Un protocole vidéo étape par étape de résection apicale est démontré dans cette étude. La résection apicale est une approche chirurgicale récemment mise en évidence dans la recherche sur la régénération cardiaque chez les mammifères. Cette étude pourrait promouvoir l’application de la résection apicale comme méthodologie standard dans la recherche sur le mécanisme sous-jacent à la régénération cardiaque.
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Article de méthode
Modèle apicale résection souris pour étude au début de régénération de coeur de mammifère
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les maladies cardiovasculaires empoisonne le monde entier en raison de changements de style de vie intensifs. La régénération cardiaque est très prometteuse pour la réparation et la restauration de cardiomyocytes perdus en raison de blessures et de maladies. Contrairement à la régénération cardiaque robuste de certains vertébrés inférieurs, coeurs de mammifères adultes présentent généralement une capacité minimale pour la régénération et la réparation cardiaque. Cependant, des études récentes ont suscité un intérêt scientifique considérable à la conclusion que, entre le jour postnatal 1 à 7 (P1 à P7), le cœur de souris néonatale conserve potentiel régénératif significative après résection apicale (ie, l'amputation chirurgicale et l'exposition de gauche apex ventriculaire). Une importante controverse sur cette constatation pourrait être due à des procédures liées à la chirurgie-divers utilisés dans les efforts visant à reproduire ou à développer sur cette importante découverte. Ces instructions présentent dynamiquement les matériaux et les méthodes pour la résection apicale dans un modèle de souris. Les étapes marquantes de ce rongeur Survival chirurgie implique l'hypothermie anesthésie, thoracotomie, l'amputation chirurgicale du coeur apex ventriculaire, et la suture et la récupération de la souris. L'approche décrite pourrait étendre l'application du modèle de la souris apicale de résection pour la recherche cardiovasculaire.
Introduction
La durée de vie humaine prolongée entraîne diverses maladies liées au vieillissement et au mode de vie, y compris l’insuffisance cardiaque, l’une des principales causes de mortalité. Cependant, sans le remplacement des cellules musculaires cardiaques perdues ou dysfonctionnelles, les traitements actuels ne peuvent améliorer que transitoirement la fonction cardiaque1, 2. Ainsi, il est nécessaire de découvrir et de développer des stratégies innovantes de régénération et de réparation cardiaques. Le cœur des mammifères adultes a un potentiel de régénération limité. Des études portant sur des vertébrés inférieurs, tels que les amphibiens urodèles et les poissons téléostéens, ont fourni des informations sans précédent sur les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à la régénération cardiaque3, 4. Récemment, un modèle murin néonatal de régénération cardiaque a émergé qui pourrait permettre d’identifier et de caractériser davantage d’événements physiopathologiques conservés au cours de l’évolution nécessaires à la régénération du cœur humain5.
La résection apicale fait référence à l’ablation chirurgicale de l’apex ventriculaire gauche. Cette procédure est limitée aux souris âgées de 1 à 7 jours (P1 à P7) en raison de sa létalité élevée chez les souris plus âgées6. Le processus de régénération cardiaque chez les souris néonatales après une résection apicale devrait être le suivant : (I) formation rapide et efficace d’un hématome pour sceller l’apex et prévenir l’exsanguination ; (II) régénération des cardiomyocytes et restauration de la fonction systolique5, 7. Des travaux récents ont suscité un débat sur l’importance et l’efficacité de ce modèle8-11. Ainsi, il est important de présenter la résection apicale de manière claire et détaillée. À cette fin, ce protocole décrit de manière vivante et spécifique une vidéo de la façon dont j’ai fait une résection apicale basée sur un protocole6 précédent.
La compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à la régénération cardiaque est importante pour le traitement des maladies cardiaques caractérisées par une perte et/ou des lésions de cardiomyocytes, telles que l’insuffisance cardiaque1, 2. Compte tenu des progrès actuels et prometteurs de la résection apicale dans la recherche sur la régénération cardiaque, cette étude pourrait promouvoir l’utilisation de cette technique et ses utilisations dans la recherche sur la régénération cardiaque.
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Protocole
Toutes les expériences de souris ont été approuvés par la protection des animaux et l'utilisation de programme au National Institutes of Health (NIH) avec le numéro de protocole H0083R3. Le NHLBI IACUC approuvé le protocole sans analgésiques.
1. hypothermie anesthésie chez des souris néonatale
- Stériliser les éponges et de matériel chirurgical dans un autoclave avant la chirurgie. Préparer tous les matériaux chirurgicaux et passer sur un stérilisateur à billes chaude 15-20 minutes à l'avance pour atteindre 240 ° C à 270 ° C.
- Transférez tous C57BL / 6 chiots (âge P1) de leur mère qui allaite à une cage de la souris propre avec literie fraîche et matériaux de nidification. Une fois que les chiots sont prises dans une salle de chirurgie, effectuer la chirurgie apicale rapidement afin de minimiser le temps passé séparé de la mère et de réduire le risque de cannibalisation maternelle.
- Mettez des éponges sur un lit de glace et ensuite placer un chiot sur l'éponge pour ~ 3 min pour atteindre l'hypothermie anesthésie. Confirmez l'anesthésie en observant APAEN et l'akinésie et pincer un pied arrière. Vérifiez l'état des nouveau-nés souvent parce que trop peu de temps ne fera pas la akinetic et apnéique chiot, et une durée excessive de l'anesthésie peut abaisser le taux de survie 12.
2. thoracotomie
- Transférer le chiot à partir du lit de glace sur une zone de paillasse chirurgicale et utiliser du ruban adhésif pour immobiliser son bras, les jambes et la queue dans une position couchée.
- Désinfectez la poitrine à l'aide de la bétadine et nettoyer délicatement à l'aide d'un tampon à l'alcool de 70%.
- Faire une incision de la peau transversale le long de la zone de suite intercostal de la cavité de la poitrine à l'aide d'un Vannas printemps ciseaux, puis émousser disséquer les muscles intercostaux de suite pour faciliter l'accès au cœur.
NOTE: Les taux de survie augmentent lorsque la perte de sang est minimisée pendant le processus chirurgical.
3. Amputation chirurgicale de l'apex ventriculaire Coeur
- À la main, appliquer doucement la pression sur l'abdomen d'extérioriser laapex du cœur. Absorber le sang autour de la zone chirurgicale avec des applicateurs de coton-tige stérile pour une visualisation claire. Pour les nouveau-nés de contrôle opérés de manière fictive, passez directement à l'étape 4 (Suture et récupération de souris).
- Sous une lampe loupe et en utilisant des ciseaux iridectomie, effectuez doucement résection fragmentaire du ventricule gauche (VG) jusqu'à ce que la chambre LV est exposée. Prenez soin de réduire les portions de résection de la LV. Environ 15% résection est nécessaire pour obtenir une exposition optimale de la chambre LV.
- Assurez-vous que le cœur retourne à la cavité thoracique, une fois la chambre LV est exposé.
4. Suture et récupération de souris
- Suturer les côtes et les muscles pour sceller la cavité thoracique en utilisant des sutures Proline 6-0 stériles, puis fermez soigneusement le site d'incision de la peau à l'aide de colle de peau.
- Réchauffer le nouveau-né sous une lampe de chaleur pour ~ 3 min de récupération, puis nettoyer les traces de sang et de la colle à l'aide d'un tampon à l'alcool de 70% before réintroduire à ses compagnons de portée. Essayez de compléter la procédure chirurgicale ensemble dans les 10 min parce minimisant le temps passé séparé de la mère améliore la survie des petits après résection apicale.
- Après chaque opération, placer les outils chirurgicaux en contact avec les talons du stérilisateur à billes à chaud pendant environ 20 secondes pour une stérilisation complète. Laisser les outils chirurgicaux à refroidir à température ambiante avant chaque intervention chirurgicale.
- Après avoir terminé les chirurgies pour tous les chiots dans une litière, mélanger les chiots avec la literie et les excréments de la mère avant de les retourner au nid de la mère.
REMARQUE: Généralement, ICR / souris CD-1 sont des mères mieux nourriciers que C57BL / 6, mais même chez les mères allaitantes de même fond génétique, favorisant instincts varient. Si changer une mère qui allaite est nécessaire pour réduire la mortalité maternelle par la cannibalisation, enlever les chiots de P0 à une mère qui allaite, puis effectuer une résection apicale en P1. Seulement effectuer soit l'opération fictive ou de la r apicaleESection en une portée de chiots, car le mélange imposture et chiots chirurgicales pourraient diminuer les taux du groupe chirurgical des chiots 6 de survie.
5. Analyse post-chirurgicales
- Un jour après la chirurgie, surveiller les chiots, assurer qu'il n'y a aucune différence entre imposture et des groupes de chirurgie, et de compter le nombre de chiots pour mesurer le taux de survie. Si les chirurgies sont effectuées correctement, les taux de survie devraient être similaires et supérieur à 60% dans les deux groupes imposture et chirurgicales.
- L'isolement du cœur et de la fixation.
- Euthanasier les chiots à des jours 1 et 2 post-opératoire par décapitation et 21 jours post-chirurgie en CO2 avec une assurance de la mort par dislocation cervicale, puis nettoyer la poitrine à l'aide d'un alcool de préparation de 70%.
- Inciser la peau médiane et le muscle de la poitrine, puis ouvrez le coffre.
- Exciser tout le cœur de la cavité thoracique et fixer l'ensemble du cœur de chaque échantillon dans 5 ml de paraformaldéhyde 4% O / N à température ambiante.
- Le jour suivant, le transfert des échantillons à 70% d'éthanol. Les échantillons peuvent être conservés jusqu'à une semaine avant inclusion dans la paraffine.
- Sections de paraffine 5 um d'épaisseur couper à travers l'ensemble du ventricule et effectuer hématoxyline standard et l'éosine (H & E) et trichrome coloration de Masson pour examiner la réponse régénérative 5, 7. Plus précisément, coloration H & E est utilisée pour examiner le remplacement musculaire et Trichrome de Masson est utilisé d'examiner les réponses fibrotiques 5.
- Sélectionnez la zone d'intérêt et mettre en place au moins trois foyers par échantillon manuellement à l'aide d'un scanner de diapositives. Image et analyser les diapositives de coloration à 40 grossissement selon les instructions du fabricant avec des paramètres par défaut.
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Résultats
Chiots de souris ont été euthanasiées 1, 2, et 21 jours après la résection apicale, et leurs coeurs ont été recueillies pour H & E et Trichrome de Masson. Couleur bleue dans Trichrome de Masson indique le dépôt de la matrice extracellulaire épicardique 5. Avec succès résection apicale, un caillot de sang est formée pour sceller efficacement la LV une résection jour post-apical, comme représenté sur la figure 1A. Une résorption progressive du caillot de sang et la fibrose ...
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Discussion
La régénération cardiaque présente un potentiel pour le traitement et la prévention de l’insuffisance cardiaque1, 2. Les modèles animaux sont indispensables et jouent un rôle essentiel dans la compréhension de la façon dont la régénération cardiaque se produit3-6. De nombreux amphibiens et poissons régénèrent les tissus cardiaques en réponse à une blessure, ce qui donne un aperçu de notre compréhension des maladies cardiovasculaires humaines13, 14. En termes d’évolution, cependant, la phy...
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Déclarations de divulgation
Frais de publication de cet article ont été parrainés par un don de beaux outils de la science pour le Dr Jian Hou.
Remerciements
Les auteurs remercient les Drs. James Hawkins, Zu-Yu Xi Qu Xuan et du National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) pour leur aide à la chirurgie de la souris et la préparation et la coloration des coupes en paraffine. Les auteurs sont reconnaissants à la NIH Fellows Comité de rédaction de l'assistance éditoriale.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Olsen-Hegar Porte-aiguilles avec ciseaux, 1,5 mm | Outils de sciences fines | 12002-12 | |
| Ciseaux à ressort Vannas - 2 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-03 | Ciseaux d’iridectomie |
| Stérilisateur à billes chaudes | Outils de sciences fines | 18000-45 | |
| Pince à iris, droite, dentelée | Outils de sciences fines | 11064-07 | |
| Pince à iris, Courbé, dentelé | Fine Science Tools | 11065-07 | |
| Ciseaux de karité - Courbé/émoussé-émoussé/12cm | Fine Science Tools | 14105-12 | |
| Pince à sertir à poignée ronde, Straight | Fine Science Tools | 18025-12 | |
| Ciseaux à ressort Vannas à manche rond | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Fine Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| Lampe Loupe | Luxolamp Corp | IM120 ; | |
| Lampe chauffante | Brandt Equipment llc | 51152/3 | |
| 6-0 Sutures Prolene | Ethicon | 8889H | |
| Colle pour la peau-Vetbond Tissue Adhesive ; | 3M ; | 1469 | |
| Applicateurs stériles à pointe de coton | Dynarex | 4305 | |
| WEBCOL Tampon de préparation à l’alcool | Covidien | 6818 | Moyen 2 plis, 200/BOÎTE, saturé de 70 % d’alcool isopropylique |
| Curity Éponges tout usage | Covidien | 9024 | Non tissé 4 PLIS, 4"x4 » (10.2cm× ; 10,2 cm) |
| Feuille de protection de paillasse | KIMTECH SCIENCE | 7546 | 18 « x 19,5 » (45,72 cm x 49,53 cm) x 50 |
| 0,9 % de chlorure de sodium, 250 ml | Hospira Inc. | NDC 0409-6138-22 | |
| Bâtonnets de solution de bétadine | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-03 | |
| Autoclave | TOMY Digital Biology | SX-700 | STÉRILISATEUR À VAPEUR HAUTE PRESSION |
| Scanner de lames | HAMAMATSU | NanoZoomer 2.0-RS |
Références
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- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R. Turning back the cardiac regenerative clock: lessons from the neonate. Trends Cardiovasc Med. 22, 128-133 (2012).
- Porrello, E. R., Olson, E. N. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Res. 13, 556-570 (2014).
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- Sadek, H. A., et al. Multi-investigator letter on reproducibility of neonatal heart regeneration following apical resection. Stem cell reports. 3, 1(2014).
- Andersen, D. C., Jensen, C. H., Sheikh, S. P., et al. Response to Sadek et al. and Kotlikoff et al. Stem cell reports. 3, 3-4 (2014).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38, 887-890 (1986).
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Réimpressions et autorisations
