Article de méthode

Une approche semi-automatique pour la préparation des anticorps Cocktails pour immunophénotypique Analyse de sang périphérique humain

13.3K vues

⸱

DOI :

10.3791/53485

⸱

8 février 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Human Immune Monitoring Laboratory, Earle A. Chiles Research Institute, Providence Cancer Center, Providence Portland Medical Center, 2Sony Biotechnology, 3Beckman Coulter, Inc. Life Sciences, 4Bristol-Myers Squibb

Dans cet article

Résumé

Sang total L’immunophénotypage est indispensable pour surveiller le système immunitaire humain. Cependant, le nombre de réactifs nécessaires et l’instabilité de fluorochromes spécifiques dans les cocktails prémélangés nécessitent une préparation quotidienne des réactifs. Nous montrons ici que la préparation semi-automatisée d’un cocktail d’anticorps de coloration permet d’établir un immunophénotypage fiable en minimisant la variabilité de la distribution des réactifs.

Résumé

Immunophénotypage de sang périphérique par cytométrie de flux détermine des changements dans la fréquence et l'activation des leucocytes périphériques état pendant la maladie et le traitement. Il a le potentiel de prédire l'efficacité thérapeutique et à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Toute coloration du sang utilise sang non manipulée, ce qui minimise les artefacts qui peuvent se produire lors de la préparation de l'échantillon. Cependant, la coloration du sang total doit également être effectuée sur le sang fraîchement prélevé afin d'assurer l'intégrité de l'échantillon. En outre, il est préférable de préparer des cocktails d'anticorps sur le même jour pour éviter l'instabilité potentielle de TanDEM-colorants et d'empêcher l'interaction de réactif entre les colorants violets brillants. Par conséquent, la coloration de sang total nécessite normalisation soin de contrôler la variabilité intra et inter-expérimentale.

Ici, nous rapportons le déploiement d'un manipulateur de liquide automatisé équipé d'un à deux dimensions (2D) lecteur de codes barres dans un processus standard de fabrication Antibodcocktails y pour la cytométrie de flux. Des anticorps ont été transférés dans des tubes à code-barres 2D disposés dans un format à 96 puits et leur contenu compilées dans une base de données. Le manipulateur de liquide pourrait alors localiser les flacons d'anticorps source en faisant référence à des noms d'anticorps au sein de la base de données. Notre méthode éliminé coordination fastidieuse pour le positionnement des tubes d'anticorps source. Il a fourni une polyvalence permettant à l'utilisateur de changer facilement un certain nombre de détails dans le processus de distribution d'anticorps comme un anticorps spécifique à utiliser, le volume et la destination en modifiant la base de données sans avoir à réécrire le script de la méthode logicielle pour chaque test.

Une preuve de concept expérience réalisée exceptionnelle précision de dosage inter et intra, démontrée par la préparation d'une réplique 11 couleurs, l'écoulement de 17 anticorps essai de cytométrie. Ces méthodes ont augmenté le débit global de cytométrie en flux des essais et de faciliter la préparation quotidienne des cocktails d'anticorps complexes nécessaires pour le phéno détailléecaractérisation typic du sang périphérique anticoagulé fraîchement prélevé.

Introduction

Immunophénotypage de sang périphérique humain détermine changements quantitatifs et qualitatifs dans des sous-ensembles de cellules immunitaires 1. Il permet de mieux comprendre les mécanismes d'action et de résistance, aides découverte de biomarqueurs prédictifs, et facilite le développement d'immunothérapies combinés. Par conséquent, la validation et la normalisation des immunophénotypage est une zone de grand intérêt pour les chercheurs universitaires, des laboratoires cliniques, et les industries.

Bien immunophénotypage du sang périphérique par des méthodes de cytométrie en flux est actuellement utilisé pour la gestion clinique des hémopathies malignes 2,3 et le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) 4,5, immunophénotypage fiable de sang périphérique pour les demandes d'immunothérapie des considérations spécifiques à la validation et la normalisation, car il exige une couverture plus étendue sur des sous-ensembles de cellules immunitaires et l'activation / récepteurs inhibiteurs 1,6-8. succeimmunophénotypage ssful nécessite normalisation soin de minimiser la variabilité expérience à l'expérience liée à la configuration de l'instrument et la coloration des cellules procédure 9,10. Si la normalisation des paramètres de l'appareil pour la cytométrie en flux est bien établie pour traiter l'ancienne préoccupation 9,11,12, on ne sait pas comment minimiser la variabilité liée à la coloration des cellules, sans restreindre la couverture de sous-ensembles de cellules immunitaires et de leur état ​​d'activation.

Comme le nombre d'antigènes à détecter augmente, il en va de la possibilité d'erreur et la variabilité en raison des sous-optimale distribution de réactif et la contamination croisée. Méthodes d'analyse phenoptypic de sang total anticoagulé ont été établis à la fin des années 1980 pour une utilisation dans des essais de laboratoire clinique. Ces mêmes méthodes servent les besoins du laboratoire de recherche pour la préparation des échantillons. Surtout, les cocktails d'anticorps utilisés dans les laboratoires cliniques sont généralement moins complexe et avapré-titré ilable et pré-mélangée chez le fabricant. Un seul transfert du cocktail d'anticorps pré-mélangé est nécessaire. Dans le cadre de la recherche, des cocktails d'anticorps de 10-16 anticorps sont typiques. Chaque cocktail doit être validée pour la stabilité par le laboratoire ou fraîchement préparé avant chaque essai. Préparer plusieurs cocktails d'anticorps pour un échantillon pourrait entraîner le pipetage de 50-80 anticorps individuels, une tâche qui est à la fois fastidieux et source d'erreurs.

L'automatisation de la préparation du cocktail a plusieurs avantages par rapport à la préparation manuelle des cocktails tels que le moins d'erreurs, une plus grande précision de pipetage, et peut-être même diminué le gaspillage réactif. Nous rapportons ici l'introduction réussie d'un manipulateur de liquide automatisé équipé d'un à deux dimensions (2D) lecteur de code barre dans le processus cellulaire coloration des immunophénotypage pour minimiser la variabilité liée à la préparation des échantillons.

Protocole

Collecte et l'utilisation du sang périphérique dans ce protocole a été approuvé par la Providence Health Services Institutional Review Board. Tous les sujets humains à condition que leur consentement éclairé.

Remarque: Suivre les précautions. Tout le sang humain doit être traité comme si infectieux et manipulés conformément aux niveau de biosécurité 2 pratiques.

Remarque: L'immunophénotypage avec du sang total périphérique est effectuée en incubant le sang total anticoagulé avec des anticorps monoclonaux fluorescents étiqueté pour détecter des antigènes de surface des cellules, suivie d'une lyse hypotonique pour éliminer les globules rouges. Les cellules sont lavées et l'échantillon est analysé par un cytomètre de flux. Le procédé décrit dans ce document met l'accent sur la préparation d'un cocktail d'anticorps en utilisant le manipulateur de liquide automatisé équipé d'un lecteur de codes barres 2D. Tout d'abord, le «cocktail de base" qui identifie des sous-ensembles de cellules immunitaires et le "Cocktail d'activation" qui surveille inducible antigènes sont préparés séparément (tableau 1). Ensuite, les deux cocktails sont mélangés pour créer un "Cocktail Master anticorps". Voir Figure 1 pour le flux de travail.

1. Echantillon

  1. Prélever le sang périphérique par ponction veineuse dans un tube de collecte de sang coagulé de l'héparine de sodium, retourner doucement plusieurs fois pour assurer un mélange correct, puis maintenez à la température ambiante. Rejeter spécimen si coagulé ou hémolyse 13.

2. Préparation Labware

  1. Étiquette 2D Tubes de codes à barres avec des étiquettes lisibles (nom anticorps, vender, numéro de catalogue, et le numéro de lot).
  2. Transférer le contenu entier de flacons d'anticorps de la vender (énumérés dans le tableau 1) dans des tubes de codes à barres 2D correspondant.
    Note: Prendre une extrême prudence pour ne pas introduire de bulles sous forme de bulles faussement déclencher détection de niveau de liquide (LLS) qui se traduit par le transfert optimale de réactif.
    Remarque: Assurez-vous que chaque vi d'anticorpsal a suffisamment d'anticorps pour la course.
  3. Lire le code à barres 2D pour chaque tube par le lecteur de code-barres 2D.
  4. Faire une feuille de calcul qui contient les noms d'anticorps (AB) et code à barres lit (BC) en utilisant un logiciel de tableur et de l'enregistrer dans un Comma Separated Values ​​(CSV) que "AB_BC.csv" (tableau 2).
    Remarque: Assurez-vous de formater les cellules comme "texte" et non "Nombre" afin de maintenir le premier «0» pour les numéros de codes à barres le cas échéant (par exemple, 0163562544). Ajouter "x, 0000000000" à la fin pour indiquer la fin des données.
  5. Vis LLS plaques métalliques sur le cadre de la plate-forme dans le virage de liquide automatisé pour permettre LLS.

3. Programmation pour le Liquid Handler automatisé

Note: Deux méthodes seront programmés dans le logiciel pour le manipulateur de liquides automatisé: a) un procédé de fabrication "Cocktail de base" et "Cocktail d'activation" en 3.1), et b) un procédé de fabrication "Maître AntiboCocktail dy "en combinant le" Cocktail de base "et" Cocktail d'activation "en 3.2) (figure 1).

  1. Créer un procédé de fabrication du "Cocktail de base" et "Cocktail d'activation» (figure 2).
    1. En utilisant le logiciel de tableur, faire une feuille de calcul qui contient des informations pour les noms anticorps (de AB_NAME), l'emplacement du tube de destination (BIEN-BASE ou le bien-ACT), et le volume (VOL) en ul pour "Cocktail de base" avec des conseils de P50 (BASE_CT_P50: Table 3) ou des conseils de P200 (BASE_CT_P200: Tableau 4) et "cocktail d'activation" avec des conseils de P50 (ACT_CT_P50: Tableau 5) ou des conseils de P200 (ACT_CT_P200: Tableau 6). Enregistrez-les sous forme de fichiers CSV. Pour «bien-BASE» et «bien-ACT" emplacement, reportez-vous aux numéros de la figure 3.
      Remarque: VOL = titre x (nombre de coloration + 2) ul. Les titres dans le tableau 1 sont spécifiques au lot. L'opérateur doit déterminer un titer pour chaque anticorps comme décrit par d'autres 14.
    2. Cliquez sur une icône pour lancer le logiciel pour le gestionnaire de liquide automatisé sur l'ordinateur pour créer un procédé de fabrication "Cocktail de base" et "Cocktail d'activation".
      Remarque: Les étapes suivantes 3.1.3-3.1.7 définiront le matériel de laboratoire: le support de tubes avec des tubes 2D de codes à barres (figure 4). Les mesures sont fournies à titre de référence. Les enquêteurs doivent déterminer et régler pour chaque instrument.
    3. Dans la barre d'outils sous "Projet", sélectionnez "Labware type Editor". Faites un clic droit sur un objet pour une plaque de 96 puits plat, sélectionnez "Copier" et tapez "Matrix_OneML_TubeRack" dans une fenêtre pop-up.
    4. Double-cliquez sur l'objet "Matrix_OneML_TubeRack" pour ouvrir la boîte de dialogue. Highlight "Informations de base", mis 12.775 cm (X) et 8,546 cm (Y) pour "Span" et 4.625 cm pour "Taille". (Figure 4A).
    5. Ensuite, sélectionnez "mouvemInformations ent ". Réglez Gripper offset 0 (X), 0 (Y), et 0,3 (Z), Gripper Glissez -0.1cm, Gripper Unsqueeze 2,6 cm, limitation de vitesse de 75%, puis cochez la case" Utiliser le capteur de pince "(Figure 4B).
    6. Ensuite, sélectionnez "Well_1". Fixé comme suit: "Eh bien Offset"; 1,5 cm (X) et 1,13 cm (Y), "Eh bien compter»; 12 (X) et 8 (Y), "Eh bien Spacing"; 0,9 (X) et 0,9 (Y), «Volume maximum"; 1500 pi, Format "; régulier," Colum 2 Offset "; 0, et" Volume par défaut "; 0 (figure 4C).
    7. Enfin, appuyez sur une "Modifier ..." bouton à la droite de "configuration bien" (figure 4C). Dans une fenêtre pop-up, fixés comme suit: "Shape"; Round, "Upper Rayon"; 0,37 cm, "Lower rayon"; 0,37 cm, et "Hauteur"; 3,9 cm. Cochez la case "Section Bottom" et réglez "Shape"; Cone, "Rayon"; 0,37 cm, et "Hauteur"; 0,4 cm (Figure 4D).
      Remarque: Les étapes suivantes 3.1.8-3.1.11 définiront le matériel de laboratoire: le support de tube avec des microtubes. Les mesures sont fournies à titre de référence. Les enquêteurs doivent déterminer et régler pour chaque instrument.
    8. Dans la barre d'outils sous "Projet", sélectionnez "Labware type Editor". Faites un clic droit sur un objet pour un rack 24 positions, sélectionnez "SmallTuberack_microfugetubes" "Copier" et de type.
    9. Double-cliquez sur l'objet "SmallTuberack_microfugetubes" pour ouvrir la boîte de dialogue. Highlight "Informations de base", mis en 12,75 cm (X) et 8,5 cm (Y) pour "Span" et 3,95 cm pour "Taille".
    10. Ensuite, sélectionnez "Well_1". Fixé comme suit: "Eh bien Offset"; 1.621 cm (X) et 1.181 cm (Y), "Eh bien compter»; 6 (X) et 4 (Y), "Eh bien Spacing"; 1,9 (X) et 1,9 (Y), «Volume maximum"; 1000 pi, Format "; régulier," Colum 2 Offset "; 0, et" Volume par défaut "; 0.
    11. Enfin, appuyez surun "Modifier ..." bouton à la droite de "configuration bien". Dans une fenêtre pop-up, fixés comme suit: "Shape"; Round, "Upper Rayon"; 0.3345 cm, "Lower rayon"; 0.274 cm, et "Hauteur"; 3.6728 cm. Cochez la case "Section Bottom" et réglez "Shape"; Hémisphère, et "Rayon"; 0,1575 cm.
      Remarque: Les étapes suivantes 3.1.12-3.1.35 expliqueront comment programmer la "nouvelle méthode" pour faire le "Cocktail de base" et "Cocktail d'activation» (figure 2).
    12. Cliquez sur l'icône et ouvert "nouvelle méthode".
    13. Faites glisser un "SI" icône entre une "Démarrer" et l'icône "Terminer" dans la nouvelle méthode (figure 2). Cliquez et mettre en évidence le "SI" icône. Tapez la commande suivante pour Condition:. CreateObject ( "World.EngineObject") simulant
      Remarque: Cela permettra d'éviter le logiciel d'effectuer la vérification des erreurs et de permettre que cette méthode fonctionne. Sans cette étape, les software alertera informations manquantes pour ensemble de données comme code à barres lit ne sont disponibles après l'étape "VisionMate: lire des codes barres» décrite dans 3.1.20). Depuis cette étape désactive l'étape de vérification dans le logiciel, l'opérateur doit confirmer il y a suffisamment de conseils et réactif sur le pont pour effectuer cette méthode.
    14. Insérez une icône «Configuration de l'instrument» entre l'icône "Ensuite" et la première icône "End" dans le cadre du "SI" icône (Figure 2).
      Remarque: Pour toutes les étapes suivantes, faites glisser les icônes entre l'icône "Else" et la deuxième icône "End" dans le cadre du "SI" icône afin que des mesures sont encapsulées dans le "Else".
    15. Faites glisser l'icône «Configuration de l'instrument» sous l'icône "Else" dans la méthode (figure 2).
    16. Cliquez sur l'icône «Configuration de l'instrument» dans la méthode pour ouvrir la fenêtre. Configurer labwares faisant glisser les icônes pour P50 LLS filtrés conseils, astuces P200 LLS filtrés, P1000 conseils, "Matrix_OneML_TubeRack", deux "SmallTuberack_microfugetubes", et le réservoir à l'emplacement du pont correspondant dans la liste d'icônes.
    17. Ouvrez la boîte de dialogue pour la "Matrix_OneML_TubeRack" et le nom de «AB_BOX". Ouvrez la boîte de dialogue pour les «SmallTuberack_microfugetubes» et nommer un comme "BASE_CT" pour les cocktails de base et l'autre comme "ACT_CT" pour Cocktails activation (figure 5).
    18. Faites glisser l'icône "Transfert" de la méthode (figure 2) d'ajouter une étape de transfert de tampon du réservoir dans des microtubes pour "Cocktail de base" et "Cocktail d'activation". volume de transfert = 25 pi x (nombre de taches +2) pour "Cocktail de base" et = 25 pi x (nombre de taches +2) pour "Cocktail d'activation".
    19. Ajouter des étapes pour déplacer la "Matrix_OneML_TubeRack" sur le lecteur de code-barres 2D. Faites glisser l'icône "VisionMate Move" à la méthode (Fifigure 2) et de spécifier le passage de la position de plate-forme initiale à la position de lecture de code à barres sur le pont.
    20. Faites glisser un "VisionMate: lire des codes barres" icône pour la méthode (Figure 2). Ouvrez la boîte de dialogue, et choisissez "VisionMate» comme périphérique et nommer les entrées comme "BC_Read" données.
    21. Faites glisser un "Pause de l'utilisateur" (figure 2), sélectionnez "Mettre en pause l'ensemble du système et afficher ce message" et tapez un commentaire dans le champ pour rappeler aux utilisateurs de confirmer que tous les codes barres sont lus avant de passer à l'étape suivante.
      Remarque: Les étapes suivantes seront 3.1.22-3.1.26 lien entre les emplacements de puits et les noms d'anticorps en utilisant des informations de codes à barres. Cela permettra au gestionnaire de liquide automatisé de trouver un emplacement de l'anticorps particulier basé sur le nom d'anticorps "AB".
    22. Faites glisser une icône "Etape de rapports» à la méthode (Figure 2).
    23. Créez un fichier texte à l'aide d'un programme de texte et enregistrezcomme «BC_Readout" dans le dossier de documents sur l'ordinateur.
    24. Ouvrez la boîte de dialogue pour "Étape de déclaration", choisissez "Fichier texte" pour Style Report, et sélectionnez le fichier "BC_Readout" par la navigation.
      Remarque: Le fichier "BC_Readout" résultant contiendra des informations pour tous les labwares sur le pont, à l'exception des conseils tel que configuré dans 3.1.16 y compris des informations pour code à barres lit pour les tubes de codes à barres 2D et les emplacements de puits dans le "Matrix_OneML_TubeRack".
    25. Ajouter un "Créer un ensemble de données" étape de lier code à barres et de l'information ainsi. Faites glisser l'icône "Create Data Set" à la méthode (Figure 2), cliquez dessus pour ouvrir la boîte de dialogue, choisissez "Lire un fichier" et sélectionnez "AB_BC.csv" (tableau 2 créé en 2.4), cochez la case "par des virgules délimité "et" Le fichier a une ligne de titre ".
      Remarque: Dans la fenêtre de prévisualisation de fichiers, les noms d'anticorps (AB) et code à barres lit (BC) doit être considéré.
    26. Dans les same boîte de dialogue pour "Créer Data Set" dans 3.1.25, sélectionnez "VM1" pour l'emplacement du matériel de laboratoire et de "0" pour la profondeur de la pile, sélectionnez "correspondre à l'ID de l'échantillon», et utiliser le champ «BC» pour correspondre avec les données Set "BC_Read". Sélectionnez "AB" et "BC" pour "des ensembles de données à créer" (Figure 6).
    27. Faites glisser l'icône "VisionMate Move" à la méthode (Figure 2) et de spécifier le passage de la position de lecture de code à barres "VM1" revenir à la position initiale de pont sur ​​le pont.
      Remarque: Les étapes suivantes 3.1.28-3.1.33 définiront étape de transfert pour "Cocktail de base".
    28. Faites glisser l'icône "réserve de travail" (figure 2) et parcourir pour sélectionner le fichier de liste de travail "Base_CT_P50" (tableau 3), créé en 3.1.1. Cochez la case "toute boucle réserve de travail".
    29. Faites glisser directement sur ​​l'icône "Transfert" sous l'icône "réserve de travail" (Figure 2).
    30. Cliquez sur l'icône "Transfer" pour ouvrir le champ de spécification. Il suffit de sélectionner l'une des sondes, P50 LLS conseils filtrés, sélectionnez "décharger" lorsque le transfert est effectué, et cochez "conseils de changement entre les transferts". Ajouter une source en cliquant sur "Cliquez ici pour ajouter une source", sélectionnez "Matrix_OneML_TubeRack" en tant que matériel de laboratoire, et sélectionnez l'emplacement sur le pont par le nom "AB_BOX".
    31. Dans le domaine de la spécification de "Transfert", "Zoom" sur le diagramme de 96 puits par un clic droit et choisissez "AB" immédiatement après "utilisation des ensembles de données" et sélectionnez où ses valeurs "sont égaux à" et "= AB_NAME" . Choisir la technique de transfert de choix.
      Remarque: L'utilisation de LLS est fortement recommandé d'éviter d'avoir des débris précipité près du fond.
    32. Dans le domaine de la spécification de "transfert", sélectionnez la destination en cliquant sur "Cliquez ici pour ajouter une destination», cliquez à droite pour un zoom avant et sélectionnez "SmallTuberack_microfugetubes "en tant que matériel de laboratoire, le volume comme" = VOL ", et l'emplacement sur le pont par le nom" BASE_CT ". Après un zoom arrière, faites un clic droit à nouveau, cochez la case" Définir sélection sous forme de texte ", et cochez" Spécifier les cibles avec l'expression ci-dessous: "et tapez" = WELL_BASE "comme une variable pour une position de plate-forme de destination.
    33. Répétez 3.1.29-3.1.32 de même pour "Cocktail de base" avec des conseils P200, en sélectionnant le fichier csv "Base_CT_P200" (tableau 4) puis choisissez P200 LLS conseils ainsi que la technique de la pipette appropriée filtrés pour P200 LLS conseils filtrés.
      Remarque: Les étapes suivantes 3.1.34 et 3.1.35 définira étape de transfert pour "Cocktail d'activation".
    34. Répétez 3.1.29-3.1.32 de même pour "Cocktail d'activation" avec des conseils de P50, en sélectionnant le fichier csv "de ACT_CT_P50" (tableau 5) et en choisissant "ACT_CT" comme destination. Faites un clic droit de la destination et cochez la case "Définir sélection en tant que texte";. Cochez la case "Spécifier les cibles avec l'expression ci-dessous:" et tapez "= WELL_ACT" comme une variable pour une position de destination.
    35. Répétez 3.1.34 de même pour "Cocktail d'activation" avec des conseils P200, en sélectionnant le fichier csv "de ACT_CT_P200" (tableau 6) et des conseils P200 LLS filtrés.
      Remarque: Le procédé de fabrication "Cocktail de base" et "Cocktail d'activation" peut être fermé après l'enregistrement.
  2. Créer un nouveau procédé de fabrication de "Maître cocktail d'anticorps" en combinant "Cocktail de base" et "Cocktail d'activation" en 5 ml tubes de polystyrène à fond rond (figure 7).
    Remarque: Les étapes suivantes 3.2.1-3.2.6 définiront le matériel de laboratoire: le support de tube avec 5 ml tubes en polystyrène à fond rond. Chiffres sont fournis à titre de référence. Les enquêteurs doivent déterminer et régler pour l'instrument.
    1. Dans la barre d'outils sous "Projet", sélectionnez "Labware type Editor". Droit-click sur un objet pour le rack 24 positions, sélectionner "Copier" et tapez "BiocisionCoolRack_XT" dans une fenêtre pop-up.
    2. Double-cliquez sur l'objet "BiocisionCoolRack_XT" pour ouvrir la boîte de dialogue.
    3. Highlight "Informations de base", mis en 12,78 cm (X) et 8,57 cm (Y) pour "Span" et 7,93 cm pour "Taille".
    4. Mettez en surbrillance "Well_1". Fixé comme suit: "Eh bien Offset"; 1,55 cm (X) et 1,33 cm (Y), "Eh bien compter»; 6 (X) et 4 (Y), "Eh bien Spacing"; 1,95 (X) et 1,97 (Y), «Volume maximum"; 2000 pi, Format "; régulier," Colum 2 Offset "; 0, et" Volume par défaut "; 0.
    5. Ouvrez "configuration bien" pour modifier. Fixé comme suit: «forme»; Round, "Upper Rayon"; 0,5375 cm, "Lower rayon"; 0,48 cm, et "Hauteur"; 7,07 cm. Cochez la case "Section Bottom" et réglez "Shape"; Hémisphère, et "Rayon"; 0.45 cm.
      Remarque: Les étapes suivantes3.2.6-3.2.7 définira étapes de transfert et être utilisé dans l'étape 3.2.14.
    6. Créer un fichier csv "AB_MACT" (tableau 7) pour la fabrication de cocktail d'anticorps avec les en-têtes suivants: a) "SRC_BASE"; un nom de matériel de laboratoire pour "Cocktail de base", b) "WELL_BASE"; ainsi endroits dans le matériel de laboratoire pour "Cocktail de base", c) "VOL_BASE"; volume de transfert de "Cocktail de base" en pl, d) "SRC_ACT"; un nom de matériel de laboratoire pour "Cocktail d'activation", e) "WELL_ACT"; ainsi endroits dans le matériel de laboratoire pour "Cocktail d'activation", f) "VOL_ACT"; volume de transfert de "Cocktail d'activation" à ul, g) "DEST_MACT"; des informations de position de pont pour "Maître cocktail d'anticorps", et h) "WELL_MACT"; bien positionner l'information dans le support de tubes pour "Cocktail Master anticorps".
    7. Remplir les informations dans les en-têtes créés dans 3.2.6) (tableau 7) comme suit: a) utiliser "BASE_CT"sous SRC_BASE, b) des informations de localisation liste bien pour "WELL_BASE" comme le montre la figure 3A, c) la liste volume total d'anticorps (25 pi de tampon + somme de tous les titres d'anticorps de base pour la coloration unique) sous "VOL_BASE", d) utiliser "ACT_CT" sous SRC_ACT, e) la liste et les informations de localisation pour "WELL_BASE" comme le montre la figure 3B, f) la liste volume total d'anticorps (25 pi de tampon + somme de tous les titres d'anticorps d'activation pour la coloration unique) sous "VOL_ACT". Transfert de 25 pi de tampon pour T-Mobile FM3. Se reporter au tableau 1 pour les tests de 1-3, g) l'utilisation "SPL_TUBES_1" (voir 3.2.10) pour "DEST_MACT", et h) des informations de localisation liste bien pour "WELL_MACT" comme le montre la Figure 8.
      Remarque: Les étapes suivantes 3.2.8-3.2.15 programmeront le procédé de fabrication "Cocktail Master Anticorps"
    8. Ouvrez une nouvelle méthode (figure 7).
    9. Faites glisser le "Instrdocu- Setup icône "à la nouvelle méthode (figure 7).
    10. Dans le domaine de la «Configuration de l'instrument», des icônes de traînée pour des bouts P1000, deux «SmallTuberack_microfugetubes", et "BiocisionCoolRack_XT" sur le diagramme de pont spécification. Ouvrez la boîte de dialogue pour les deux "SmallTuberack_microfugetubes" et le nom que "BASE_CT" et "ACT_CT", respectivement, tel que spécifié dans 3.1.17. Ouvrez la boîte de dialogue pour "BiocisionCoolRack_XT" et le nom de «SPL_TUBES_1" comme spécifié dans 3.2.7 (Figure 9).
    11. Ajouter un nouveau "groupe" en faisant glisser une icône "Groupe" la méthode (figure 7).
    12. Faites glisser l'icône "Transfert de fichier" directement sous l'icône "Groupe" pour transférer "Base de Cocktail" pour faire "Cocktail Master Anticorps» (figure 7).
    13. Dans le domaine de la spécification de "Transfert de fichier", sélectionnez les conseils de P1000 en cours d'utilisation, sélus "décharger" lorsque le transfert est effectué, et cochez "conseils de changement entre les transferts".
    14. Dans le domaine de la spécification de "Transfert de fichier", sélectionnez le fichier "AB_MACT" (tableau 7) par la navigation, cochez la case "Fichier possède une ligne d'entête". Sélectionnez "SRC_BASE" pour la position source de matériel de laboratoire et «WELL_BASE" pour obtenir des informations et dans le matériel de laboratoire source, sélectionnez "DEST_MACT" pour le matériel de laboratoire de destination et "WELL_MACT" pour obtenir des informations et dans le matériel de laboratoire de destination, et sélectionnez "VOL_BASE" pour obtenir des informations de volume (Figure 10). A choisi la technique de transfert approprié pour obtenir des conseils de P1000.
      Remarque: LLS peut ne pas être nécessaire à ce processus.
    15. Ajouter une autre "Transfert de fichier" en le faisant glisser directement sous "Groupe" de transférer le "Cocktail d'activation" qui doit être mélangé avec le «cocktail de base" pour faire "Maître cocktail d'anticorps" (Figure 7 </ Strong>). De même mis en place l'étape de transfert comme dans 3.2.13 et 3.2.14. Les exceptions sont les suivantes: a) Sélectionnez "SRC_ACT" pour la position source de matériel de laboratoire, b) "WELL_ACT" pour obtenir des informations et dans le matériel de laboratoire à la source, et c) "VOL_ACT" pour obtenir des informations de volume.

4. Operating Procedure

  1. Tout d'abord, double-cliquez sur l'icône du logiciel pour lancer le lecteur de code-barres 2D sur l'ordinateur.
  2. Ensuite, double-cliquez sur l'icône du logiciel pour lancer le gestionnaire de liquide automatisé sur l'ordinateur.
  3. Sous "instrument", sélectionnez "Accueil tous les axes" à des seringues premiers du manipulateur de liquide automatisé. Assurez-vous que toutes les seringues ne contiennent pas de bulles d'air visibles.
    Note: "Accueil tous les axes" donnera aussi l'instrument d'un point de référence à partir de laquelle faire des mouvements ultérieurs.
  4. Ouvrez le procédé de fabrication du "Cocktail de base" et "Cocktail d'activation" (Figure 2) dans le logiciel pour l'unmanipulateur de liquides utomated.
  5. Placer les microtubes en «SmallTuberack_microfugetubes" pour "BASE_CT" et "ACT_CT", selon le nombre de "Cocktail de base" et "Cocktail d'activation" à faire (figure 3). Puis placez-les sur le pont en fonction de la «Configuration de l'instrument» (figure 5).
  6. Placez le réservoir avec un tampon sur le pont en fonction de la «Configuration de l'instrument».
  7. De-bouchon de tubes de codes à barres 2D contenant les anticorps en utilisant un 8 canaux bouchon à vis décapsuleur. Maintenir les bouchons dans l'ordre exact sur un plateau de cap maintenant afin d'éviter la contamination croisée. Placez le "Matrix_OneML_TubeRack" sur le pont en fonction de la «Configuration de l'instrument» (figure 5).
  8. Lieu P50 LLS conseils filtrés, P200 LLS conseils filtrés et des conseils de P1000 sur le pont en fonction de la «Configuration de l'instrument» (figure 5).
  9. Commencez la méthode en cliquant sur le tri verten forme d'angle d'icône de démarrage. Comme demandé par la fenêtre, assurez-vous que tous les éléments sur le pont correspondent à la «Configuration de l'instrument» au sens de la méthode. Ne placez pas d'objets qui ne sont pas répertoriés dans la «Configuration de l'instrument» sur le pont, car cela pourrait écraser la gousse et / ou la pince. Appuyez sur "OK" pour continuer.
  10. Après la "Matrix_OneML_TubeRack" est déplacé sur le lecteur de code-barres 2D et codes à barres sont lus, une autre fenêtre se demander si tous les codes barres sont lus. Procéder en appuyant sur "OK" une fois confirmée.
  11. À la fin du transfert par le gestionnaire de liquide automatisé, reboucher les tubes à code-barres 2D utilisant un 8 canaux bouchon à vis décapsuleur, et de les remettre à 4 ° C.
  12. Vortex tous les tubes de microcentrifugation vigoureusement pendant 20 sec, et les retourner dans les supports pour tubes.
    Remarque: vortex insuffisant peut entraîner une coloration optimale des cellules.
  13. Fermez le procédé de fabrication "Cocktail de base" et "Cocktail d'activation". Ouvrez ensuite le procédé de fabrication "Cocktail Master anticorps".
  14. Mettre en place 5 ml tubes pré-étiquetés en polystyrène à fond rond sur le "BiocisionCoolRack_XT" (figure 8) et le placer sur le pont. Les étiquettes doivent indiquer ce "cocktail de base" et "Cocktail d'activation" sont mélangés, ainsi que l'identification du patient approprié.
  15. Placez supports pour tubes pour "Cocktail de base", "Cocktail d'activation", et des conseils de P1000 sur le pont (figure 9). Commencez la méthode (figure 7). Comme demandé par la fenêtre, assurez-vous que les articles sur le match de pont Setup Instrumental dans la méthode (figure 9). Appuyez sur "OK" pour continuer.
  16. Lorsque le processus ci-dessus est fait, ajouter manuellement 50 pi d'échantillons de sang dans chaque 5 ml de tubes en polystyrène à fond rond qui contient le cocktail d'anticorps.
  17. tubes d'échantillons de vortex à l'intérieur d'une enceinte de sécurité biologique de classe II et incuber 15 min à température ambiante dans l'obscurité. Take soin d'éviter les rayures du sang sur les parois des tubes, comme cela se traduira par coloration incompatible. Retirez soigneusement d'éventuelles traces de sang par des cotons-tiges humidifiés avec un tampon de lavage d'écoulement.
  18. Ajouter 1 ml de tampon de lyse RBC manuellement et incuber 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
  19. Ajouter 2 ml de tampon de lavage d'écoulement (azoture de sodium à 0,1%, 1% BSA, 10 U / ml d'héparine dans 1 x HBSS) et centrifuger pendant 5 min à 400 x g. Rejeter le surnageant dans une enceinte de sécurité biologique de classe II. Répétez ce processus de lavage. Remettre en suspension les cellules marquées dans 0,5 ml de tampon de lavage d'écoulement.
  20. Mettre en place un cytomètre de flux qui est équipé avec des lasers à base de farine et de filtres appropriés, ainsi que des échantillons exécutés à l'aide de 5 ml des tubes en polystyrène à fond rond. Utilisez étalonnage et de compensation de fluorescence méthodes cytomètre standard pour la collecte des données 12,15. Recueillir tous les paramètres listés dans «FLUOROPHORE" dans le tableau 1.
    Remarque: Les matériaux de contrôle appropriés doivent être utilisés dans chaque série pour assurer le cul bonperformances ay.
  21. Après des échantillons en cours d'exécution, l'exportation des données acquises sous forme de fichiers de FCS.
  22. Analyser les données en utilisant un logiciel approprié. Identifier des sous-ensembles de lymphocytes T en utilisant une stratégie de déclenchement indiqué par le projet Human Immunology 1.

Résultats

Le but de l'immunophénotypage de sang total est d'obtenir quantitative (la délimitation des sous-ensembles de cellules immunitaires) et qualitative (détection de l'état d'activation) des informations sur les cellules immunitaires. Nous avons légèrement modifié le panneau de immunophénotypage des lymphocytes T proposé par le projet Human Immunology 1 à améliorer la performance globale de notre méthode (tableau 1). Notre panel de cellules T vise à identifier naïve, la mémoire centrale (CM), effecteur mémoire (EM), et les cellules T effectrices. En bref, nous distinguons doublets basé sur FCS-A et FCS-H. Ensuite, nous porte sur les lymphocytes basé sur la dispersion latérale et niveaux CD45. Les cellules T sont ensuite identifiés par l'expression de CD3. Lymphocytes T CD3 + se différencient en cellules T yô et des cellules T aß. cellules T αβ sont divisées en cellules CD4 + et CD8 +. Cellules T CD4 + et CD8 + sont ensuite analysées pour leurs sous-ensembles sur la base de expression de CD45RA et CCR7: CD45RA - CCR7 + CM, CD45RA + CCR7 + Naïve, CD45RA + CCR7 - effecteur, et CD45RA - CCR7 - cellules T EM 1. En outre, nous surveillons aussi leur expression de marqueurs d'activation tels que CD38, HLA-DR, ICOS, PD-1, GITR, 4-1BB, CD69, NKG2D et OX40 d'obtenir des informations qualitatives.

Pour mettre en évidence la précision de cette méthode, nous avons coloré les échantillons de sang total périphérique provenant de 4 donneurs sains 5 fois par jour. La figure 11 montre la relation entre pour cent T sous-population cellulaire sur les lymphocytes gated et coefficient de variation (CV%) pour cent. Une ventilation détaillée des sous-populations de cellules pour cent de T sur les lymphocytes gated et% CV pour chaque sous-ensemble est présenté dans le tableau 8. Données des essais 2 et 3 ne sont pas inclus dans la figure 11 et le tableau 8 pour plus de simplicité. Moins de 25% CVentre run (précision inter-essai) a été proposé pour les critères d'acceptation pour les dosages de biomarqueurs phénotypiques pour des fins de recherche 10. Toutes les mesures ont rencontré ce critère, sauf cellules ICOS + γδ T (de 26,64 à 46,39%. Tableau 8) et des cellules T CD8 + ICOS (14,64 à 58,39%. Tableau 8). Ces valeurs sont indiquées à des fins de démonstration. Nous n'utilisons pas ces mesures parce ICOS joue principalement un rôle important dans l'activation des cellules T CD4 16. La tendance de la hausse% CV dans les populations qui constituent un faible pourcentage de la population totale a été observée par d'autres 7. Dans le cas où les enquêteurs sont intéressés par le suivi rares manifestations, le nombre de cellules examiné doit être augmenté afin de surmonter une plus grande imprécision 17. Ensemble, nos données montrent le déploiement réussi de l'automatisation dans la préparation de l'immunophénotypage de sang total de l'échantillon.

< img alt = "Figure 1" src = "/ files / ftp_upload / 53485 / 53485fig1.jpg" />
Figure 1. Workflow pour immunophénotypage avec du sang total périphérique. Étape par étape flux de dosage immunophénotypique est montré. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-1
Figure 2. Vue d'ensemble du procédé de fabrication "Cocktail de base" et "Cocktail d'activation". Les étapes du procédé de fabrication "Cocktail de base" et "Cocktail d'activation" dans le logiciel pour le gestionnaire de liquide automatisé sont affichés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

e 3 "src =" / files / ftp_upload / 53485 / 53485fig3.jpg "/>
Figure 3. Disposition des barres de tube avec BACE_CT et ACT_CT. (A) montre la disposition des barres de tube "BACE_CT". (B) montre la disposition des barres de tube "de ACT_CT". S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-2
Figure 4. définition Labware pour le support de tubes avec des tubes de codes à barres 2D. Processus étape par étape de définition du support de tubes avec des tubes de codes à barres 2D. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

485fig5.jpg "/>
Figure 5. Configuration de l'instrument pour le procédé de fabrication "Cocktail de base" et "Cocktail d'activation". Il montre le plan de pont pour le procédé de fabrication "Cocktail de base" et "Cocktail d'activation". S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-3
Figure 6. Configuration pour "Créer un ensemble de données". Il montre réglages détaillés pour «Créer Data Set". S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-4
Figu re 7. Vue d'ensemble du procédé de fabrication "Cocktail Master anticorps". Les étapes du procédé de fabrication "Cocktail Master Anticorps» dans le logiciel pour le gestionnaire de liquide automatisé est représenté. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-5
Figure 8. Disposition des barres de tube avec 5 ml tubes en polystyrène à fond rond. Il montre la disposition des barres de tube "de SPL_TUBES_1". FM3 signifie fluorescence moins 3 (brillante violette 421, la phycoérythrine, et allophycocyanine). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

ftp_upload / 53485 / 53485fig9.jpg "/>
Figure 9. Configuration de l'instrument pour le procédé de fabrication "Cocktail Master anticorps". Il montre le plan de pont pour le procédé de fabrication "Cocktail Master anticorps". S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-6
Figure 10. Configuration de "Transfert de fichier". Il montre réglages détaillés pour "Transfert de fichier". S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-7
Figure 11. Low vari capacité totale immunophénotypage semi-automatisée de sang. valeurs de CV uniques de toutes les populations de cellules analysées à partir de quatre donneurs sains sont présentés comme cercle ouvert bleu. courbe de régression est représenté sur la ligne bleue. Red pointillés indiquent 95% des bandes confiants et les lignes de la cupidité parsemée montrent 95% des bandes de prédiction. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-8
Figure 12. Un exemple de coloration sous-optimale. La coloration a été réalisée avec vortex adéquate ou inadéquate des microtubes de «BACE_CT" et "ACT_CT". Il existe deux populations bloquées dans B. La population mineur avec une faible coloration de CD45 représente des cellules qui ne reçoivent pas la coloration optimale.g12large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

GROUPE MARQUEUR FLUOROPHORE Cloner TITRE (pl / coloration)
BASE COCKTAIL TCell CD45 FITC 2D1 0,4
CD3 Alexa700 UCHT1 1
CD8 APC-H7 SK1 0,4
CD4 PerCP-Cy5.5 SK3 2
CCR7 PE-CF594 150503 1
CD45RA PE-Cy7 L48 1
TCRab BV786 T10B9.1A-31 1
TCRgd BV650 B1 5
ACTIVATION COCKTAIL-1 TEST1 HLA-DR BV421 G46-6 5
CD278 (ICOS) PE DX29 5
CD38 APC HB7 1
ACTIVATION COCKTAIL-2 TEST2 CD279 (PD1) BV421 EH12.1 2.5
CD357 (GITR) PE eBioAITR 5
CD137 (41BB) APC 4B4-1 dix
ACTIVATION COCKTAIL-3 TEST3 CD69 BV421 FN50 1
CD314 (NKG2D) PE 1D11 2
CD134 (OX40) APC ACT35 5

Tableau 1. Une liste d'anticorps pour le panneau de cellules T modifiées.

UN B avant JC
CD45_FITC 0163562388
CD3_Alexa700 0163562110
CD4_PerCP_CY5.5 0163562364
CD8_APC-H7 0163562363
CCR7_PE-CF594 0163562387
CD45RA_PE-Cy7 0163562091
TCRab_BV786 0163562069
TCRgd_BV650 0163562108
A_HLA-DR_BV421 0163562339
A_CD278 (ICOS) _PE 0163562082
A_CD38_APC 0163562317
A_CD279 (PD1) _BV421 0163562340
A_CD357 (GITR) _PE 0163562093
A_CD137 (41BB) _APC 0163562315
A_CD69_BV421 0163562341
A_CD314 (NKG2D) _PE 0163562314
A_CD134 (OX40) _APC 0163562316

Tableau 2. Anticorps noms avec des numéros de codes à barres 2D.

GROUPE WELL_BASE AB_NAME VOL
TCell 1 CD8_APC-H7 7.2
TCell 1 CD45_FITC 7.2
TCell 1 CD3_Alexa700 18
TCell 1 CCR7_PE-CF594 18
TCell 1 CD45RA_PE-Cy7 18
TCell 1 TCRab_BV786 18

Tableau 3. Un fichier "BASE_CT_P50": les noms d'anticorps et de l'information de volume.

GROUPE WELL_BASE AB_NAME VOL
TCell 1 CD4_PerCP_CY5.5 36
TCell 1 TCRgd_BV650 90

Tableau 4. Un fichier "BASE_CT_P200": les noms d'anticorps et de l'information de volume.

GROUPE WELL_ACT AB_NAME VOL
TEST1 7 A_HLA-DR_BV421 30
TEST1 7 A_CD278 (ICOS) _PE 30
TEST1 7 A_CD38_APC 6
TEST2 13 A_CD279 (PD1) _BV421 15
TEST2 13 A_CD357 (GITR) _PE 30
TEST3 19 A_CD314 (NKG2D) _PE 12
TEST3 19 A_CD69_BV421 6
TEST3 19 A_CD134 (OX40) _APC 30

Tableau 5. Un fichier "ACT_ CT_P50": les noms d'anticorps et des informations de volume.

GROUPE WELL_ACT AB_NAME VOL
TEST2 13 A_CD137 (41BB) _APC 60

Tableau 6. Un fichier "ACT_CT _P200": les noms d'anticorps et des informations de volume.

DONNEUR# SRC_
BASE 		BASE COCKTAIL BIEN_
BASE 		VOL_
BASE 		SRC_ACT vités
VATION
COCKTAIL 		BIEN_
ACTE 		VOL_ACT DEST_MACT BIEN_
MACT
HD001 BASE_CT TCell 1 36,8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 1
HD001 BASE_CT TCell 1 36,8 ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 7
HD001 BASE_CT TCell 1 36,8 ACT_CT TEST2 13 42,5 SPL_TUBES_1 13
HD001 BASE_CT TCell 1 36,8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 19
HD002 BASE_CT TCell 1 36,8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 2
HD002 BASE_CT TCell 1 36,8 ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 8
HD002 BASE_CT TCell 1 36,8 ACT_CT TEST2 13 42,5 SPL_TUBES_1 14
HD002 BASE_CT TCell 1 36,8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 20
HD003 BASE_CT TCell 1 36,8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 3
HD003 BASE_CT TCell 1 36,8 ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 9
HD003 BASE_CT TCell 1 36,8 ACT_CT TEST2 13 42,5 SPL_TUBES_1 15
HD003 BASE_CT TCell 1 36,8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 21
HD004 BASE_CT TCell 1 36,8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 4
HD004 BASE_CT TCell 1 36,8 ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 dix
HD004 BASE_CT TCell 1 36,8 ACT_CT TEST2 13 42,5 SPL_TUBES_1 16
HD004 BASE_CT TCell 1 36,8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 22

Tableau 7. Un fichier "AB_MACT": Source et informations de destination pour "Cocktail Master anticorps".

Population # sur la figure. 1 je ii iii iv v
nom de la population CD3 + cellules T ab cellules T gd CD3 + CD4 + CD3 + CD8 +
% De lymphocytes Heathly donneur n ° 1 79.80 75.20 2.70 49.60 22.30
Heathly donneur n ° 2 69.40 61.90 5,85 44.40 16.20
Heathly donateurs # 3 75.80 69.60 4,75 42.00 23.50
Heathly donateurs # 4 77.20 73.50 1,98 52.70 18.90
%CV Heathly donneur n ° 1 1,42 1,58 3,70 2.50 1,56
Heathly donneur n ° 2 2.48 2.39 5,74 2.82 2.41
Heathly donateurs # 3 1.15 1,40 6.32 1,42 2.72
Heathly donateurs # 4 0,81 0,94 5.45 1.20 1,44
Moyenne 1,47 1,58 5.30 1.99 2.03
L'écart-type 0,72 0,61 1.13 0.79 0,63

Tableau 8. Les données brutes pour% de lymphocytes et% CV pour chaque sous-ensemble tracées sur la figure 4. On notera que les données pour les tests 2 et 3 ne sont pas présentées dans la figure 5 et le tableau 8 pour simplifier la présentation des données.

Discussion

Immunophénotypage du sang périphérique est d'une importance cruciale pour gagner un aperçu des réponses individuelles à l'immunothérapie. Le défi réside dans la normalisation d'épreuves pour contrôler expérience à expérience variabilité 1,14. Une source principale de la variabilité réside dans la manipulation humaine des échantillons. Par conséquent, il est concevable que l'automatisation partielle ou totale du traitement de l'échantillon de faciliter une réduction spectaculaire dans l'expérience à 1,14 variabilité expérience. Dans ce protocole, nous rapportons notre effort réussi à minimiser la variabilité essai en introduisant un manipulateur de liquide automatisé équipé 2D lecteur de code à barres pour l'échantillon coloration dans immunophénotypage de sang total.

Dans la conception, notre méthode est polyvalent et peut surveiller d'autres sous-ensembles immunitaires en ajoutant supplémentaires "Cocktails base" pour les définir. De tels sous-ensembles comprennent des cellules T auxiliaires, des cellules T régulatrices, les cellules B, les cellules NK, les cellules dendritiques et les monocytes (manuscrit enpréparation) 18. Nous avons adapté panneaux anticorps recommandées par le consortium en introduisant des marqueurs supplémentaires 1. populations cellulaires ont été identifiés à l'aide "Cocktail de base" conjugué à fluorochromes avec une émission minimale dans la violette brillant 421 (BV421), la phycoérythrine (PE), et l'allophycocyanine (APC) détecteurs, car nous voulions réserver ces canaux pour la détection d'antigènes inductibles. Cette caractéristique assure non seulement la sensibilité la plus élevée pour surveiller l'état d'activation des cellules immunitaires, mais permet également le logement souple des nouveaux marqueurs d'activation étant donné que ces trois fluorochromes sont le plus souvent conjugués avec des anticorps contre des marqueurs inductibles. Par conséquent, notre procédé est non seulement approprié pour la préparation de cocktail pour l'immunophénotypage de sang entier, mais est également utile pour la coloration d'autres échantillons y compris les cellules et les cellules mononucléaires du sang périphérique à partir de tissus récupérés ventilées (par exemple, une tumeur).

introduction réussieproduction de notre méthode nécessite une attention particulière aux étapes dans la préparation de matériel de laboratoire, et de la programmation et de l'exécution de la méthode. Préparation des tubes de codes à barres 2D comprend l'étiquetage avec des étiquettes lisibles et le transfert des anticorps aux tubes désignés. Pour éviter l'introduction d'erreurs, nous vous recommandons de le faire avec deux personnes. Chaque fois que la modification des feuilles de calcul, les enquêteurs doivent vérifier si la méthode fonctionne correctement. Le choix des méthodes de pipetage appropriées au cours de la programmation assure un transfert de liquide succès. LLS permet pipetage sans obtenir débris précipité du fond de tubes d'anticorps, pour lesquels nous utilisons soit P50 ou P200 pointes conductrices. LLS peuvent ne pas être une bonne option pour obtenir des conseils de P1000 comme LLS est plus sensible aux pointes de P1000 et parfois déclenché faussement par la présence de bulles. Heights dans la définition de matériel de laboratoire doivent être ajustés pour chaque instrument de transfert de liquide comme sous-optimale pourrait se produire, par exemple, s'il n'y a pas assez d'espace entre le bord de conseilset le fond de tubes. Comme le montre la Figure 12, si le «cocktail de base" et / ou "cocktail d'activation" ne sont pas bien au vortex, il peut en résulter une coloration optimale.

Nous avons pensé à l'aide de réactifs lyophilisés pour la coloration de la cellule comme une approche alternative pour réduire la variabilité liée avec le réactif de distribution 19. Cependant, les conjugués de polymère de colorants violets brillants sont connus pour interagir les uns avec les autres signaux non spécifiques provoquant. En tant que tel, en ajoutant plus de deux conjugués polymères (par exemple, BV421 et BV650 etc.) dans les réactifs lyophilisés peuvent provoquer la signalisation non spécifique (par exemple, augmentation du signal de BV650 de fond dans BV421 + population) 20. En outre, les réactifs lyophilisés manquent de souplesse pour inclure une nouvelle coloration. Ils sont généralement plus coûteux et nécessitent une commande groupée. Pour ces raisons, nous avons choisi d'utiliser le gestionnaire de liquide automatisé équipé avec les tubes de codes à barres 2D. Bien qu'il tflocons de temps pour mettre en place et implique un investissement initial d'acheter l'instrument, dans le long terme, ces facteurs seront compensées par l'augmentation de la productivité et la reproductibilité des tests. En fait, quelques groupes précédemment rapporté l'intégration réussie du gestionnaire de liquide automatisé dans leur flux de travail d'immunophénotypage ou applications similaires 21,22. solutions automatisées pour l'analyse de cytométrie en flux sont également disponibles auprès de sources commerciales (FACS SPA III, Cocktail Préparation automatique de postes de travail, et FlowStainer). Cela indique en outre il y a un grand besoin pour la préparation de cocktail automatisé pour immunophénotypage.

Après la maîtrise de cette technique, nous envisageons que le développement de l'immunophénotypage entièrement automatisé de sang total permettra de réduire davantage la variabilité expérience à l'expérience et pourrait faire immunophénotypage de sang total possible même dans un cadre 23 étude clinique multicentrique. Nous avons déjà commencé à utiliser une lyse étaith assistant pour automatiser la lyse et des étapes de lavage. Nous envisageons également que la détermination automatique de la quantité d'anticorps dans les tubes de codes à barres 2D et le suivi de réactif distribution permettra d'améliorer grandement l'inventaire d'anticorps et le contrôle de qualité sur notre méthode, respectivement.

Déclarations de divulgation

YK, ILG, TLM, WLM, DPH, et KSB: Aucun intérêts financiers concurrents. ANT est un employé de Beckman Coulter, Inc. publication de cet article vidéo est sponsorisée par Beckman Coulter, Inc.

Remerciements

Nous remercions Hannah Puzas pour son aide à la conception et à la configuration du système, et Kevin Khovananth pour ses conseils techniques. Le financement de ce travail a été fourni par les Fondations Hearst et la Fondation médicale Providence Portland.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BD LSRFortessaBD BiosciencesCytomètre en flux
NXp Span-8 Station de travail d’automatisation de laboratoire  ;Beckman CoulterA31839Poste de travail d’automatisation de laboratoire  ;
Insert, Tube, 11 mm, Blanc, pour Tubes Microfuge de 1,5 ml (caisse de 25)Beckman Coulter373696 Accessoire pour Rack de Tubes à 24 Positions pour accueillir des Tubes Microfuge.  ;
Kit LLSBeckman Coulter719262Fixez le bas du pont dans le poste de travail d’automatisation de laboratoire pour permettre la détection de niveau de liquide
Rack de tubes à 24 positionsBeckman Coulter373661Rack de tubes pour contenir des tubes microfuge pour cocktails d’anticorps ou de sang
SACS D’AUTOCLAVE POUR RISQUES BIOLOGIQUES 12 x 24 POUCES REDLabMartM111416Sacs d’autoclave jetables pour le poste de travail
d’automatisation de laboratoireVisionMate Lecteur de codes-barres 2D haute vitesseThermo ScientificAB-1850Lecteur de codes-barres 2D
8 canaux Boucheuse/décapeuse/décapeuse à vis portableThermo Scientific4105MATPour le débouchage et le bouchage des tubes de codes-barres 2D.
Tubes de microcentrifugationFisher Scientific02-681-335Pour la préparation de cocktails ou l’approvisionnement en échantillons de sang du poste de travail d’automatisation de laboratoire
CoolRack XT CFT24biocisionBCS-534Pour contenir des tubes d’échantillons.
Tubes ambrés Matrix ScrewTop de 1,0 ml dans des racks à loquetThermo Scientific3741AMBTubes à code-barres 2D pour stocker des anticorps fluorescents conjugués à un colorant
Biomek Span-8 P1000 Tips, conducteurs, pré-stériles avec barrière, 1 025 & micro ; lBeckman Coulter987925conseils pour le poste de travail d’automatisation de laboratoire  ;
Embouts Biomek Span-8 P50, conducteurs, pré-stériles avec barrière, 50 & micro ; l (Caisse de 10 racks)Beckman CoulterB01091Conseils pour poste de travail d’automatisation de laboratoire  ;
Pointes Biomek Span-8 P250, conductrices, pré-stériles avec barrière (caisse de 10 racks)Beckman Coulter394627pointes pour poste de travail d’automatisation de laboratoire  ;
BD FACS Lysing Solution 10x ConcentréBD Biosciences349202Lyse RBC
Falcon Tubes en polystyrène à fond rondFisher Scientific14-959-5Tubes d’échantillons
Anti-CD45 FITCBD Biosciences347463Effecteur Panneau de cellules T (base)
Anti-CD3 Alexa Fluor 700eBioscience56-0038-42Effecteur Panneau de cellules T (base)
Anti-CD4 PerCPCy5.5BD Biosciences341654Panneau de cellules T effecteur (base)Panneau de cellules T
564156anti-TCRgd BV650BD Biosciencesbase)Panneau de cellules T effectrices (base)
Anti-560179 CCRabsPanneau de cellules T effectrices
base)
Anti-CCR7 PE-CF594BD Biosciences562381Panneau de cellules T effectrices (base)
Anti-CD45RA PE-Cy7BD Biosciences337167Panneau de cellules T effectrices (base)
Anti-HLA-DR BV421BD Biosciences562804Panneau de cellules T effectrices (activation)
Anti-CD278(ICOS) PEBD Biosciences557802Panneau de cellules T effectrices (activation)
Anti-CD38 APCBD Biosciences340439Panneau de cellules T effecteur (activation)
Anti-CD279(PD1) BV421BD Biosciences562516Panneau de cellules T effecteur (activation)
Anti-CD357(GITR) PEeBioscience12-5875-42Panneau de cellules T effectrices (activation)
Anti-CD137(41BB) APCBD Biosciences550890Panneau de cellules T effectrices (activation)
Anti-CD69 BV421BD Biosciences562884Panneau de cellules T effecteur (activation)
Anti-CD314(NKG2D) PEBD Biosciences557940Panneau de cellules T effecteur (activation)
Anti-CD134(OX40) APCBioLegend350008Panneau de cellules T effectrices (activation)
Tubes de prélèvement de sang en plastique BD Vacutainer avec héparine de sodium : Bouchon conventionnelFisher Scientific02-689-6Pour la collecte de sang
Albumine, sérum bovin, fraction V, RIA et ELISA EMDMillipore126593Pour tampon de lavage à flux
Azoture de sodiumSigma-AldrichS8032Pour tampon de lavage à flux
Héparine, sel de sodiumAffimetrix16920Pour tampon de lavage à flux
Hank' s Solution saline équilibrée (HBSS), 1x, avec calcium, magnésium, sans rouge de phénolGE Healthcare Life SciencesSH30588.02Pour tampon de lavage par écoulement
effectrices ( BV786 BD Biosciences 563825 Panneau de cellules T effectrices (base) (

Références

  1. Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat. Rev. Immunol. 12 (3), 191-200 (2012).
  2. Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
  3. Johansson, U., Bloxham, D., et al. Guidelines on the use of multicolour flow cytometry in the diagnosis of haematological neoplasms. Br. J. Haematol. 165 (4), 455-488 (2014).
  4. Schnizlein-Bick, C. T., Spritzler, J., et al. Evaluation of TruCount Absolute-Count Tubes for Determining CD4 and CD8 Cell Numbers in Human Immunodeficiency Virus-Positive Adults. Clin. Vaccine Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
  5. Cossarizza, A., De Biasi, S., et al. Cytometry, immunology, and HIV infection: Three decades of strong interactions. Cytometry A. 83 (8), 680-691 (2013).
  6. Hensley, T. R., Easter, A. B., et al. Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay. J. Vis. Exp. (67), e4302(2012).
  7. Streitz, M., Miloud, T., et al. Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study. Transplant. Res. 2 (1), 17(2013).
  8. Hensley-McBain, T., Heit, A., De Rosa, S. C., McElrath, M. J., Andersen-Nissen, E. Optimization of a whole blood phenotyping assay for enumeration of peripheral blood leukocyte populations in multicenter clinical trials. J. Immunol. Methods. 411, 23-36 (2014).
  9. Green, C. L., Brown, L., Stewart, J. J., Xu, Y., Litwin, V., Closkey, T. W. M. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: I instrumentation. J. Immunol. Methods. 363 (2), 104-119 (2011).
  10. O'Hara, D. M., Xu, Y., Liang, Z., Reddy, M. P., Wu, D. Y., Litwin, V. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays. J. Immunol. Methods. 363 (2), 120-134 (2011).
  11. Owens, M. A., Vall, H. G., Hurley, A. A., Wormsley, S. B. Validation and quality control of immunophenotyping in clinical flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 33-50 (2000).
  12. Kalina, T., Flores-Montero, J., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
  13. Calvelli, T., Denny, T. N., Paxton, H., Gelman, R., Kagan, J. Guideline for flow cytometric immunophenotyping: a report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. Cytometry A. 14 (7), 702-715 (1993).
  14. Biancotto, A., McCoy, J. P. Studying the human immunome: the complexity of comprehensive leukocyte immunophenotyping. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 377, 23-60 (2014).
  15. Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
  16. Yong, P. F. K., Salzer, U., Grimbacher, B. The role of costimulation in antibody deficiencies: ICOS and common variable immunodeficiency. Immunol. Rev. 229 (1), 101-113 (2009).
  17. Donnenberg, A. D., Donnenberg, V. S. Rare-Event Analysis in Flow Cytometry. Clin. Lab. Med. 27 (3), 627-652 (2007).
  18. Biancotto, A., Fuchs, J. C., Williams, A., Dagur, P. K., McCoy, J. P. High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research. J. Immunol. Methods. 363 (2), 245-261 (2011).
  19. Villanova, F., Di Meglio, P., et al. Integration of Lyoplate Based Flow Cytometry and Computational Analysis for Standardized Immunological Biomarker Discovery. PloS One. 8 (7), e65485(2013).
  20. BD biosciences. Optimizing Experiments Using BD Horizon Brilliant Polymer Conjugates. , (2014).
  21. Malergue, F., van Agthoven, A., Scifo, C., Egan, D., Strous, G. J. Automation of a Phospho-STAT5 Staining Procedure for Flow Cytometry for Application in Drug Discovery. J. Biomol. Screen. 20 (3), 416-421 (2015).
  22. Hasan, M., Beitz, B., et al. Semi-automated and standardized cytometric procedures for multi-panel and multi-parametric wholeblood immunophenotyping. Clin. Immunol. 157 (2), 261-276 (2015).
  23. Maecker, H. T., McCoy, J. P., et al. A model for harmonizing flow cytometry in clinical trials. Nat. immunol. 11 (11), 975-978 (2010).

Réimpressions et autorisations

Explorer plus d’articles

Cytométrie en fluxImmunophénotypageManipulateur de liquides automatiséLecteur de codes-barres 2DDistribution de réactifsPréparation d'échantillonsEssai de cytométrie en fluxProtocole semi-automatisé
Une approche semi-automatique pour la préparation des anticorps Cocktails pour immunophénotypique Analyse de sang périphérique humain
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.