Article de méthode

Un nouveau-né de la moelle épinière de souris Compression Modèle de lésion

DOI :

10.3791/53498

⸱

27 mars 2016

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, Oslo University Hospital, 2Norwegian Center for Stem Cell Research, Oslo University Hospital, 3Laboratory of Neural Development and Optical Recording (NDEVOR), Department of Physiology, Institute of Basic Medical Sciences, University of Oslo

Dans cet article

Résumé

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Cet article décrit une méthode permettant de générer une lésion par compression de la moelle épinière (LME) reproductible chez la souris néonatale. Le modèle fournit une plate-forme avantageuse pour étudier les mécanismes de plasticité adaptative qui sous-tendent la récupération fonctionnelle spontanée.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

lésion de la moelle épinière (SCI) provoque généralement des déficits neurologiques dévastateurs, en particulier par des dommages aux fibres qui descendent du cerveau à la moelle épinière. Une zone actuelle majeur de la recherche se concentre sur les mécanismes de plasticité adaptative qui sous-tendent la récupération fonctionnelle spontanée ou induite suivant SCI. la récupération fonctionnelle spontanée est signalée comme plus tôt dans la vie, ce qui soulève des questions intéressantes sur la façon dont les changements de plasticité adaptative que la moelle épinière se développe. Pour faciliter la recherche de cette dynamique, nous avons développé un modèle SCI chez la souris néonatale. Le modèle présente un intérêt pédiatrique SCI, qui est trop peu étudié. Parce que la plasticité neuronale chez l'adulte implique certains des mêmes mécanismes que la plasticité neuronale dans la vie précoce 1, ce modèle peut potentiellement avoir une certaine pertinence aussi pour adultes SCI. Nous décrivons ici toute la procédure pour générer une blessure reproductible compression de la moelle épinière (SCC) chez la souris néonataledès postnatal (P) le jour 1. Le CCN est atteint en effectuant une laminectomie à un niveau spinal donné (ici décrit aux niveaux thoracique 9-11), puis en utilisant un Yasargil anévrisme mini-pince modifiée pour compresser et décompresser rapidement la moelle épinière . Comme décrit précédemment, les souris néonatales blessé peut être testé pour les déficits comportementaux ou sacrifiés pour une analyse ex vivo physiologique de la connectivité synaptique en utilisant des techniques d'enregistrement optique électrophysiologiques et à haut débit 1. Des études antérieures et en cours en utilisant l' évaluation comportementale et physiologique ont démontré une déficience dramatique, aiguë de hindlimb motilité suivie d'une récupération fonctionnelle complète dans les 2 semaines, et la première preuve de l' évolution des circuits fonctionnels au niveau des connexions synaptiques identifié descendant 1.

Introduction

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Au cours de la dernière décennie, de plus en plus de preuves obtenues à partir de différents modèles de lésions de la moelle épinière (LME) ont montré que les réseaux rachidiens peuvent se réorganiser spontanément pour contribuer à la récupération fonctionnelle1-9. La plasticité adaptative est donc devenue un sujet important dans la recherche sur les LME. Il a été démontré que la plasticité englobe la repousse des axones épargnés, la germination de nouvelles collatérales axonales et la formation de nouvelles connexions synaptiques. Une grande partie de ces connaissances a été obtenue à partir d’études comportementales ou anatomiques chez des animaux adultes. Une limitation importante des études de la moelle épinière adulte est la difficulté d’effectuer une évaluation physiologique à haut débit, ce qui est plus facile dans les préparations néonatales1. Une différence majeure est que les préparations ex vivo complètes du tronc cérébral et de la moelle épinière adultes ont une faible viabilité. Une autre est que le tissu rachidien adulte est plus opaque à la lumière car il est plus épais et myélinisé. Bien que les progrès récents de l’imagerie in vivo (voir par exemple 10-12) puissent résoudre partiellement ces problèmes, la possibilité d’effectuer une imagerie à haut débit à n’importe quelle profondeur dorso-ventrale souhaitée à plusieurs endroits le long d’une préparation donnée du tronc cérébral et de la moelle épinière n’est actuellement réalisable que chez les nouveau-nés. L’état immature de la myélinisation axonale dans la moelle épinière néonatale facilite l’enregistrement optique ex vivo à haut débit, permettant ainsi une évaluation dynamique des connexions synaptiques fonctionnelles13-17. Combinées à des rapporteurs de calcium génétiquement codés et à des outils de stimulation optogénétique et de pharmacologie, les approches optiques peuvent contribuer à une compréhension plus profonde des mécanismes sous-jacents à la plasticité adaptative.

On estime qu’entre 1 et 10 % de toutes les lésions de la moelle épinière touchent les nourrissons et les enfantsde 18 à 22 ans. Contrairement à la lésion médullaire chez l’adulte, la pathogenèse et le potentiel de guérison spontanée dans la lésion médullaire pédiatrique sont moins étudiés. L’utilisation d’un modèle de LME néonatale peut donc fournir plus de connaissances sur les LME pédiatriques et contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes pathogéniques et de récupération impliqués. De plus, on pense que la plasticité post-LME favorisant la récupération fonctionnelle dans la moelle épinière adulte implique au moins en partie les mêmes mécanismes qui régissent le développement du système nerveux central, tels que la croissance axonale, la ramification et la formation de nouvelles synapses23-26. Ainsi, l’utilisation d’un modèle de LME néonatale pourrait fournir des informations importantes sur les mécanismes qui sont également opérationnels dans la moelle épinière adulte, ou qui pourraient potentiellement être réintroduits dans la moelle épinière adulte (par exemple par l’implantation de cellules ou de tissus fœtaux ou de tissus construits de novo à partir de cellules souches pluripotentes) pour faciliter la récupération.

La souris néonatale fournit ainsi une plate-forme pour une approche intégrative et multiméthodologique de l’étude de la plasticité adaptative après une lésion de la moelle épinière, dans laquelle une combinaison de méthodes comportementales, physiologiques, anatomiques, moléculaires et génétiques peut être facilement utilisée. L’établissement de modèles normalisés de lésions néonatales est une étape importante dans la mise en œuvre de telles études.

Protocole

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Ce protocole expérimental a été approuvé par l'Autorité nationale de la recherche animale en Norvège (Forsøksdyrutvalget, numéro local expérimental d'approbation 12,4591) en conformité avec les règlements de l' Union européenne de protection des animaux (Fédération Laboratoire Européen Association Animal Science). Des efforts ont été faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés et leurs souffrances. Dans cet article, la procédure utilisée sur postnatal (P) le jour 1 de type sauvage ICR (Région de contrôle imprinting) souris (Jackson, Etats-Unis) est décrite, mais la même approche peut également être utilisé à des stades ultérieurs.

1. Construire un système d'anesthésie au gaz pour souris néonatale (Figure 1)

  1. Construire un nez-masque de la pointe d'une seringue. Connectez - le à la robinet à 3 voies avec des tubes en plastique (Figure 1 - tube rouge et figure 2A1).
  2. Percez un petit trou dans le côté du masque nasal et le raccorder à des tubes en plastique pour enlever le trop-plein de gaz de lamasque. Terminez le tube soit à une pompe à vide fixée pour une légère pression négative, ou dans une hotte (Figure 1 - tube vert clair).
  3. Faire une chambre d'anesthésie d'un x 25 mm en plastique boîte de Pétri de 150 mm (figure 2A2).
    1. D'un côté, faire un trou assez grand pour accueillir la tête de la souris et le masque de nez.
    2. Sur le côté opposé, faire deux petits trous à travers lesquels les tubes en plastique vers et à partir du masque nasal peuvent être insérés (Figure 1 - tube rouge et vert clair, respectivement).
    3. Faire un troisième trou sur le dessus du couvercle et attacher à cela un troisième tube en plastique qui se termine à la pompe à vide (Figure 1 - tube vert foncé). Le but de ce troisième tube est de faire en sorte que le gaz en excès qui n'a pas été capturée par la sortie du masque nasal est enlevé.
  4. Construire une chambre de sommeil en faisant un trou dans le fond de tout type de plat de laboratoire qui est assez grand pour contain la souris et a un bord lisse et même (l'ouverture du plat doit se trouver au ras de la table pour éviter les fuites de gaz). Branchez le trou dans la chambre à la robinet à 3 voies avec des tubes en plastique (Figure 1 - tube brun). Placez la chambre de dormir sous une hotte.
  5. Connectez un robinet 3 voies sur le tube de sortie du vaporisateur (Figure 1 - tube jaune et figure 2A3).
  6. Connecter l'entrée de l'évaporateur à l'alimentation en oxygène (Figure 1 - tube bleu).

2. Modification d'un Yasargil temporaire Aneurysm Mini-clip pour créer l'outil de compression (figure 2 et tableau 1)

  1. Apposer le clip fermement à un support avec une pince. L' utilisation d' une loupe binoculaire pour le contrôle visuel, limer la surface extérieure de la pointe de chaque lame de clip pour une épaisseur finale d'environ 150 um en utilisant une pierre à aiguiser montée sur une perceuse (figure 2B et C).
  2. Faire une butée pour l'agrafe en coupant un court tronçon de tube de polyéthylène capillaire (Tableau 1) sous une loupe binoculaire à l' aide d' un micro-couteau (tableau 1), et placer ce sur une des lames (figure 2A4 et les Figures 2B et C). Cela empêche la fermeture complète du clip et crée des cotes de compression normalisées. Lorsque le clip est fermé la distance interpale est d'environ 230 um. Faire un nouveau bouchon pour chaque expérience en tant que matériau de polyéthylène peut comprimer pendant l'utilisation, ce qui modifierait l'espace interpale.
    Remarque: La tension du ressort du clip diminue au fil du temps de sorte que, après environ 80 compressions le clip ne se ferme complètement au bouchon et doit être remplacé.

3. Préparation avant la chirurgie

  1. Placez la souris dans la chambre de sommeil (Figure 1) et initier une anesthésie avec 4% d' isoflurane (Figure 2A5 ) Vaporisée dans l' oxygène pur, à l' aide d' un vaporisateur (figure 2A3 et tableau 1).
  2. Testez le réflexe de retrait de la souris en pinçant doucement la bande de peau entre les orteils avec une fine pince en plastique. Pour ce faire, attentivement, car les souris nouveau-nés sont facilement blessés. Pincement résultats trop dur dans ecchymoses immédiat. Effectuer ce test au début de la sédation déclenche le réflexe et fournit une bonne indication de la quantité de force nécessaire.
  3. Une fois que le réflexe est supprimé, retirer la souris à partir de la chambre de veille et le placer dans une position couchée sur la table d'opération avec le museau inséré dans le masque nasal qui fournit une alimentation continue de 4% d' isoflurane mélangé à de l' oxygène pur (figure 1). Assurez-vous que le coussin chauffant est activé et réglé à 37-38 ° C, comme l'hypothermie pendant la chirurgie peut être fatale.
  4. Pour obtenir une analgésie complète, injecter par voie sous- cutanée 50 pi de l'anesthésique local bupivacaïne (2,5 mg / ml, Figure 2A6) sur le site de la chirurgie (dans les expériences rapportées ici, ceci est au niveau thoracique (T) 9-T11). Utiliser une seringue d'insuline (300 pi, 30 G, Figure 2A7 et tableau 1) pour effectuer l'injection.
  5. Réduire la concentration d'isoflurane remis au masque de nez à 1-2%.

4. Dorsale laminectomie

  1. Effectuer la chirurgie sous contrôle microscopique.
  2. Après le nettoyage de la zone de chirurgie avec le gluconate de chlorhexidine (tableau 1 # 19) pendant au moins 30 secondes, faire une incision cutanée transversale 1-2 mm à T9-T11 en utilisant un microknife (figure 2A8).
    Note: Chez les souris néonatales ICR la partie rostrale de l'estomac, lorsqu'il est visible , il contient du lait, est confronté à des niveaux vertébraux T12-T13 (Figure 3). Un autre point de repère est la partie rostrale de l'agrégat adipeux sous-cutané thoracique de tissu qui se termine à environ T8-9. Ce point de repère est visible après l'incision de la peau.
  3. Utilisez une pince (Figure 2A9 et A10) pour élargir l'ouverture de la peau dans une direction transversale à 8-9 mm en tirant sur ​​la peau en douceur rostrale et caudale (la peau se déchire facilement, créant une plaie lisse et droite). Ceci permet d'obtenir un accès latéral suffisant pour la colonne vertébrale.
  4. Rétracter les bords de l'incision de la peau des structures sous - jacentes par l' insertion de pièces stériles éponge de gélatine hémostatique (figure 2A11 et tableau 1) sous - cutanée rostrale et caudale par rapport à l'incision. Ceci élargit l'ouverture et empêche la peau de se rétracter et d'obscurcir la zone pendant la chirurgie. La gélatine éponge hémostatique n'a pas besoin d'être trempés dans une solution saline avant utilisation.
  5. Exposer la colonne vertébrale, disséquer les muscles paravertébraux à l' aide de ciseaux fins (figure 2A12 et tableau 1). Couper les attaches des muscles à la colonne vertébrale et d' exposer la feuille (figure 4A). ne pase également que, à ce stade du processus spinale est sous-développé.
  6. Identifier la ligne médiane et couper transversalement entre les deux lames (qui à ce stade est cartilagineuse) avec des ciseaux minces (figure 4B). Placez délicatement une lame d'une fine pince entre la lame et la dure - mère (figure 4C), saisir la lame avec la pince et soulevez - le soigneusement jusqu'à une pièce se détache, laissant la dure - mère intacte (figure 4D). Répétez cette opération 2-3 fois pour obtenir une longue laminectomie 1-2 segment.
  7. En utilisant les forceps minces comme Rongeurs, enlever les parties des facettes articulaires au niveau bilatéral pour gagner assez d'espace pour placer le clip dans le canal vertébral. Nettoyer la zone chirurgicale et contrôler le saignement avec de petits morceaux de hémostatique éponge de gélatine.

5. Spinal Cord Injury Compression

  1. Ouvrez l'anévrisme mini-pince modifiée dans le porte-pince (Figure 2A13 et figure 2B) et lieu ee lames de chaque côté de la moelle épinière dans l'espace entre la facette jointures et le cordon. Assurez-vous que les lames sont insérées assez profondément pour affecter la partie ventrale de la moelle épinière. Si cela est impossible, supprimer plusieurs des facettes articulaires.
  2. Relâchez le mini-pince rapidement, en le tenant en place avec le porte-clip pour l'empêcher de glisser. Maintenir la compression pendant 15 secondes.
  3. Ouvrez le mini-pince rapidement et retirez-le. Pour parvenir à une compression symétrique, inverser l'orientation de la mini-pince, et en utilisant la marque facilement vu faite par l'oedème hémorragique de la première compression comme un guide, repositionner le clip dans l'orientation inverse pour une seconde compression de 15 secondes (avant expérience a montré que cela génère des déficits histologiques et physiologiques symétriques, alors que les compressions ne sont pas simples 1). La dure ne doit pas être endommagé par la compression.
  4. Nettoyez la zone et maintenir l'hémostase avec des morceaux de hémostatique éponge de gélatine.
  5. Retirez les morceaux de hémostatique éponge de gélatine qui ont été placés sous les bords de l'incision de la peau au début de la chirurgie et de fermer l'incision cutanée avec stérile 6.0 suture et un porte-aiguille (Figure 2A14 et 15).
  6. Injecter par voie sous- cutanée de 0,75 mg / kg de poids corporel buprénorphine (figure 2A16) dilué dans du PBS stérile en utilisant une seringue d'insuline (300 ul, 30 G).

6. Soins postopératoires

  1. Retirez la souris du masque nasal et le placer dans une chambre ensemble à température contrôlée à 30 ° C jusqu'à ce que l'anesthésie se dissipe et la souris devient alerte (1-3 heures est généralement suffisante).
  2. Injecter Diazepam (Figure 2B17) par voie intrapéritonéale à la mère (8 g / kg de poids corporel). Cela crée une torpeur qui diminue le risque de cannibalisme au cours de la première nuit, lorsque ce risque est le plus élevé.
  3. Retour de la souris actionné pour la litière.
  4. Si la litière est large (> 12 chiots), supprimer certains des chiots non opérés, préférentiellement les grands animaux si elles diffèrent par la taille, afin de réduire la concurrence pour le lait. Les soins maternels des chiots exploités est le meilleur dans la ligne ICR si la taille de la portée est d'environ 9 chiots.
  5. Pour la gestion de la douleur, administrer la buprénorphine (0,75 mg / kg de poids corporel) par voie sous cutanée une fois par jour pendant les premiers jours postopératoires, en utilisant une seringue d'insuline (300 pi, 30 G). Un volume approprié pour l'injection sous-cutanée est de 30-50 ul. Dans néonatale vocalisation de souris et l'agitation sont de bons indicateurs de la douleur.
  6. Effectuer un examen quotidien des souris blessées en utilisant une feuille de pointage pour évaluer la nutrition, le poids corporel, la déshydratation, la douleur, la cicatrisation des plaies, la rétention d'urine et l'état de l'infection. Selon le score obtenu, fournir des soins spéciaux, tels que des injections d'une solution stérile pédiatrique nutrition (tableau 1 # 18) en cas de nutrition anormale. La feuille de pointage aussi0; définit les critères finaux humains. Une mère qui ne rejette pas les chiots blessés est le meilleur soignant.
  7. Dans le cas inhabituel de dysfonctionnement de la vessie, la vessie effectuer le massage deux fois par jour jusqu'à ce que la fonction est restaurée. Ceci est fait en plaçant la souris dans une position couchée dans une main et masser le bas-ventre doucement dans une direction rostro-caudale en utilisant un doigt.

Résultats

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Spinal blessures de compression de la moelle et la perte de fonction

Comme décrit précédemment, en optimisant les procédures pré - opératoire, la chirurgie post - opératoire et un modèle de compression SCI reproductible chez la souris néonatale peut être obtenue 1. Le bouchon en polyéthylène placé sur une lame de la pince (Figure 2B et C) empêche la fermeture complète du clip et maintient la distance inter-lames toujours à environ 230 um. Inverser l'orientation de la pince entre les deux résultats des compressions dans une blessure symétrique, à en juger par les séquelles histologiques (figure 5A et 1). Immédiatement après le retrait mini-clip, le tissu de la moelle épinière comprimée devient plus sombre en raison de contusion hémorragique et de l'œdème. Observation des coupes en série de la moelle épinière lésée colorées pour l'éosine et l'hématoxyline déjà un jourblessure révèle une détérioration progressive près avoir du tissu à l'approche de l'épicentre de la lésion (figure 5A). La présence de cavités intramédullaires ou de sang dans la lésion est pas rare.

Évaluation du comportement, par exemple en assurant le suivi des trajectoires des membres postérieurs dans des conditions non poids des conditions portant quelques heures après la chirurgie, montre une altération spectaculaire de la patte arrière de la motilité chez des souris SCC lésé par rapport aux souris témoins sham dans lequel seule une laminectomie est effectuée (figure 5B et 1) . Ce test peut être répété jusqu'à ce que la souris est en mesure d'effectuer d' autres tests comportementaux qui nécessitent portant son propre poids 1.

La mortalité et la récupération après la chirurgie

la mortalité peropératoire est principalement due à l'apnée et un arrêt cardiaque provoqué par la forte concentration d'isoflurane nécessaire pour atteindre anesthésiologistes suffisanteune. Présentation de l'anesthésie locale bupivacaïne dans le protocole chirurgical permet une réduction de la concentration d'isoflurane et diminue ainsi de manière significative le taux de mortalité. Dans une série expérimentale récente, y compris plus de 20 animaux, le taux de mortalité peropératoire était nulle. En revanche, la survie post-opératoire est principalement influencée par l'acceptation des souris exploités par leur mère. Une amélioration significative a eu lieu lorsque l' anxiété et l' agressivité a été réduite en fournissant une seule injection de diazépam (ip 8 g / kg de poids corporel) à la mère avant de retourner les souris exploitées à la litière 1. L'acceptation et la récupération post-opératoire des souris exploitées peuvent être surveillés par la présence de lait dans l'estomac. L'estomac d'une souris P1-P7 qui a le lait ivre est clairement blanc et visible à travers la peau abdominale (Figure 3). Comparaison de l'alimentation en fonctionnant, le contrôle imposture et les souris non opérée est utile pour évaluer l'état nutritionnel de blessersouris d. L' évaluation de la croissance des exploités contre les souris non opérée montre que , malgré une petite perte de poids pendant le premier jour post-opératoire, la courbe de souris fonctionnant de croissance normalise rapidement par la suite (figure 6). La mortalité liée à un dysfonctionnement de la vessie ou une infection n'a jamais été observée chez les souris étudiées, même aussi longtemps que 7 semaines.

Numéro de la Fig. 2 prénom Fabricant / Fournisseur Référence # Lien Commentaire
1 seringue en plastique (30 ou 50 ml)
2 boîte de Pétri en plastique (150 x 25 mm)
3 Vaporisateur isoflurane Fortec Cyprane http://www.mssmedical.co.uk/products/new-vaporisers/ Nous utilisons et ancien appareil de production, vérifier le lien pour plus récent dispositif
4a Yasargil anévrisme temporaire mini-pince Aesculap FE681K http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
4b Fin alésage polyéthylène capillaire tube ID 0,58 mm, 0,96 mm OD Smiths Medical 800/100/200 http://www.smiths-medical.com/industrialproducts/8/39/
5 Isoflurane (Forene) Abbott GmbH & Co. KG http://www.life-sciences-europe.com/product/forene-abbott-gmbh-wiesbaden-group-narcotic-germany-west-2001-1858.html
6 Marcain (bupivacaïne) AstraZeneca http://www.astrazeneca.co.uk/medicines01/neuroscience/Product/marcaine
7 Insuline seringue 0,3 ml 30 G x 8mm VWR 80086-442 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4646138
8 Beaux Micro Knife bord Ultra de coupe de 5 mm Beaux Science Tools 10315-12 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0019900000 & reloadmenu = 1
9 Forceps supplémentaires Beaux Graefe - 0,5 mm Astuce Beaux Science Tools 1153-10 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0055700000 & reloadmenu = 1 		Pas vraiment nécessaire, souvent les dents sont trop gros
10 Forceps SuperGrip droite Beaux Science Tools 00632-11 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0053500000 & reloadmenu = 1 		Deux pinces sont nécessaires
11 Spongostan spécial 70 x 50 x 1 mm Ferrosan
12 Vannas Spring Ciseaux - 2 mm lames droites Beaux Science Tools 15000-03 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0012800000 & reloadmenu = 1
13 Vario clip Application Forceps Aesculap FE502T http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
14 Vicryl 6-; 0 (Ethicon) Johnson et Johnson J105G
15 porte-aiguille micro Diethrich 11-510-20 http://trimed-ltd.com/Products/Suture-Instruments/Micro-Needle-Holders-With-Tungsten-Carbide-Inserts/Ref-11-29.html
16 Temgésic (buprénorphine) Schering-Plough
17 Stesolid (diazépam) Actavis Aussi connu sous Valium
18 Pedamix Fresenius Kabi http://www.helsebiblioteket.no/retningslinjer/pediatri/mage-tarm-lever-ern%C3%A6ring/parenteral-ern%C3%A6ring
19 Klorhexidinsprit (gluconate) Fresenius Kabi D08A C02 http://www.felleskatalogen.no/medisin/klorhexidinsprit-fresenius-kabi-klorhexidinsprit-farget-fresenius-kabi-fresenius-kabi-560639

Tableau 1. Liste des outils et équipement pour la génération d' une blessure à la compression de la moelle épinière entraîné clip dans une souris néonatale.

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Figure 1. Schéma de configuration anesthésie. Ce schéma présente la configuration de l' anesthésie conçu pour la souris néonatale, avec une chambre de sommeil pour l' anesthésie initiale et un dispositif de masque nasal pour l' anesthésie continue pendant la chirurgie.

figure-results-2
Figure 2. outils principaux et clip de compression. (A) Les outils utilisés pendant la procédure. Les chiffres correspondent à l'annotation utilisée dans le tableau 1. (B et C) Un Yasargil anévrisme temporaire mini-clip avec la pointe de chaque lame taillée manuellement à environ 150 um d' épaisseur. Un bouchon constitué d'un morceau de tuyau en polyéthylène ( voir le tableau 1) est placé sur l' une des pales pour empêcher la fermeture complète de l'agrafe. Barre d'échelle: 2 mm. App: Clip applicateur (n ° 12 à A); St:. Bouchon S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-3
Figure 3. Point de repère pour l' évaluation préopératoire du niveau spinal dans néonatale souris ICR. (A) Vue latérale d'une souris P1 ICR avec du lait blanc dans les s correspondre. La partie rostrale de l'estomac correspond à T12-T13 niveau spinal. (B) P1 souris ICR sous anesthésie dans une position couchée. Bien que plus difficile à visualiser par rapport à (A), l'estomac rempli de lait est reconnaissable. La partie rostrale de l'estomac indique T12-T13 niveau spinal. Barres d'échelle: 0,5 cm.

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Figure 4. Dorsale laminectomie. (A) Dissection des muscles paravertébraux. Notez que, à cet âge le processus spinal est sous-développé. (B) Transversal tronçonnage du limbe avec des ciseaux fins. (C) introduction d'une lame d'une fine pince entre la lame et la dure - mère. Le point d'entrée est indiquée par la flèche. (D) Retrait du limbe. Barre d'échelle: 2 mm.

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Figure 5. histologiques et les résultats comportementaux après la moelle épinière de compression à P1. (A) éosine et hématoxyline coloration dans les sections de la moelle épinière d'une souris blessée (1 jour après la blessure) à une distance différente de l'épicentre de la blessure. (B) des traces représentatives des membres antérieurs et postérieurs des trajectoires observées 6 heures après une blessure ou après une laminectomie de commande factice. Traces sur le dessus représentent les trajectoires vues à partir d'une vue latérale de l'animal. Des traces du bas représentent les trajectoires vus à partir de la face ventrale de l'animal. Voir aussi 1. Barre d'échelle: 250 um. DH: corne dorsale; L, à gauche; R: right; SCC: compression de la moelle épinière; VH:. Corne ventrale S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 6. courbes de croissance comparatives. Histogramme montrant le gain de poids des souris blessées et non opérée SCC de jour postnatal 1 au jour postnatal 9.

Discussion

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Dans cet article, les procédures pour un SCC blessures clip généré chez la souris P1 sont décrites. Les mêmes procédures peuvent également être effectuées à un stade ultérieur. Les blessures de compression ont été effectués avec succès à P5, P7, P9 et P12 (Züchner, et al., Manuscrit en préparation). À tous les stades postnataux, l'anesthésie générale est obtenue avec l'isoflurane vaporisé dans l'oxygène pur, mais le résultat anesthésique dépend fortement de l'âge. Dans des tentatives initiales de P1-P4, avant l'anesthésie locale a été introduit dans le protocole, il était difficile d'obtenir une sédation profonde et prolongée en raison d'une fenêtre étroite dose-effet entre la sédation insuffisante et un surdosage. En outre, les préoccupations liées à un effet neurotoxique de l' isoflurane chez les animaux nouveau - nés ont été soulevées 27-30. Une combinaison de l'isoflurane et les résultats anesthésique local bupivacaïne une anesthésie profonde et plus stable tout en permettant une réduction de la dose isoflurane par un facteur de 2-3. Différents types de anesthesia ont été décrits pour les rongeurs néonatals, y compris cryoanesthesia 31,32, mais un inconvénient potentiel de cryoanesthesia est son effet neuroprotecteur (examiné par 33,34), ce qui pourrait compliquer la génération d'une blessure efficace et reproductible. L' anesthésie à base de barbituriques est considéré comme ayant une efficacité moindre chez la souris néonatale due à des niveaux inférieurs de l' albumine sérique et la graisse corporelle que chez les adultes 35,36.

Bien que très invasive et traumatisante, une fois que la procédure est établie, le taux de mortalité au cours de la chirurgie est faible. Cependant, il y a des étapes critiques au cours de la procédure qui nécessitent une attention particulière pour améliorer la récupération et à la survie des souris exploités. Une question importante est de sélectionner les chiots qui auront les meilleures chances de survivre à la chirurgie. Lorsque la litière est grande l'état nutritionnel des chiots individuels varie. En plus du saignement qui se produit inévitablement lors de la chirurgie, les petits opérés passent heuress loin de la mère, et souvent ils ne boivent pas de lait avant le lendemain matin. Il est donc un avantage pour sélectionner les chiots qui ont déjà une certaine quantité de lait dans l'estomac. Ceci est facilement visible à travers la peau abdominale de P0 à P7.

Au cours de la première nuit du chiot exploité est à grand risque d'être cannibalisé par la mère. Au cours du développement initial de ce modèle plus de la moitié des souris opérés étaient absents le lendemain matin, avec des signes clairs de sang dans la cage. Nécrophagie, le cannibalisme et l' infanticide chez les rongeurs ont été étudiés depuis des décennies 37-40. Dans cette étude, le cannibalisme ne fut témoin une fois, mais il a été considéré comme une explication plus susceptibles que nécrophagie parce que les chiots qui ont été retournés à la cage étaient généralement en si bonne forme que la mort par des causes naturelles pendant la nuit semblait improbable. Cela a incité l'idée d'utiliser un agent pharmacologique réversible, comme le diazépam pour réduire l'anxiété et l'agressivité in la mère (revue par 41). l'injection intrapéritonéale de diazepam a grandement amélioré la situation, laissant tomber la mortalité au cours de la première nuit de plus de 60% à moins de 20%.

Réduire la taille des portées par l'abattage et de perturber la litière aussi peu que possible après le retour postopératoires sont des éléments supplémentaires qui peuvent bénéficier les animaux opérés. Toutefois, en laissant les chiots seulement exploités avec la mère est pas bénéfique. Le meilleur équilibre des chiots non opérés opérés / peut varier en fonction de la ligne, mais pour ICR et SCID-ICR souris quittant 4-5 chiots exploités (de blessures ou fictives) avec 3-4 chiots non opérés a donné les meilleurs résultats.

Dans un sens général, la limitation principale de ce modèle SCI néonatale est que la moelle épinière néonatale diffère à plusieurs égards de l'adulte, la moelle épinière et ne peuvent donc pas fournir des résultats expérimentaux qui sont comparables à celles obtenues à partir de modèles SCI adultes. De telles différences incluent la taille globale etvolume de la moelle épinière, le nombre de cellules, une sous-représentation des types de cellules spécifiques, telles que les oligodendrocytes immatures, des réponses immunitaires et les circuits de neurones immatures. Les conclusions tirées des expériences dans ce modèle doivent donc être considérées avec précaution. D'autre part, le modèle est pertinent pour le scénario relativement moins étudié pédiatrique SCI. En outre, la faiblesse apparente par rapport aux modèles SCI adultes est aussi une force potentielle car elle peut permettre à l'élucidation des mécanismes de plasticité qui, bien que peu existant dans la moelle épinière adulte, pourraient représenter un substrat thérapeutique si la réintégration. Il est concevable que le rétablissement des conditions néonatales ou même embryonnaires pourrait être mis en œuvre par l'implantation de cellules ou de tissus moins développés ou par traitement avec des réactifs qui engendrent le tissu adulte avec des caractéristiques antérieures de développement. En utilisant des enzymes pour éliminer les filets perineuronal est un exemple de cette dernière approche 42,43.

Un problème majeur lors de l'établissement d'un modèle animal pour SCI est d'obtenir une blessure standardisée. Ceci est un aspect important qui a été abordé dans les modèles SCI multiples, par exemple, transection, hémisection, percuteurs, compression de ballon, écrasement forceps, compression du poids statique, etc. En ce qui concerne les dispositifs impact, les efforts dans ce sens ont abouti à des modèles SCI en rongeurs adultes où plusieurs paramètres de l'impact tels que la vitesse, la force et la durée peuvent être manipulés (examinés par 44). Une autre approche, impliquant moins d' équipement, emploie une modification de l'anévrisme de clip Kerr-Lougheed 45,46. Ces 2 approches sont complémentaires comme l'impacteur imite une blessure contusion alors que les imite clip a des blessures de compression avec un certain degré d'ischémie concurrente. En raison des contraintes de taille importante et une plus grande vulnérabilité des souris néonatales, la mortalité plus élevée associée à des interventions chirurgicales plus longues, ainsi que les coûts de develloppement des équipements à plus petite échelle, il a été choisi pour développer une compression du clip généré plutôt qu'une approche de contusion impacteur généré. Cela a été réalisé par l' adaptation d' un anévrisme mini-pince disponible dans le commerce pour tenir compte de la taille de la colonne vertébrale des souris néonatale 1. L'ajout d'un bouchon assure une largeur de compression normalisé, et aussi longtemps que la tension de la pince se comprime jusqu'à la limite de la butée, la force de compression pendant la phase statique à la largeur minimale devrait peu varier. Ce qui est non normalisé est la vitesse de la compression au cours de sa phase dynamique, étant donné que cela varie selon les variations de tension de clip au cours de sa durée de vie. Comme la phase statique de la compression dure beaucoup plus longtemps que la phase dynamique, et il y a peu de suggérer que le tissu de la moelle épinière exerce beaucoup d'un antagoniste contre les lames mini-clips, il est probable que la gravité des blessures est plus dépendante la phase statique. Ceci, cependant, reste à tester. Blessuregravité est susceptible de dépendre de nombreux facteurs, y compris la force statique de compression et de la durée, la vitesse de compression et de décompression, la position de la mini-pince, et le nombre de compressions réalisées sur le même site. Ainsi, la variation combinatoire de ces paramètres peut entraîner la génération d'un spectre de gravité des blessures de faible à sévère. Malgré le potentiel de la variabilité, dans notre étude publiée précédemment 1 , nous avons obtenu des résultats cohérents à histologique, les niveaux physiologiques et comportementaux, donc il y a peu de suggérer que la normalisation acceptable est difficile à réaliser. Nous notons que dans cette étude , nous avons utilisé plusieurs méthodes de validation à chaque niveau, y compris des tests de comportement tels que l' air pas à pas comme le montre la Figure 5.

Dans ce modèle SCI néonatale la blessure épargne une certaine proportion des axones et fournit une situation favorable pour déclencher la plasticité adaptative par la re-Modelin ainsig de connexions épargnées et la formation de nouveaux circuits. De plus, puisque la souris néonatale est bien adapté aux fins d'enquête par de nombreuses méthodes expérimentales, il est possible d'utiliser ce modèle pour étudier la récupération fonctionnelle et la plasticité adaptative avec une approche intégrative, y compris des tests de comportement, le traçage axonal rétrograde et antérograde, immunohistochimie, électrophysiologie et haute enregistrement optique -throughput 1. A titre d'exemple, nous avons profité de cette approche intégrée pour démontrer réseau re-modélisation au niveau des entrées descendantes spécifiques en utilisant l' imagerie calcique à haut débit dans des préparations ex vivo wholemount du tronc cérébral et de la moelle épinière lésée 1. Cela peut être poussé plus loin en utilisant des outils de neuro-optogenetic et pharmacologie optogenetic pour évaluer le remodelage des connexions synaptiques entre des sous-populations spécifiques de neurones spinaux.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Autorité régionale de la santé du sud-est de la Norvège (JLB, 2014119 ; JCG, numéros de projet 2015045 et 2012065), par le Conseil norvégien de la recherche (JCG, numéro de projet 23 00 00) et l’Université d’Oslo.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringue en plastique (30 ou 50 cm) ml)
Boîte de Pétri en plastique (150 x 25  ; mm)
Vaporisateur d’isoflurane FortecCypraneNous utilisons un ancien appareil hors de production, vérifiez le lien pour le nouvel appareil
Yasargil anévrisme temporaire mini-clip& AElig ; sculapFE681K
Tube en polyéthylène à alésage fin ID 0.58  ; mm, OD 0,96  ; mmSmiths Medical800/100/200
Isoflurane (Forene)Abbott GmbH & Co. KG
Marcain (Bupivacain)AstraZeneca
Insuline seringue 0.3  ; ml 30  ; G x 8  ; mmVWR80086-442
Micro couteau ultra fin 5  ; mm tranchantFine Science Tools10315-12
Pince Graefe extra fine &ndash ; 0.5  ; mm PointeFine Science Tools1153-10Pas vraiment nécessaire, souvent les dents sont trop grandes
Pince SuperGrip StraightFine Science Tools00632-11Deux pinces sont nécessaires
Spongostan Special 70 x 50 x 1  ; mmFerrosan
Vannas Ciseaux à ressort &ndash ; 2  ; mm Lames DroitesOutils Scientifiques Fins15000-03
Vario Clip Pince d’ApplicationAesculapFE502T
Vicryl 6&ndash ; 0 (Ethicon)Johnson and JohnsonJ105G
Porte-micro-aiguille11-510-20
Temgesic (buprénorphine)Schering-Plough
Stesolid (diazépam)ActavisAussi connu sous le nom de Valium
PedamixFresenius Kabi
Klorhexidinsprit (gluconate de chlorhexidine)Fresenius KabiD08A C02
Diethrich

Références

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