le navire extrémités du graft. Utilisez un Nylon suture 10-0 et effectuer une cravate circonférentielle de fixer le navire bénéficiaire sur le brassard.
    5. libérer Suivant les pinces. A ce stade, vérifier visuellement la rotation de la coiffe et un positionnement optimal pour empêcher une mauvaise rotation et de déformation des récipients.
    6. Effectuer hémostase méticuleuse utilisant cautérisation électro avec un accent particulier sur l'interface des donateurs bénéficiaire musculaire et les extrémités osseuses.
    7. Fermez la peau en utilisant des sutures en nylon non résorbables (6-0 Ethilon).
    8. Établir des conditions normothermiques en permettant à l'animal dans sa cage récupérer sous une lampe chauffante. Poursuivre la surveillance régulière pendant au moins 4 heures avant de le retourner à l'installation de logements.
    9. Une analgésie post-opératoire avec la buprénorphine à la dose de 0,1 mg / kg SC toutes les 6-8 heures pendant 3 jours.

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Résultats

Effectuer allotransplantation composite vascularisée dans un modèle de souris à l'aide d'une technique non-suture manchon permet d'obtenir une excellente et de longue greffon à long terme et des animaux survie comme le montre la Figure 1. De plus, il représente une méthode fiable pour l'obtention de résultats reproductibles de rejet d'allogreffe progressive de composite vascularisée allotransplantation tel que documenté par les images de la fi...

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Discussion

Vascularisée composite allotransplantation, comme extrémité supérieure et le visage transplantation pour la reconstruction de défauts tissulaires dévastatrices, a évolué comme une option de traitement valable pour les patients non modifiables de procédures de reconstruction classiques. Les progrès techniques dans le domaine de la microchirurgie reconstructive ainsi que d'une vaste expérience avec immunosuppresseur puissant et thérapies modulatrices immunitaires dans la transplantation d'organes solides, permet d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêt financier concurrent.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par l'armée, la marine, NIH, Armée de l'Air, VA et des affaires de santé pour soutenir l'effort AFIRM II, sous Award No. W81XWH-13-2-0053. L'armée américaine Research Acquisition activité médicale, 820 Chandler Street, Fort Detrick MD 21.702 à 5014 est le bureau d'acquisition attribution et l'administration. Les opinions, les interprétations, conclusions et recommandations sont celles de l'auteur et ne sont pas nécessairement ceux proposés par le ministère de la Défense.

Les auteurs tiennent à remercier Jessica Izzi, DVM, Caroline Garrett, DVM et Julie Watson, DVM pour leur excellent soutien vétérinaire au cours de cette étude.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Suture, suture 6-0 nylonMWI31849
, suture 6-0 PolysorbMWI72667
, 10-0 NylonAero SurgicalTK-107038
Tubulure en polyimide, taille 25Vention Medical141-0023
Tubulure en polyimide, taille 27Vention Medical141-0015
Pinces microvasculaires (simples)Synovis00396
Pinces microvasculaires (doubles)Synovis00414
Micro-ciseauxSynovisSAS-18
Micro-pincesSynovisFRS-15 RM-8
Micro-dilatateursSynovisFRS-15 RM-8D.1
Micro-Aiguille-EntraînementSynovisC-14
Applicateur Micro-ClampSynovisCAF-4
Micro-Flushing NeedleHamilton10MM, 30° ;, 33G
Lactate Ringers SolutionFisher ScientificNC9968051
BuprénorphineNuméro DEA requis ; Obtenu de la pharmacie hospitalière.
Enrofloxacine ; Baytril BayerHealth Care186599
Héparine Obtenue d’unepharmacie hospitalière

Références

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