Préparation Facile d'intérieur auto-assemblées particules lipides stabilisés par des nanotubes de carbone

Résumé

Nous rapportons une application intelligente des nanotubes de carbone pour la stabilisation cinétique des particules lipidiques qui contiennent des nanostructures auto-assemblées dans leurs noyaux. La préparation de particules lipidiques nécessite des concentrations plutôt faibles de nanotubes de carbone, ce qui permet leur utilisation dans des applications biomédicales telles que l’administration de médicaments.

Résumé

Nous présentons une méthode facile de préparer des particules lipidiques nanostructurés stabilisés par des nanotubes de carbone (NTC). Monoparois (vierge) et multi-parois (fonctionnalisés) NTC sont utilisés comme stabilisants pour produire de type Pickering (H / E) des émulsions huile dans l'eau. Lipides savoir Dimodan® U et phytantriol sont utilisés comme émulsifiants, qui, dans l'excès d'eau auto-assemblent dans la phase cubique bicontinue Pn3m. Cette phase très visqueuse est fragmenté en petites particules à l'aide d'un appareil à ultrasons de la sonde en présence de stabilisateurs de tensioactifs classiques ou NTC que fait ici. Dans un premier temps, les nanotubes de carbone (en poudre) sont dispersées dans l'eau, puis par traitement aux ultrasons en outre avec le lipide fondu pour former l'émulsion finale. Pendant ce processus, les nanotubes de carbone enrobés d'obtenir des molécules lipidiques, qui à leur tour sont présumées pour entourer les gouttelettes lipidiques pour former une émulsion de particules qui est stable pendant des mois. La taille moyenne des particules lipidiques nanostructurés CNT stabilisées se trouve dans la r submicroniqueange, qui se compare favorablement avec les particules stabilisées en utilisant des tensioactifs classiques. Petit données angle de diffusion des rayons X confirme la conservation de la phase cubique Pn3m origine dans les dispersions lipidiques CNT stabilisées par rapport à la phase lipidique pur (état en vrac). Blue Shift et l'abaissement de l'intensité dans G caractéristique et bandes G 'de NTC observées en spectroscopie Raman caractérisent l'interaction entre la CNT surface et lipidiques molécules. Ces résultats suggèrent que les interactions entre les CNT et les lipides sont responsables de leur stabilisation mutuelle dans des solutions aqueuses. Comme les concentrations de NTC utilisés pour la stabilisation sont très faibles et molécules lipidiques sont en mesure de fonctionnaliser les nanotubes de carbone, la toxicité des NTC devrait être négligeable alors que leur biocompatibilité est grandement améliorée. D'où la présente approche trouve un grand potentiel dans diverses applications biomédicales, par exemple, pour le développement de systèmes de NanoCarrier hybrides pour la livraison de multiple Les molécules fonctionnelles comme dans une thérapie combinée ou une polythérapie.

Introduction

Au cours des dernières décennies, la nanotechnologie a émergé comme un outil puissant en particulier dans le domaine du développement préclinique de médicaments pour lutter contre les maladies notoires telles que le cancer ^1. Dans ce contexte, les structures nanométriques dont la taille est <1000 nm sont largement explorée comme véhicule d'administration de diverses biomolécules actives telles que des médicaments, des protéines, des acides nucléiques, des gènes et des agents d'imagerie diagnostique ^1-4. Ces biomolécules sont soit encapsulés dans des nanoparticules ou conjugués sur la surface de nanoparticules et sont libérés au niveau du site d'action par des déclencheurs tels que le pH ^{de 5,6} ou de la température. Bien que très petite taille, la grande surface de ces nanoparticules se révèle être très avantageux pour l'administration ciblée de biomolécules actives. Le contrôle de la taille des particules et de la biocompatibilité est d'une importance capitale afin d'optimiser l'efficacité thérapeutique et donc l'applicabilité de nanoparticules ^7,8.Lipides ^9-13, polymères, métaux ^{14,15 16,17} et des nanotubes de carbone ^18,19 ont été couramment utilisé comme nanocarriers pour diverses applications biomédicales et pharmaceutiques.

En outre, les applications basées sur NanoCarrier nanostructures auto-assemblées lipidiques ont une grande importance dans de nombreuses autres disciplines, y compris les industries alimentaires et cosmétiques ^20,21. Par exemple, ils sont utilisés dans ²² la cristallisation des protéines, la séparation des biomolécules ^23, comme stabilisants de produits alimentaires, par exemple, dans les desserts ^24, et dans la fourniture de molécules actives, tels que des nutriments, des arômes et des parfums ^25-31. Nanostructures auto-assemblées lipidiques ont non seulement la capacité à libérer des molécules bioactives d'une façon contrôlée et ciblée ^{de 32 à 38,} mais ils sont également capables de protéger les molécules fonctionnelles de la dégradation chimique et enzymatique ^39,40. Bien bicouche fluide plane est le plus commsur nanostructure formée par des molécules de lipides amphiphiles en présence d'eau, d'autres structures telles que des hexagonale et cubique sont couramment observés ^20,41,42. Le type de nanostructure formée dépendent de la structure moléculaire de la forme de lipides, la composition lipidique dans l'eau ainsi que les conditions physico-chimiques utilisées telles que la température et la pression ^43. L'applicabilité de nanostructures de lipides non-planaires en particulier celle des phases cubiques, est limitée en raison de leur viscosité élevée et de non-cohérence homogène de domaine. Ces problèmes sont surmontés par disperser les nanostructures de lipides dans une grande quantité d'eau pour former des emulsions contenant du micron ou inférieure au micron de taille des particules lipidiques huile-dans-eau (H / E). De cette manière, un produit de faible viscosité approprié peut être préparé, tout en conservant la structure auto-assemblée de lipides d'origine à l'intérieur des particules dispersées. La formation de ces particules à l'intérieur de l'auto-assemblées (en abrégé ⁴⁴ ISAsomes Par exemple, des phases et cubosomes hexosomes de phases hexagonales cubes) nécessite généralement une combinaison d'une étape d'entrée d'énergie élevée et l'addition de stabilisants tels que des agents tensio-actifs ou des polymères. Des recherches récentes dans cette direction démontre l'application de diverses particules solides ⁴⁵ dont nanoparticules de silice ^46, argile ^47-49 et des nanotubes de carbone ⁵⁰ pour la stabilisation d'émulsions précitées, convenablement qualifié de Pickering ^{51 ou} émulsions Ramsden-Pickering ^52.

Au cours des dernières années, le carbone nanostructures telles que des nanotubes de carbone à paroi simple (SWCNT) sur la base, les nanotubes à parois multiples carbone (MWCNT) et fullerènes ont reçu beaucoup d'attention en tant que nouveaux biomatériaux ^53,54. Les principales préoccupations sont leur toxicité ^55-58, insolubilité dans l'eau ⁵⁹ et, partant, leur biocompatibilité ^56. Un moyen efficace de résoudre ces problèmes est la fonction de la surfacelisation en utilisant des molécules non toxiques et biocompatibles tels que des lipides. En présence d'eau, interagissent avec les lipides NTC de façon à surface hydrophobe de NTC est protégé de milieu aqueux polaire tandis que les groupes de tête lipidiques hydrophiles facilitent leur solubilité dans l'eau ou d'une dispersion ^60,61. Les lipides sont des composants intégraux des organites cellulaires ainsi que des matières alimentaires, par conséquent, leur décoration devrait idéalement diminuer la toxicité in vivo des NTC. Applications biomédicales à base indépendamment sur ​​NTC ^18,19 et nanostructures lipidiques ^9-13 sont en cours de développement étendu, mais les applications qui combinent des propriétés des deux ne sont pas encore bien explorées.

Dans ce travail, nous utilisons deux types de lipides et de trois types de nanotubes de carbone dont SWCNTs sont sous la forme vierge alors MWCNTs sont fonctionnalisés par des groupes hydroxyle et carboxyliques. Nous avons utilisé des concentrations très faibles de nanotubes de carbone pour préparer les dispersions dontstabilité dépend de plusieurs facteurs, par exemple, le type de lipide, le type de CNT, le rapport de lipide de CNT utilisés, ainsi que sur les paramètres de sonication employées telles que l'énergie et la durée. Ce protocole vidéo fournit des détails techniques d'un procédé de stabilisation cinétique nanoparticules lipidiques en utilisant différents stabilisants CNT.

Protocole

Attention: NTC utilisées dans ce travail sont sous la forme de nanoparticules qui peut avoir des risques supplémentaires par rapport à leurs homologues en vrac. L'inhalation de graphite, à la fois naturels et synthétiques, peut causer une pneumoconiose ⁶² similaire à la pneumoconiose du mineur de charbon. En outre, il y a eu des préoccupations relatives à la toxicité des nanostructures à base de carbone et de quelques-unes des études antérieures suggèrent toxicité aiguë et chronique associée à l'inhalation de NTC ^63-68. Par conséquent, éviter l'inhalation de la poudre de CNT fine et le manipuler avec le plus grand soin. En cas d'inhalation, déplacer à l'air frais. Si la respiration est difficile, utiliser de l'oxygène pur à la place et demander une consultation médicale. formulations Solution / de dispersion des nanotubes de carbone sont plutôt sûrs à manipuler.

Attention: Les lipides et les tensioactifs utilisés dans cette étude sont des matériaux de qualité alimentaire et donc non dangereux en général, mais ils sont irritantes pour les yeux et la peau, et aussi hautement inflammable. Par conséquent, s'il vous plaît utiliser toutes les pratiques de sécurité appropriées telles que l'utilisation de l'ENcontrôles gineering (hottes) et de l'équipement de protection individuelle (lunettes de sécurité, gants, blouse de laboratoire, pantalons pleine longueur, chaussures fermées) lors de la manipulation ou de la préparation des échantillons de nanoparticules. En cas de contact avec la peau ou les yeux, rincer immédiatement la peau ou les yeux avec beaucoup d'eau pendant au moins 15 min. Consulter un médecin si nécessaire.

1. Préparation de lipides phases en vrac / eau

Attention: Conservez les lipides dans le réfrigérateur à 4 ° C. lipides purs de qualité doivent être conservés au congélateur (-20 ° C). Aliquoter en petits flacons de verre pour éviter la contamination de l'ensemble du stock et la commodité de la manipulation. D'autres produits chimiques, y compris les NTC et des tensioactifs peuvent être stockés à température ambiante, mais les garder à l'abri des rayons du soleil.

1. Gardez lipides, à savoir, Dimodan® U (DU) et Phytantriol (PT) à température ambiante pendant 15-20 min avant l'ouverture de la bouteille / couvercle de la cuvette afin d'éviter la condensation.
   (Remarque: L'uranium appauvri est un glycéride distillée comprenant 96% de monoglycérides et lareste sont des diglycérides et acides gras libres. Deux principaux composants du monoglycéride dans UA sont le linoléate (62%) et de l'oléate (25%). D'où la partie hydrophobe de l'UA contient principalement des chaînes C18 (91%), la composition exacte de ce qui est de la façon suivante; C18: 2 (61,9%), C18: 1 (24,9%), et C18: 0 (4,2%), où C18 indique 18C-chaîne et le nombre après virgule indique le nombre de liaisons C = C. PT est un mélange d'isomères optiques 3,7,11,15-tétraméthyl-1,2,3-hexadecanetriol. Il ne contient pas de fonction ester, mais se compose de très ramifié queue phytanyl avec un groupe de tête de tri-hydroxy. Les deux UA et PT forment phases cubes en présence d'un excès d'eau qui est également le cas pour les noyaux de particules lipidiques stabilisées ^{13, 45).}
2. Faire fondre les lipides en mettant flacons dans un bain d'eau chaude ou un bécher contenant de l'eau maintenue au-dessus de 60 ° C (chauffage agitateur magnétique: 230 V, 50 Hz, 630 W ou similaire doit être utilisé pour chauffer l'eau dans un bécher).
3. Alternativement flacons de chaleur à l'aide de chauffe-blocs. Ne pas chauffer le lipide contenant des flacons directement sur la plaque chauffante afin d'éviter gradient de température et après la décomposition des lipides.
4. Peser 500 mg du lipide fondu, en microtube préalablement pesé (avec bouchon de pression conique, 1,5 ml), à l'aide d'une pipette Pasteur en verre avec une ampoule de latex.
5. Ajouter 500 ml d'eau ultra-pure (eau résistivité = 18,2 MQ · cm) sur le tube de microcentrifugeuse ci-dessus.
6. Mélanger les composants manuellement pendant 15 min en utilisant minuscule (construit sur mesure) spatule. Faire une telle spatule en aplatissant l'extrémité pointue d'une aiguille de seringue (0,9 mm x 40 mm de longueur de la canule) en utilisant une pince.
7. Centrifuger le mélange lipide / eau pendant 10 min à une vitesse de 2000 x g. Encore une fois remuer le mélange manuellement pendant 10 min, puis équilibrer pendant 24 heures. Avant la caractérisation des échantillons, les remuer pendant 5 min, puis les laisser à la température ambiante.
8. Afin d'assurer la formation d'une phase lipidique équilibre dans l'ensemble du tube effectuer environ 10 cycles de gel-dégel et inte rmittently effectuer une étape de centrifugation tel que défini ci-dessus. Tant la forme hautement visqueuses phases lipidiques vrac DU et PT qui rend difficile de les gérer manuellement (Figure 1).
   Remarque: Le protocole ci-dessus (article 1) est seulement nécessaire, si l'on voudrait comparer le comportement nanostructurale (type de réseau et les dimensions de l'auto-assemblage) des particules dispersées avec la phase lipidique en vrac et / ou l'utiliser comme un contrôle pour confirmer la maintien de nanostructure origine.

Figure 1. Préparation de l'émulsion H / E en particules avec une consistance fluide à partir de phase lipidique hautement visqueux en utilisant un apport d'énergie élevé (ultrasons) et en utilisant différentes CNT-stabilisants, à savoir SWCNT, MWCNT-OH, MWCNT-COOH (chiffre reproduit à partir de la référence [50] avec la permission de la royal Society of Chemistry)._upload / 53489 / 53489fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. Préparation du tensioactif stabilisé particules lipidiques

1. Préparer un 0,2% (w / w) tensio-actif (Pluronic F127) une solution dans l'eau.
   1. Dissoudre 200 mg de l'agent tensioactif (poudre blanche duveteuse) dans 100 ml d'eau ultra pure en l'agitant pendant 20-30 min (sur une plaque magnétique à l'aide d'un barreau magnétique). Pluronic F127 est un tensioactif non ionique et est couramment utilisé comme stabilisateur d'émulsion. Il est un copolymère triséquencé de PEO ₉₉ -PPO ₆₇ -PEO _99, et prend donc beaucoup de temps à se dissoudre dans l'eau.
2. Ajouter 500 mg d'uranium appauvri ou PT fondu (à l'aide d'une pipette Pasteur en verre) dans un flacon de verre (sodocalcique scintillation muni d'une feuille doublée capuchon d'urée, 20 ml).
3. Ajouter 9,5 g de la solution de F127 à 0,2%.
4. Sur la machine à ultrasons de la sonde, serrer fermement le flacon à la cornue reposer mâchoire (Riposte Stand avecdebout, pince, la base, la tige, le caoutchouc 3 mâchoire et noix), de sorte qu'il puisse résister aux vibrations générées par ultrasons.
5. Insérez la sonde en alliage de titane solide (13 mm de longueur de diamètre x 139 mm) fixée à la cellule Sonicateur. Réglez la hauteur et la position du flacon pour veiller à ce que ses côtés et le fond ne se touchent pas à la sonde. Une distance de 0,5 cm entre la pointe de sonde et le fond du flacon en verre donne de bons résultats.
6. Sonication le mélange pendant 10 min en mode pulsé avec impulsion de 1 sec médiation de 1 sec temps de retard à 35% (le maximum) de puissance. Le flacon devient très chaud en raison de la chaleur produite pendant la sonication. Par conséquent, laissez-le refroidir à température ambiante avant de le prendre au large de la pince.
7. Stocker la dispersion laiteuse formée à température ambiante pendant au moins 24 heures, avant une nouvelle utilisation. Ceci permet d'assurer la stabilité contre une séparation de phase.
   Note: Avant et après l'utilisation de la sonde, la nettoyer avec de l'acétone, sécher avec une serviette de papier, puis rincer à l'eau ultra-pure d'unD sécher une fois de plus.

3. Préparation de dispersions de nanotubes de carbone pur dans l'eau

1. Dans deux béchers séparés, peser 4 mg poudre MWCNT-OH et MWCNT-COOH, qui sont tous deux de couleur noire.
2. Ajouter 500 ml d'eau ultra pure dans chaque bêcher. En utilisant une sonde appareil à ultrasons de traitement par ultrasons les mélanges pendant 2 min dans un mode d'impulsion continue à 40% (le maximum) de puissance. La concentration résultante de la dispersion MWCNT est de 8 pg / ml (solution mère).
3. Diluer la solution mère MWCNT avec des quantités appropriées d'eau ultra pure pour atteindre 6,25, 5, 4, 2 pg / ml dispersions MWCNT.
4. Sonication ces dispersions comme décrit précédemment (voir 3.2).
5. De même, disperser 3 mg de poudre SWCNT (également de couleur noire) dans 500 ml d'eau ultra pure pour faire un / dispersion de SWCNT ml 6 pg (solution mère).
6. Diluer la solution SWCNT de stock et sonication comme décrit ci-dessus (voir 3.2) pour obtenir 0,5, 0,4, 0,3125, 0,2 pg / ml SWCNT dispersions.
   Note: Tous les dispersions sont claires pendant environ 30 minutes, après quoi les NTC commencent à se déposer au fond.

4. Préparation stabilisée de CNT-lipide particules nanostructurées (Figure 1)

1. Peser 500 mg de DU fondu dans un flacon en verre.
2. Ajouter 9,5 ml de la dispersion de SWCNT / ml 6 pg dans le flacon.
3. Sonication du mélange CNT-DU utilisant les mêmes paramètres que ceux utilisés pour la fabrication de dispersions de CNT purs (voir 3.2). Lors du refroidissement à température ambiante, les particules lipidiques CNT stabilisées avec nanostructure conservée à l'intérieur de l'auto-assemblée seront prêts.
4. D'une manière similaire, la préparation des particules de lipides en utilisant des dispersions de SWCNT 0,4 pg / ml et 0,2 pg / ml.
5. Suivre les protocoles 4.1 à 4.4 pour produire des particules de lipides en utilisant MWCNT-OH et MWCNT-COOH, mais en utilisant des concentrations différentes, à savoir 8, 4 et 2 ug / ml de NTC.
6. De même, préparer trois dispersions CNT-PT différentes en utilisant 4 ug / ml MWCNT-OH et MWCNT-COOH Ainsi que 0,4 pg / ml SWCNT. On notera que les dispersions CNT-PT nécessitent moins d'énergie (35% du maximum), mais plus le temps (15 min) dans un mode d'impulsion continue. Refroidir les dispersions à température ambiante et laisser pendant 24 heures avant de les caractériser.
   Remarque: paramètres de sonication peuvent différer selon les lipides (comme pour l'UA et PT ici) et pour différentes compositions; ils doivent être optimisés pour obtenir des dispersions bien stabilisées.

5. Suivi de la stabilité des dispersions lipidiques CNT stabilisées

1. Surveiller la stabilité des dispersions par observation visuelle: vérifier si les dispersions sont déstabilisés ou si des grumeaux se sont formés dans les dispersions.
2. Prenez des photos (avec appareil photo numérique) à intervalles réguliers. Par exemple, prendre des photos de dispersions tous les jours dans la première semaine, puis tous les jours pendant une semaine suivie d'une fois par semaine pour les deux prochaines semaines, et enfin une fois par mois selon l'exigence.

Résultats

Les résultats suivants représentent a) la stabilité des dispersions, b) la distribution des tailles de particules lipidiques, c) le type de l'autoassemblage et d) la preuve de revêtement lipidique des NTC. La stabilité des dispersions (figure 2) a été contrôlé à l'aide d'un appareil photo de 5 mégapixels avec auto-focus et flash LED.

F...

Discussion

La stabilisation des particules lipidiques
Trois NTC différents sont utilisés pour stabiliser les dispersions de lipides; dont deux sont multi-parois et fonctionnalisés utilisant -OH et -COOH, et on est à paroi simple et non fonctionnalisés (vierge). Le CNT a varié en taille comme suit (diamètre x longueur): MWCNT-COOH: 9,5 nm x 1,5 um; MWCNT-OH: 8-15 nm x 50 pm; SWCNT: 1-2 nm x 1-3 pm. Les NTC poudre ont été dispersées dans l'eau par la sonde ultra-sonication. tailles précitées de NTC sont s...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dimodan U	Danisco	15312	Magasin à 4  ; ° ;C. Non dangereux. Irritant pour les yeux et la peau.
Phytantriol (> 95 %, GC)	TCI Europe N.V.	P1674	Magasin à 4  ; ° ;C. Non dangereux. Irritant pour les yeux et la peau.
Nanotubes de carbone à paroi simple (90 %)	Nanostructurés & Amorphus Materials, Inc.  ;	1246YJS	Conserver à température ambiante. À l’abri de la lumière directe. Irritant pour les yeux, la peau et le système respiratoire.
Nanotubes de carbone fonctionnalisés à l’acide carboxylique à parois multiples (>  ; 80 % sur la base Caron, >  ; Acide carboxylique à 8 % fonctionnalisé)	Sigma-Aldrich Co. LLC  ;	755125	Conserver à température ambiante. À l’abri de la lumière directe. Provoque une grave irritation des yeux. Peut provoquer une irritation respiratoire.
Nanotubes de carbone fonctionnalisés hydroxy multi-parois graphitisés (99,9 %)	Nanostructuré & Amorphus Materials, Inc. (NanoAmor)  ;	1224YJF	Conserver à température ambiante. À l’abri de la lumière directe. Irritant pour les yeux, la peau et le système respiratoire.
Pluronic F127	Sigma-Aldrich Co. LLC  ;	P2443	BioReagent, adapté à la culture cellulaire. Il ne s’agit pas d’une substance ou d’un mélange dangereux. Conserver à température ambiante.
Acétone (99,5 %)	Fisher Scientific  ;	10134100	Liquide hautement inflammable. Provoque une grave irritation des yeux. Peut provoquer de la somnolence ou des étourdissements.
Bocaux avec couvercles amovibles et enveloppants (375  ; ml)	VWR International Ltd	216-3308
Bécher, 1 000 ml	Fisher Scientific  ;	12942161	pipette en verre Pasteur à usage intensif, de forme basse, avec bec et graduations
(longueur 150 mm) avec poire en latex	Fisher Scientific  ;
Tube de microcentrifugation bouchon conique 1.5  ; ml	Fisher Scientific  ;
11558232 Spatule	Fisher Scientific  ;
Agitateur magnétique chauffant	Fisher Scientific  ;
Barres d’agitation magnétiques (cylindriques, opaques, PTFE, 30  ; mm x 7  ; mm (l x diamètre))Fisher	Scientific  ;
Aiguille (0,9 mm x 40 po ; mm longueur de la canule)	Terumo UK Ltd	MN-2038MQ
Set de support d’autoclave - Avec support, pince, base, tige, caoutchouc 3 mâchoires et bossage	Camlab Ltd, Royaume-Uni	1177157
Équipement d’eau Millipore	Barnstead Nanopure, Thermoscientific, USA
Progen Genfuge 24D Microcentrifugeuse numérique	Progen Scientific	C-2400
Ultra-sonicateur, avec 13 mm  ;	SONICS, Vibracell, etc. USA
Appareil photo 5 MP avec autofocus et flash LED	Samsung Galaxy Fame Appareil photo
Spectromètre Raman	Horiba Jobin-Yvon LabSpectromètre
Mastersizer 3000	; Malvern Instruments Ltd, Malvern, Royaume-Uni
Diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS)	Caméra SAXSpace (Anton Paar, Graz, Autriche), équipement de génération de rayons X (ISO-DEBYEFLEX3003, GE Inspection Technologies GmbH), circuit d’eau fermé (Chilly 35, HYFRA, Allemagne).  ;