Ce protocole utilise l’électroporation pour introduire et exprimer des protéines marquées par fluorescence dans les fibres musculaires de souris. Après récupération après électroporation, les fibres sont isolées. Les fibres individuelles sont ensuite imagées à l’aide de la microscopie confocale à haute résolution pour visualiser la structure musculaire.
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Article de méthode
ADN électroporation, isolement et d'imagerie de myofibres
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le muscle mature a une structure unique qui se prête à l’imagerie de cellules vivantes. Nous décrivons ici le protocole expérimental d’expression de protéines marquées par fluorescence dans le muscle fléchisseur des doigts (FDB). Les conditions ont été optimisées pour fournir un grand nombre de myofibres de haute qualité exprimant le plasmide électroporé tout en minimisant les dommages musculaires. La méthode utilise des marqueurs fluorescents sur diverses protéines. La combinaison de cette méthode d’expression avec la microscopie confocale à haute résolution permet l’imagerie de cellules vivantes, y compris l’imagerie après des dommages induits par laser. Les colorants fluorescents combinés à l’imagerie de protéines marquées par fluorescence fournissent des informations sur la structure de base du muscle et sa réponse aux stimuli.
Introduction
Myofibres individuels sont de grandes cellules syncytial, très organisée. Il ya quelques modèles de culture de cellules pour les muscles; Cependant, ces modèles ont comme limitation majeure qu'ils ne différencient pas complètement dans les fibres musculaires matures. Par exemple, les lignées de cellules C2C12 et L6 sont dérivées de souris et les rats, respectivement 4.1. Dans des conditions de famine de sérum, les cellules mononucléaires "de myoblastes comme« cesser la prolifération, subissent le retrait du cycle cellulaire, et entrent dans le programme myogénique former des cellules multinucléées avec sarcomères, appelées myotubes. Avec des conditions de culture prolongées, myotubes peuvent présenter des propriétés contractiles et "contraction" dans la culture. Lignées cellulaires humaines ont désormais été mis en place 5. En plus de ces lignées cellulaires immortalisées, myoblastes mononucléées peuvent être isolées de muscle et dans les conditions d'inanition de sérum semblables formera myotubes. Ces lignées cellulaires et des cultures primaires de myoblastes sont hautement utiliserful car elles peuvent être transfectées avec des plasmides ou des virus et transduites utilisés pour étudier des processus biologiques cellulaires de base. Cependant, ces cellules, même lorsque induite pour former des myotubes, manquent beaucoup des traits saillants de l'organisation musculaire mature. Plus précisément, les myotubes sont beaucoup plus petits que les fibres musculaires matures individuelles et manquent de la forme normale de fibres musculaires. Critique, myotubes manquent transversales (T-) tubules, le réseau membraneuse requis pour la libération de Ca efficace tout au long du myoplasme.
Une autre méthode pour myoblastes primaires ou lignées de cellules myogéniques consiste à utiliser myofibres matures. La transgénèse peut être utilisé pour établir l'expression de protéines marquées, mais cette méthode est coûteuse et prend du temps. In vivo électroporation de muscle de souris a émergé comme une méthode préférée pour sa vitesse et la fiabilité 6-10.
Méthodes pour électroporation in vivo et l'isolement efficace des myofibres haavez été optimisé pour le fléchisseur de la souris des orteils (FDB) 6 musculaire. Les procédés peuvent être effectués facilement et sont minimalement invasive pour induire l'expression in vivo à partir de plasmides. Cette approche est maintenant combinée à des méthodes d'imagerie à haute résolution, y compris l'imagerie après rupture de laser de la 6,7 sarcolemme. La combinaison de colorants fluorescents et de l'expression des protéines marquées par fluorescence de peut être utilisé pour surveiller des processus biologiques cellulaires en myofibres matures.
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Protocole
Les méthodes de cette étude ont été effectuées en conformité avec l'éthique Feinberg School of Medicine de la Northwestern University Institutional Animal Care et l'utilisation Comité (IACUC) des lignes directrices approuvées. Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance.
1. Procédure expérimentale dans électroporation in vivo de la court fléchisseur des orteils (FDB) Muscle Bundle souris
- Plasmides de conception pour l'expression in vivo en utilisant un promoteur connu pour exprimer dans des cellules de mammifères (par exemple, le cytomégalovirus, CMV) ou dans le muscle (par exemple, Muscle Créatine kinase, MCK) 6,7. Grandes plasmides peuvent exprimer à des niveaux inférieurs. Le promoteur de CMV a été largement utilisé 6,7.
- Purifier plasmides de E. coli en utilisant endotoxines conditions gratuits par les instructions du fabricant. Dissoudre le plasmide dans un tampon stérile, d'endotoxine TE à 2 - 5 ug de plasmide / ul.
- Diluer et aliquoter le plasmide à une Concentration de 20 ug d'ADN dans 10 ul de TE endotoxine libre stérile (2 ug / ul) dans du tampon par injection d'un tube de microcentrifugation stérile. Préparer une aliquote par injection.
- Diluer le stock de hyaluronidase à 1x au phosphate solution saline stérile tamponnée sans calcium et le magnésium (PBS - / -) donnant une concentration finale de 8 unités. Aliquote de 10 pi de hyaluronidase dilué par injection dans un tube à centrifuger stérile.
- Anesthésier la souris en utilisant 2,5% d'isoflurane jusqu'au sous sédation et ne répond pas à la queue ou de l'orteil pincement. Placer l'animal dans une position couchée sur le dos sur un coussin chauffant ou une table de chauffage pour maintenir la température normale du corps.
- Nettoyer le coussinet plantaire de la souris avec une application alternée d'un gommage povidone iode et de l'alcool trois fois en utilisant une technique de préparation en provenance de l'emplacement d'aiguille et rayonnant vers l'extérieur. Cette technique maintient le site de l'aiguille à l'état aseptique, minimisant introduction d'agents pathogènes.
- Injecter le coussinet plantaire de ee souris avec 10 ul de la solution de hyaluronidase 1x (2 mg / ml = 8 unités) entre la peau et le muscle en utilisant une seringue stérile de 1 ml. Hyaluronidase digère les composants de la matrice extracellulaire pour permettre l'entrée plus efficace des myofibres dans le plasmide. Entrée à la base du talon et de faire avancer l'aiguille vers les orteils. Relâchez lentement le liquide que l'aiguille est rétracté. Le site d'injection sous la peau va étendre et commencer à virer au rose.
- Répétez les étapes 1.6 et 1.7 sur le pied controlatéral.
- Débranchez l'anesthésie et placez la souris de retour dans la cage. Laisser la souris pour se remettre complètement de l'anesthésie.
- Attendre 2 heures.
- Répétez les procédures de stérilisation anesthésier et de pied, les étapes 1.5 et 1.6.
- Injecter l'ADN de plasmide dilué dans le coussinet plantaire de la même façon que la hyaluronidase. Assurez-vous que le volume maximum est de 20 pi ou moins. Pour l'expression plasmidique double injecter 20 pg de chaque plasmide avec un volume maximum de 20 &# 181; l ou moins.
- Répéter l'injection de plasmide sur la patte controlatérale ou utiliser le pied controlatéral pour les injections de contrôle.
- Sur le pied qui a été initialement injecté, soulever la peau loin du muscle soulignant avec des pinces fines et placez une aiguille 27 G à travers les boules de peau près les orteils dans une position perpendiculaire à la ligne de guérir-orteil du pied. Prenez une seconde aiguille stérile 27 G et le placer horizontalement à travers la peau au niveau du talon. La place aiguilles parallèles entre elles ~ 1 cm.
- En utilisant des pinces crocodiles, des électrodes de serrage aux aiguilles parallèles assurant que les aiguilles ne sont pas en contact les uns des autres. L'utilisation de la pâte à modeler peut fixer les pinces en place.
- Connectez électrodes à un stimulateur électrique.
- Électroporer le muscle en appliquant 20 impulsions, 20 ms dans la durée / chacune, à 1 Hz, à 100 V / cm. Les orteils peuvent se contracter avec une stimulation.
- Répétez la procédure de stimulation sur le pied controlatéral si nécessaire.
- Retirer aiguilles. Essuyez le coussinet plantaire avec gommage povidone iodée.
- Éteignez l'anesthésie. Retour de la souris à la cage de récupération et de l'activité de moniteur. Si la procédure a été menée comme prévu, l'animal devrait reprendre la marche normale dans les 30 minutes et présentent pas de différence dans le niveau de la marche ou de l'activité d'un comportement pré-injection. Par conséquent, aucune analgésiques post-procédure sont nécessaires. Lors de la récupération, le réexpédier vers le vivarium.
Note: L'expression des protéines peut être testée dès l'âge de 48 heures après l'électroporation. Toutefois, pour permettre la récupération plus complète après l'électroporation, nous préférons l'isolement et l'étude des myofibres 7 - 14 jours après l'électroporation 10. L'expression peut être dosée aussi longtemps que 4 semaines après l'électroporation.
2. Procédure expérimentale pour l'isolement du court fléchisseur des orteils (FDB) des fibres
- Collagénase dégel. Pour chaque faisceau FDB préparer deux puits dans une plaque de culture de tissu à 12 puits. Dans une bien ajouter 1 ml de préchauffé Eagles modifié milieu de Dulbecco, plus sérum-albumine bovine (DMEM + BSA) et dans l'autre et ajouter 1 ml de solution de Ringer préchauffé. En outre, ajouter des frais 10 ml de solution de Ringer 1x à 35 mm plat Sylgard.
- Sacrifier l'animal par CO 2 ou un anesthésique par inhalation de gaz, suivie par dislocation cervicale ou une autre méthode pour garantir la mort.
- Retirez les pieds postérieurs au-dessus de la cheville en utilisant une lame de rasoir propre et plonger dans une solution de Ringer 1x dans les 35 mm plat Sylgard.
- Pin un pied serré, seule vers le haut, sur le plat Sylgard avec 30 g d'aiguilles à travers chacune des 5 conseils d'orteil et à la cheville.
- À partir de la cheville, couper la peau vers le haut le côté du pied le long de la racine des cheveux vers les orteils, attention à ne pas entailler le muscle sous la peau. Répétez de l'autre côté du pied.
- Tenue de la peau à la base de la cheville avec une pince fine, couper la peau à travers le talon.
- Lifting de la peaubattre avec des pinces, des ciseaux pointer vos vers la peau pour ne pas entailler le muscle. Snip le tissu conjonctif sous-jacent, éliminant efficacement la peau.
- Pour retirer le faisceau musculaire FDB a coupé le gros tendon au talon pour libérer le tendon de l'os. En tenant le tendon avec une pince, disséquer le faisceau FDB du gros tendon blanc enlevant soigneusement toute tissu conjonctif attaché à la FDB avec des ciseaux. Si fait correctement le faisceau facilement soulever des tendons sous-jacents révélant tendons blancs lumineux menant aux chiffres individuels. Couper le FDB les tendons près des orteils libérer le faisceau du pied.
- Placer l'ensemble du faisceau de muscle dans le puits contenant du milieu DMEM + BSA.
- Répétez sur le pied controlatéral.
- Une fois tous les muscles FDB sont isolés, ajouter 100 pi de la collagénase à chaque puits contenant DMEM + BSA et les muscles.
- Vérifier le succès de l'électroporation sur un microscope à fluorescence inversée avant la digestion. Si properl faity, vers le haut de 90% l'efficacité de transfection peuvent être atteints.
- Incuber la plaque à une humidifié, 37 ° C incubateur à 10% de CO 2 pendant environ 1 heure. Le temps d'incubation peut varier selon le modèle de la maladie et le fond et le sort de la collagénase.
- Après 1 h, transférer soigneusement le faisceau FDB à la solution ainsi contenant uniquement Ringers.
- Triturer le faisceau FDB dans le puits avec la solution de Ringer en utilisant une pipette de 1 ml. Coupez l'extrémité de la pointe de la pipette avec une lame de rasoir propre tels que le faisceau peut facilement passer à travers la pointe de la pipette. Triturer délicatement le muscle (~ 15 fois) permettant le faisceau de passer haut et en bas parallèlement à la pointe. Fibres intactes vont tomber dans la solution de Ringer. Lorsque les fibres ne tombent pas facilement le faisceau, placez le muscle du dos dans une solution de collagénase.
- Plaque fibres isolées sur le plat ~ 500 pi par plaque.
- Laisser le muscle à digérer dans le puits pendant 15 min.
- Répétez les étapes 2.15de 2,17 jusqu'à ce que le faisceau diminue en taille et la majorité des fibres sont dissociées à partir du faisceau (généralement un total de 2 à 3 fois). Une fois dissocié le muscle passe facilement à travers une pipette de 1 ml.
- Laissez fibres fixer à la boîte pour un minimum de 15 min. Solution de Ringer frais peut être ajouté à la plaque pour diluer la collagénase résiduel ou modifiée en fonction de contraintes de temps.
Remarque: Les fibres sont maintenant prêts pour l'imagerie.
3. Procédure expérimentale pour la visualisation de la membrane induite par laser Dommages utilisant la microscopie confocale
- Fibres de charge immédiatement avant l'imagerie avec 300 pi de 2,5 um FM 1-43 de FM 4-64 colorant dans une solution de Ringer. En général, les fibres d'image 15 min à 2 h après l'isolement. Cependant, les fibres peuvent être visualisés à l'isolement après 24 h.
- Placer le plat de fond de verre sur un microscope confocal équipé d'un laser UV et un objectif 60X / 63X.
- Localiser une fibre. Assurez-vous la fibre est fermement attachéau plat en tapant sur la base du microscope. Exclure les fibres qui ont été endommagés dans le processus de dissociation. Fibres endommagées peuvent contenir des vésicules membranaires, des niveaux élevés assimilation de colorant FM, boucle ou plier intensément.
- Pour induire des lésions de la membrane sur la fibre, positionner le sarcolemme dans le centre de la fenêtre d'imagerie avec un champ libre de noyaux. Focus sur le sarcolemme en utilisant le canal de colorant FM tels que le sarcolemme est extrêmement forte.
- Placez les cheveux ROI de croix sur le sarcolemme utilisant le canal FM 4-64.
- Irradier un point à 80% de puissance de 1 pixel pour 3 sec (~ 350 nm x 350 nm zone). Colorant FM sera entrer dans la cellule à l'endroit de la blessure. Puissance et le temps peuvent être ajustés pour augmenter ou diminuer la zone de l'insulte.
- Capturez des images de la fibre avant que des dommages, au moment de dommages, tous les après-dommages 2 secondes, puis toutes les 10 secondes pour un maximum de 5 min. Timing peut être ajustée en fonction des besoins. Les images individuelles peuvent être convertis en films time-lapse dans J. Image
- Répétez les étapes3.3 à 3.7 sur un maximum de 3 fibres par boîte.
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Résultats
L'électroporation est une technique peu invasive qui introduit efficacement ADN plasmidique purifié dans le court fléchisseur des orteils (FDB) faisceau musculaire (figure 1A). Sept jours après la transfection par fluorescence protéine marquée est visualisé dans les fibres musculaires isolées (figure 1B). Fibres isolées sont ensuite étalées et préparés pour l'imagerie sur un microscope confocal. Les fibres peuvent être soumises à une lésion indui...
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Discussion
L'utilisation d'électroporation pour étudier les protéines marquées par fluorescence in vivo est idéalement adapté pour l'étude du muscle étant donné l'absence de modèles de lignée cellulaire appropriée qui reproduisent fidèlement la structure de la cellule musculaire entière. Ce protocole décrit l'utilisation de l'électroporation et la microscopie confocale à haute résolution pour fournir une image détaillée de la localisation de la protéine et la translocation après blessure au laser. ...
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Déclarations de divulgation
Il n'y a pas de conflits d'intérêts.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la Santé accorde NS047726, NS072027 et AR052646.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | Milieux de dissection Dilution : 50 ml + 100 g de |
| collagénase BSA, Type II | Life Technologies | 17101-015 | Digestion des fibres Dilution : 160 mg / 4 ml DMEM (stock 40 mg/ml aliquote) |
| Falcon Boîtes à 12 puits | Fisher Scientific | 877229 | Fiber |
| Digestion Ringers Solution | Digestion et imagerie des fibres Dilution : 146 mM NaCl 5 mM ; ; KCl 2 mM ; ; CaCl2 1 mM ; ; MCl2 10 mM HEPES pH7.4 in H2O | ||
| 1 ml Pipettes | Axygen | T-1000-C-R | Digestion |
| Lames de rasoir | Personna | 94-120-71 | Digestion |
| Precision Glide 30 G Aiguille | BD Biosciences | 305128 | Dissection |
| 1x PBS (-/-) | Life Technologies | 14190-250 | Dissection |
| Sylgard 184 | Fisher Scientific | 50-366-794 | dissection |
| FST by Dumont | #5/45 | dissection | |
| Roboz | RS-4913 | ||
| Ciseaux de | World Precision Instruments | 500260 | Dissection |
| BSA | Sigma | A7906 | Média de dissection Dilution : 100 mg/50 ml DMEM |
| Falcon Boîtes de 60 mm | Fisher Scientific | 08772B | Dissection - utilisé pour tenir le |
| d’électroporation | d’argile | ||
| . | Herbe | s88x | |
| Pinces d’électroporation Radio | Shack | 270-356 | Électroporation |
| Triadine | Aplicare | 82-220 | Électroporation |
| Precision Glide 27 G aiguille | BD Biosciences | 305136 | d’électroporation |
| Herbe | SIU-V | Gaze d’électroporation | |
| Covidien | 2146 | électroporation | |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Injection Dilution : Ajouter 160 ul PBS (1x) à 40 µ ; l 5x |
| stock 1 cc U-100 Seringue à insuline (28G1/2) ; | BD Biosciences | 329420 | Injection |
| Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | Injection |
| 35 mm fond en verre Antenne micropuits | MaTek | P35G-1.5-14-C | Microscopie |
| FM 4-64 | Life Technologies | T-13320 | Microscopie Dilution : Finale 2,5 ug/ml |
| FM 1-43 | Life Technologies | T-35356 | Microscopie< br/> Dilution : Finale 2,5 ug/ml |
| Plasmide sans endotoxine Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Purification du plasmide |
Références
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Réimpressions et autorisations
