ADN électroporation, isolement et d'imagerie de myofibres

Résumé

Ce protocole utilise l’électroporation pour introduire et exprimer des protéines marquées par fluorescence dans les fibres musculaires de souris. Après récupération après électroporation, les fibres sont isolées. Les fibres individuelles sont ensuite imagées à l’aide de la microscopie confocale à haute résolution pour visualiser la structure musculaire.

Résumé

Le muscle mature a une structure unique qui se prête à l’imagerie de cellules vivantes. Nous décrivons ici le protocole expérimental d’expression de protéines marquées par fluorescence dans le muscle fléchisseur des doigts (FDB). Les conditions ont été optimisées pour fournir un grand nombre de myofibres de haute qualité exprimant le plasmide électroporé tout en minimisant les dommages musculaires. La méthode utilise des marqueurs fluorescents sur diverses protéines. La combinaison de cette méthode d’expression avec la microscopie confocale à haute résolution permet l’imagerie de cellules vivantes, y compris l’imagerie après des dommages induits par laser. Les colorants fluorescents combinés à l’imagerie de protéines marquées par fluorescence fournissent des informations sur la structure de base du muscle et sa réponse aux stimuli.

Introduction

Myofibres individuels sont de grandes cellules syncytial, très organisée. Il ya quelques modèles de culture de cellules pour les muscles; Cependant, ces modèles ont comme limitation majeure qu'ils ne différencient pas complètement dans les fibres musculaires matures. Par exemple, les lignées de cellules C2C12 et L6 sont dérivées de souris et les rats, respectivement ^4.1. Dans des conditions de famine de sérum, les cellules mononucléaires "de myoblastes comme« cesser la prolifération, subissent le retrait du cycle cellulaire, et entrent dans le programme myogénique former des cellules multinucléées avec sarcomères, appelées myotubes. Avec des conditions....

Protocole

Les méthodes de cette étude ont été effectuées en conformité avec l'éthique Feinberg School of Medicine de la Northwestern University Institutional Animal Care et l'utilisation Comité (IACUC) des lignes directrices approuvées. Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance.

1. Procédure expérimentale dans électroporation in vivo de la court fléchisseur des orteils (FDB) Muscle Bundle souris

1. Plasmides de conception pour l'expression in vivo en utilisant un promoteur connu pour exprimer dans des cellules de mammifères (par exemple, le cytomégalovirus, CMV) ou dans le muscle (par exemple, ....

Résultats

L'électroporation est une technique peu invasive qui introduit efficacement ADN plasmidique purifié dans le court fléchisseur des orteils (FDB) faisceau musculaire (figure 1A). Sept jours après la transfection par fluorescence protéine marquée est visualisé dans les fibres musculaires isolées (figure 1B). Fibres isolées sont ensuite étalées et préparés pour l'imagerie sur un microscope confocal. Les fibres peuvent être soumises à une lésion indui.......

Discussion

L'utilisation d'électroporation pour étudier les protéines marquées par fluorescence in vivo est idéalement adapté pour l'étude du muscle étant donné l'absence de modèles de lignée cellulaire appropriée qui reproduisent fidèlement la structure de la cellule musculaire entière. Ce protocole décrit l'utilisation de l'électroporation et la microscopie confocale à haute résolution pour fournir une image détaillée de la localisation de la protéine et la translocation après blessure au laser. .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	Life Technologies	11995-073	Milieux de dissection Dilution : 50 ml + 100 g de
collagénase BSA, Type II	Life Technologies	17101-015	Digestion des fibres Dilution : 160 mg / 4 ml DMEM (stock 40 mg/ml aliquote)
Falcon Boîtes à 12 puits	Fisher Scientific	877229	Fiber
Digestion Ringers Solution			Digestion et imagerie des fibres Dilution : 146 mM NaCl 5 mM  ;   ; KCl 2 mM  ;   ; CaCl2 1 mM  ;   ; MCl2 10 mM HEPES pH7.4 in H2O
1 ml Pipettes	Axygen	T-1000-C-R	Digestion
Lames de rasoir	Personna	94-120-71	Digestion
Precision Glide 30 G Aiguille	BD Biosciences	305128	Dissection
1x PBS (-/-)	Life Technologies	14190-250	Dissection
Sylgard 184	Fisher Scientific	50-366-794	dissection
	FST by Dumont	#5/45	dissection
	Roboz	RS-4913
Ciseaux de	World Precision Instruments	500260	Dissection
BSA	Sigma	A7906	Média de dissection Dilution : 100 mg/50 ml DMEM
Falcon Boîtes de 60 mm	Fisher Scientific	08772B	Dissection - utilisé pour tenir le
d’électroporation	d’argile
.	Herbe	s88x
Pinces d’électroporation Radio	Shack	270-356	Électroporation
Triadine	Aplicare	82-220	Électroporation
Precision Glide 27 G aiguille	BD Biosciences	305136	d’électroporation
	Herbe	SIU-V	Gaze d’électroporation
	Covidien	2146	électroporation
Hyaluronidase	Sigma	H4272	Injection Dilution : Ajouter 160 ul PBS (1x) à 40 µ ; l 5x
stock 1 cc U-100 Seringue à insuline (28G1/2)  ;	BD Biosciences	329420	Injection
Eppendorf Tubes	Fisher Scientific	02-682-550	Injection
35 mm fond en verre Antenne micropuits	MaTek	P35G-1.5-14-C	Microscopie
FM 4-64	Life Technologies	T-13320	Microscopie Dilution : Finale 2,5 ug/ml
FM 1-43	Life Technologies	T-35356	Microscopie< br/> Dilution : Finale 2,5 ug/ml
Plasmide sans endotoxine Maxi Kit	Qiagen	12362	Purification du plasmide

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